陳旭艷，王青青，伊 雪，張 熠，陳永銓，范 薇，黃金梅，陳 金，董志高，肖萍萍

(1.廈門醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院血液風濕免疫科，福建 廈門 361021 2.廈門醫(yī)學院基礎醫(yī)學部，福建 廈門 361023)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是以關節(jié)疼痛、變形及周圍軟組織腫脹為特點的全身自身免疫性疾病，早期病理改變?yōu)榛ぱ仔苑磻?，大約50%可出現(xiàn)關節(jié)外表現(xiàn)，如類風濕結節(jié)、血管炎、心包炎和肺部改變等，間質性肺病(interstitial lung disease，ILD)是RA累及肺部最常見的病變[1]。ILD作為一種肺間質的急慢性非特異性炎癥，病因復雜，發(fā)病機制尚不明確，早期表現(xiàn)為肺泡炎，隨著持續(xù)的炎癥損傷和修復，晚期逐漸進展為彌漫性肺間質纖維化，最后病人進展為呼吸衰竭，該病預后差，死亡率高[2]。ILD在RA患者發(fā)病率高達30%，而出現(xiàn)臨床表現(xiàn)僅有5%～10%，且ILD早期癥狀并不典型，容易漏診。晚期出現(xiàn)肺纖維化后預后極差，病死率甚至高達10%～20%[3]。研究證實，RA是屬于Th1型疾病[4]。且近年多項研究表明，多種炎癥細胞和細胞因子相互作用形成的復雜網(wǎng)絡促進了類風濕關節(jié)炎合并間質性肺病(RA-ILD)的發(fā)生和發(fā)展，尤其是輔助性T細胞Th1/Th2失衡、T細胞亞群、NKT細胞與這類疾病的關系成為研究的熱點，這為臨床RA-ILD的治療提供了新希望[5,6]。有研究直接提出Th1型細胞因子IFN-γ很有可能與RA-ILD的發(fā)病機制有關[7]。RA-ILD與類風濕因子(RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(CCP-Ab)、抗角蛋白抗體(AKA)、免疫球蛋白(Ig)、補體C3和C4、血小板計數(shù)(PLT)及T淋巴細胞亞群間具有相關性，但研究較少，目前尚不能得出統(tǒng)一結論。研究表明TNF-α拮抗劑能有效緩解RA病情，減輕炎癥及關節(jié)破壞，阿達木單抗及戈利木單抗都是屬于全人源化抗TNF-α單克隆抗體，與TNF-α結合，降低其生物活性，進而控制疾病進展[8]。另外，TNF-α參與肺間質纖維化，所以我們猜想抑制TNF-α可能對抑制肺間質纖維化有一定的作用。RA-ILD的發(fā)病機制尚未完全明確，且RA-ILD目前傳統(tǒng)免疫抑制治療效果欠佳，目前國內外尚缺乏TNF-α拮抗劑聯(lián)合激素及環(huán)磷酰胺治療RA-ILD的研究。因此，本研究旨在探究TNF-α拮抗劑聯(lián)合激素及環(huán)磷酰胺治療RA-ILD的效果，為提高傳統(tǒng)免疫抑制劑的治療效果提供新的方向。

1 對象與方法

1.1研究對象:收集了廈門醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院門診和住院治療的單純類風濕關節(jié)炎患者58例(命名為RA-NILD組)、合并間質性肺病的類風濕關節(jié)炎患者30例(命名為RA-ILD組)。RA-NILD組男性15例，女性43例，年齡范圍25～84歲，平均年齡57.35±14.21歲。RA-ILD組男性8例，女性22例，年齡范圍30～83歲，平均年齡60.13±13.46歲。納入標準:①RA的診斷均符合2009年美國風濕病協(xié)會(ACR)修訂的RA診斷標準;②間質性肺疾病的診斷均符合2000年美國胸科協(xié)會/歐洲呼吸協(xié)會(ATS/ERS)提出的診斷標準，所有人選患者均為初次診斷RA-ILD，停用糖皮質激素及免疫抑制劑半年以上，無生物制劑的使用史。③所有患者均知情并同意本次研究。排除合并其他肺疾病的患者，如肺部感染、肺結核、慢性阻塞性肺部疾病、支氣管擴張、肺部腫瘤、塵肺、吸入性有機物引起的肺間質疾??；排除存在心功能不全和其他結締組織疾病的患者。

