熊康平，彭天辰，熊垚祎，肖 宇，鞠林高，王 剛，王行環(huán)

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430071)

膀胱癌是世界上第10大常見(jiàn)癌癥，2018年有近20萬(wàn)人死于膀胱癌，占所有癌癥死亡人數(shù)的2.1%[1]。我們急需尋找新的更高效的膀胱癌治療藥物。腫瘤代謝重編程中腫瘤細(xì)胞能改變其新陳代謝方式，課題組前期運(yùn)用膀胱癌組織及正常膀胱上皮組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)脂類代謝與膀胱癌關(guān)系密切[2]。膽固醇平衡紊亂是許多疾病如癌癥的發(fā)病基礎(chǔ)[3-4]。此外，更有報(bào)道稱細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成與膀胱癌化療耐藥相關(guān)[5]。辛伐他汀能通過(guò)抑制羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶來(lái)抑制內(nèi)源性膽固醇的合成，從而降低血膽固醇水平。課題組前期使用辛伐他汀來(lái)抑制膽固醇的合成，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀能有效抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖與遷移，并誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞在G0/G1期阻滯[6]。除抑制內(nèi)生合成外，外源吸收的減少也能降低血膽固醇水平。依澤麥布(Ezetimibe)能抑制外源膽固醇的吸收，被用于高膽固醇血癥的治療。有研究認(rèn)為，依澤麥布與辛伐他汀的合用在降低血膽固醇的同時(shí)增加了癌癥的患病率[7]，也有研究稱不能證明依澤麥布會(huì)對(duì)癌癥發(fā)生率產(chǎn)生不利影響[8-9]。甚至一些研究發(fā)現(xiàn)依澤麥布能有效抑制腫瘤的發(fā)展[10]。本研究采用兩種細(xì)胞系，探究依澤麥布對(duì)T24和5637細(xì)胞增殖、遷移的抑制及其原理。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞系T24和5637來(lái)自于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞系均經(jīng)由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心認(rèn)證。T24和5637置于含5%CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，使用含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清(Gibco，中國(guó))，1%(體積分?jǐn)?shù))的青霉素與鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco，中國(guó))培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用噻唑蘭(MTT)法進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。首先，向96孔板中的每個(gè)孔中加入100 μL含有3 000個(gè)膀胱癌細(xì)胞的RPMI-1640培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；再用不同濃度的依澤麥布(0、5、10、20、40、60、80、100 mmol/L)分別處理48 h；然后，向每孔中添加20 μL (5 mg/mL)MTT，于細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，4 h后移去孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO以溶解藍(lán)紫色甲瓚沉淀。最后用酶標(biāo)儀 (Cat.#Spectra Max M2，Molecular Devices，USA)在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)量其吸光度值(A)，結(jié)果以相對(duì)細(xì)胞增殖率顯示，相對(duì)細(xì)胞增殖率=A(經(jīng)依澤麥布處理組)/A(未經(jīng)依澤麥布處理組)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)設(shè)置不添加依澤麥布的對(duì)照組，加入低濃度依澤麥布(20 mmol/L)與高濃度依澤麥布(40 mmol/L)的實(shí)驗(yàn)組。T24和5637膀胱癌細(xì)胞接種于6孔板中，待其長(zhǎng)滿后，用無(wú)菌槍頭刮一平整筆直的劃痕，并標(biāo)記一固定位點(diǎn)，用PBS沖洗后，于6孔板中加入不同濃度的依澤麥布(0、20、40 mmol/L)，分別于0 h和24 h，用相差顯微鏡在標(biāo)記位點(diǎn)拍照，計(jì)算其遷移率后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。遷移率=24 h后細(xì)胞邊緣移動(dòng)距離/初始細(xì)胞邊緣距離，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞周期測(cè)定T24和5637細(xì)胞在含有不同濃度依澤麥布(0、20、40 mmol/L)的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)48 h，胰酶消化后離心收集。用含有碘化丙啶和破膜劑的1xDNA染色劑(Multi sciences，China)重懸細(xì)胞，于黑暗環(huán)境中37 ℃培育30 min。用流式細(xì)胞儀 (Beckman，Cat.#FC500)分析其各組細(xì)胞周期分布狀況。每次分析1×105個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 蛋白質(zhì)分離與免疫印跡分析胰酶消化經(jīng)不同濃度依澤麥布(0、20、40 mmol/L)處理的膀胱癌細(xì)胞后，離心收集，于冰上加入含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液(Sigma-Aldrich，USA)裂解細(xì)胞30 min。以12 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集上清液，并加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱變性10 min，于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｓ?.5%～12.5%SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行變性與分離蛋白，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore，USA)，再以5%脫脂牛奶(BD Biosciences，USA)封閉1 h，與一抗孵育過(guò)夜，TBST洗膜，再與二抗孵育2 h。條帶使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒顯示(Bio-Rad，USA)，由分子成像儀Chemi Doc XRS +成像系統(tǒng)顯影記錄。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有的實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次，采用單因素方差分析(ANOVA)和雙尾Student’st檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估各個(gè)亞組間是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 依澤麥布抑制膀胱癌細(xì)胞增殖T24和5637經(jīng)過(guò)不同濃度依澤麥布(0、5、10、20、40、60、80、100 mmol/L)處理48 h后，細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，并且呈現(xiàn)出濃度依賴性(P<0.05，圖1)。