1.2檢測方法:治療前采集患者空腹靜脈血10mL，采用魏氏法檢測紅細胞沉降率(ESR)。通過離心分離出血清，檢測血清中C3、C4、CCP-Ab、CRP、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-12、IL-13、IL-17、KL-6、MCP-1、RF、TGF-β和TNF-α的含量。如表1所示，按照商家說明書采用相應的試劑盒檢測相應的指標。

表1 試劑信息

1.3治療分組:將RA-ILD隨機分為兩組，THC組和HC組。THC組的患者皮下注射阿達木單抗(Vetter Pharma-Fertigung Gmbh & Co.KG，88212 拉芬斯堡，德國)40mg/次，半個月一次或戈利木單抗(Baxter Pharmaceutical Solutions LLC，布盧明頓，印第安納州47403，美國)50mg/次，每月一次；靜脈注射環(huán)磷酰胺0.4g/次，每兩周一次；口服潑尼松5-10mg/次，每天一次。HC組的患者靜脈注射環(huán)磷酰胺0.4g/次，每兩周一次；口服潑尼松5-10mg/次，每天一次。治療24周后，采集患者的空腹靜脈血10mL，按以上描述檢測TGF-β、TNF-α、CCP-Ab、IL-2、IL-17、KL-6和MCP-1的含量，統(tǒng)計這些指標的轉陰率。陰性判斷標準：CCP-Ab<20U/mL，TNF-α<4.6μg/L，IL-17<20.6pg/mL，MCP-1<108pg/mL，KL-6<500U/mL，IL-2<5.71pg/mL，985.5pg/mL

1.4統(tǒng)計學分析:應用SAS9.2進行統(tǒng)計學分析，差異性比較利用配對非參數(shù)檢驗進行。

2 結 果

2.1RA-ILD患者血清中TGF-β、TNF-α、CCP-Ab、IL-2、IL-17、KL-6和MCP-1的含量更高。為了探究RA-NILD與RA-ILD之間細胞因子表達的差異，治療前，我們比較了兩組患者血清中C3、C4、CCP-Ab、CRP、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-12、IL-13、IL-17、KL-6、MCP-1、RF、TGF-β和TNF-α的含量。結果顯示，與RA-NILD組相比，RA-ILD組的TGF-β、TNF-α、CCP-Ab、IL-2、IL-17、KL-6和MCP-1的含量明顯更高(見圖1。細胞因子包括：ESR(A圖)、C4(B圖)，CCP-Ab(C圖)，CRP(D圖)，C3(E圖)，IFN-γ(F圖)，IL-2(G圖)，IL-4(H圖)，IL-12(I圖)，IL-13(J圖)，IL-17(K圖)，KL-6(L圖)，RF(M圖)，MCP-1(N圖)，TGF-β(O圖)和TNF-α(P圖))。所以，后續(xù)實驗中，我們選擇檢測血清中TGF-β、TNF-α、CCP-Ab、IL-2、IL-17、KL-6和MCP-1的含量。

圖1 治療前RA-NILD和RA-ILD患者的ESR(A圖)和血清細胞因子(B-P圖)水平比較

2.2TNF-α拮抗劑能顯著優(yōu)化激素+環(huán)磷酰胺的治療效果:為了探究TNF-α拮抗劑對RA-ILD的治療效果，我們將RA-ILD患者分為兩組：生物制劑組(THC組)和免疫抑制劑組(HC組)。治療前，兩組的TGF-β、TNF-α、CCP-Ab、IL-2、IL-17、KL-6和MCP-1含量差異不顯著(見圖2。細胞因子包括：CCP-Ab(A圖)、IL-2(B圖)、IL-17(C圖)、KL-6(D圖)、MCP-1(E圖)、TGF-β(F圖)、TNF-α(G圖))。生物制劑組給予TNF-α拮抗劑(阿達木單抗或戈利木單抗)、激素和環(huán)磷酰胺進行治療，免疫抑制劑組給予激素和環(huán)磷酰胺進行治療，結果顯示，生物制劑組的TGF-β、TNF-α、CCP-Ab、IL-2、IL-17、KL-6和MCP-1的轉陰率明顯高于免疫抑制劑組(見圖2H)。這些結果揭示TNF-α拮抗劑能顯著優(yōu)化激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺的治療效果。

圖2 治療前THC組和HC組RA-ILD患者的血清細胞因子水平比較(A-G圖)及治療后血清細胞因子的陰性轉化率比較(H圖)

3 討 論

RA-ILD目前治療措施主要是糖皮質激素和其他免疫抑制劑，但療效有限，死亡率居高不下，同時免疫抑制劑使用時間長容易導致肝腎功能損害等副作用，目前治療RA-ILD仍然是一大難題。因此研究安全、有效的治療RA-ILD的新方法和技術已迫在眉睫。基于肺纖維化是多因素共同參與，研究多通道、多靶點的治療新藥是有價值的探索。本研究通過利用TNF-α拮抗劑聯(lián)合激素和環(huán)磷酰胺治療RA-ILD患者，發(fā)現(xiàn)該治療方法能使患者血清中的TGF-β、TNF-α、CCP-Ab、IL-2、IL-17、KL-6和MCP-1的含量轉陰，且其轉陰率顯著高于激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺的治療。

TNF-α是一種來源于單核吞噬細胞的對于炎癥反應具有多效性的細胞因子，它可以通過促進肺泡Ⅱ細胞的凋亡來抑制損傷的肺組織的修復過程，通過與其他因子和細胞相互作用參與肺纖維化的發(fā)病過程，在肺間質纖維化發(fā)病機制中起著重要作用[9]。TNF-α的拮抗劑有以戈利木單抗和阿達木單抗為代表的全人源化抗體[10]。戈利木單抗是轉基因小鼠技術產(chǎn)生的全人源單抗，阿達木單抗是噬菌體展示技術產(chǎn)生的全人源單抗，免疫原性低，產(chǎn)生抗抗體的發(fā)生率均比其他TNF-α拮抗劑低，因此治療效果好[8]。除此之外，該藥依從性高于其他TNF-α拮抗劑[11]。在本研究中，通過比較RA-NILD和RA-ILD患者血清中的TNF-α含量，發(fā)現(xiàn)RA-ILD患者血清中的含量明顯高于RA-NILD患者。另外，抑制TNF-α能有效緩解RA病情[12]。因此，TNF-α拮抗劑不僅能減緩肺間質纖維化還能治療RA。

另外，涎液化糖鏈抗原(Krebs von den Lungen-6，KL-6)是肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌的一種大分子唾液酸糖蛋白，在正常的肺泡上皮細胞表面表達量少。受損的Ⅱ型肺泡上皮細胞在損傷和再生過程中分泌大量KL-6，而KL-6誘導成纖維細胞聚集，并對成纖維細胞有著抑制凋亡及促進增殖的作用，從而促進肺纖維化形成[13]。血清KL-6水平升高可能反應Ⅱ型肺泡上皮細胞受損和再生，已發(fā)現(xiàn)多種肺部疾病均會出現(xiàn)血清KL-6水平增高，在RA、系統(tǒng)性硬化癥等多種結締組織病合并的間質性肺病中的表達亦明顯升高，且與疾病的嚴重性相關，并有研究提出血清KL-6水平可以作為ILD早期檢測的生物標志物[14,15]。與之相一致的是，我們發(fā)現(xiàn)RA-ILD患者的KL-6水平明顯高于RA-NILD患者的KL-6的水平。而經(jīng)過TNF-α拮抗劑聯(lián)合激素和環(huán)磷酰胺治療后，KL-6水平明顯降低。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)RA-ILD患者血清中TGF-β、TNF-α、CCP-Ab、IL-2、IL-17、KL-6和MCP-1的含量明顯更高，發(fā)現(xiàn)各項指標與RA-ILD的發(fā)病關系。目前，傳統(tǒng)的免疫抑制劑治療RA-ILD的效果欠佳，我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合TNF-α拮抗劑治療RA-ILD能有效的提高療效，這為治療RA-ILD患者提供新的治療方向。不過，TNF-α拮抗劑優(yōu)化激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺療效的分子機制還有待臨床大樣本研究進一步探索。