圖1 依澤麥布對(duì)細(xì)胞增殖的影響

2.2 依澤麥布抑制膀胱癌細(xì)胞遷移應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)在不同濃度依澤麥布(0、20、40 mmol/L)處理2種膀胱癌細(xì)胞24 h后，測(cè)量其遷移率，發(fā)現(xiàn)兩種濃度的藥物均能顯著抑制細(xì)胞的遷移能力，高濃度的依澤麥布對(duì)其遷移率影響更大(P<0.05，圖2)。

2.3 依澤麥布影響膀胱癌細(xì)胞周期通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)依澤麥布能影響膀胱癌細(xì)胞的周期分布，結(jié)果顯示高濃度依澤麥布(40 mmol/L)使T24和5637的細(xì)胞周期在 G0/G1被顯著阻滯，而在低濃度時(shí)(20 mmol/L)，與對(duì)照組相比，也可誘導(dǎo)細(xì)胞周期在G0/G1期被阻滯(P<0.05，圖3)。

2.4 依澤麥布影響膀胱癌細(xì)胞表型相關(guān)蛋白表達(dá)水平用Western blot分析參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程與細(xì)胞G0/G1周期相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括β-連接素(β-catenin)、波形蛋白(vimentin)、CDK2、CDK4，WB結(jié)果顯示兩種膀胱癌細(xì)胞系在低、高濃度的依澤麥布組中的CDK2、CDK4、β-catenin及vimentin的表達(dá)均呈劑量依賴性下降(P<0.05，圖4)。

A、C：不同濃度依折麥布處理5637、T24細(xì)胞的傷口愈合實(shí)驗(yàn);B、D：不同濃度依折麥布處理5637、T24細(xì)胞后遷移率統(tǒng)計(jì)；**P<0.01，*P<0.05

A：流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期；B：依折麥布處理5637、T24細(xì)胞后G0/G1期、S期、G2/M占比分析，*P<0.05。圖3 依澤麥布對(duì)細(xì)胞周期的影響

圖4 依澤麥布對(duì)細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

流行病學(xué)報(bào)道稱，高膽固醇飲食與包括膀胱癌在內(nèi)的多種癌癥有關(guān)，會(huì)提高多種癌癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[11]。依澤麥布作為降低血膽固醇水平的藥物被使用。有生物學(xué)家與臨床醫(yī)生擔(dān)心其是否會(huì)導(dǎo)致癌癥的發(fā)病率升高。與擔(dān)憂相反，有報(bào)道稱依澤麥布能抑制腫瘤血管的生成[10]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，依澤麥布能有效抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖與遷移，并阻滯其細(xì)胞周期在G0/G1期。

通過(guò)MTT法發(fā)現(xiàn)對(duì)兩種膀胱癌細(xì)胞系使用不同濃度依澤麥布處理48 h，能抑制其增殖，且呈劑量依賴性。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果也顯示依澤麥布使細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，參與G0/G1期調(diào)控的蛋白(CDK4、CDK6)在藥物的處理下，其蛋白豐度也有不同程度的下降。CDK4/6是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)控因子[12]。而CDK4/6表達(dá)下降將阻礙細(xì)胞周期進(jìn)入S期，從而使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，最終影響細(xì)胞增殖。由此我們推論，依澤麥布能阻滯膀胱癌細(xì)胞周期在G0/G1期，從而抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖。

依澤麥布可能通過(guò)抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)來(lái)抑制細(xì)胞的遷移能力。劃痕實(shí)驗(yàn)提示依澤麥布能抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移，免疫印跡分析的結(jié)果也證實(shí)依澤麥布下調(diào)了EMT相關(guān)蛋白β-catenin及Vimentin的表達(dá)。EMT過(guò)程與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，近年來(lái)，波形蛋白被認(rèn)為是EMT的標(biāo)記物[13]，波形蛋白也可作為早期診斷膀胱移行細(xì)胞癌的重要指標(biāo)。β-catenin是細(xì)胞粘附連接不可或缺的結(jié)構(gòu)成分，在癌癥進(jìn)展相關(guān)的轉(zhuǎn)變中，β-catenin的激活可以通過(guò)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄對(duì)EMT進(jìn)展產(chǎn)生影響[14]?？梢?jiàn)，依澤麥布可能是通過(guò)影響EMT來(lái)抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移能力的。

綜上所述，依澤麥布能有效遏制膀胱癌細(xì)胞的增殖與遷移，阻滯其細(xì)胞周期在G0/G1期，可能成為一種新型的膀胱癌治療藥物。