張佳，高微，袁紅霞，柴文戍

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[1](rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性全身性自身免疫性疾病，具有一定的種族差異，發(fā)病與感染、遺傳、內(nèi)分泌、環(huán)境及吸煙等綜合因素尤為相關(guān)。RA發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，盡管過去20年RA治療取得了很大的進(jìn)展[2]，但臨床上仍然缺乏特異性的治療措施，因此，研究RA的發(fā)病機(jī)制、探索其早期療效及病情預(yù)后、尋找有效的治療靶點，已成為醫(yī)學(xué)界的當(dāng)務(wù)之急。

多種趨化因子及其受體在RA滑膜組織中異常增高，提示趨化因子及其受體參與滑膜的增生過程，驅(qū)使特定的炎癥細(xì)胞游走至炎癥部位，參與炎癥反應(yīng)。在RA患者的滑膜組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞中，趨化因子受體-7(CC-chemokine receptor 7，CCR7)及其配體高度表達(dá)，調(diào)節(jié)RA患者的血管新生[3]，并形成血管翳，引起骨、軟骨和關(guān)節(jié)的破壞，導(dǎo)致不可逆的關(guān)節(jié)功能喪失。故而CCR7受體在RA的發(fā)生發(fā)展中起到不可忽視的作用。

姜黃素(curcumin，CUR)是姜黃最具活性的成分，具備多種作用，包括抗炎、抗腫瘤、抑制血管新生等[4]。因為血管翳形成是RA重要的病理特征，故推測姜黃素具有抗類風(fēng)濕的作用，但機(jī)制尚不清楚。本研究擬通過分子生物學(xué)和組織學(xué)方法，研究AA大鼠血清和關(guān)節(jié)滑膜中CCR7的表達(dá)，探討姜黃素對AA大鼠的治療作用及可能的機(jī)制，為臨床治療提供新方法。

1 材料及方法

1.1 材料

40只SPF級Wistar大鼠，雌性，體重160～180 g，由錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(使用許可證書編號：SYXK(遼)2014-0002)；姜黃素、甲氨蝶呤、完全弗氏佐劑、兔抗大鼠CCR7多克隆抗體、Rat CCR7 ELISA Kit等分別由Sigma公司、Chondrex公司、通化茂祥制藥有限公司和北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組

將40只Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)選取9只，作為對照組(A組)，其余31只均建立AA模型，實驗第7天時選取27只關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分>2的大鼠隨機(jī)分為3組，進(jìn)一步分為模型組(B組)、甲氨蝶呤(C組)以及姜黃素組(D組)，每組9只大鼠。

1.2.2 模型建立及實驗給藥

使用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉大鼠，固定在操作臺上，于左足底碘伏常規(guī)消毒，將10 mg/mL完全弗氏佐劑(CFA)于B、C、D組大鼠左后足底皮內(nèi)注射，每只0.1 mL，制成AA模型，記為day 0。將等劑量生理鹽水注入對照組大鼠左后足底皮內(nèi)。于實驗第7 d開始給藥，C組和D組大鼠采用腹腔注射方式給藥，其中C組：甲氨蝶呤注射液0.5 mg/kg(治療RA經(jīng)典藥物作為陽性對照，依據(jù)蔡佳宇等人文獻(xiàn)[5]選擇最適劑量)，3 d給藥1次，連續(xù)給藥21 d(7次)；D組：姜黃素注射液50 mg/kg(依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果選擇最適劑量)，每日1次，共使用21 d。將等劑量生理鹽水分別腹腔注入模型組和對照組大鼠。

1.2.3 標(biāo)本處理

于最后一次姜黃素治療后24 h，即實驗第28天，用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 mL/100 g)，麻醉后固定大鼠，迅速抽取右心室靜脈血，于離心機(jī)以3000 r/min的速度離心15 min，移取上清液保存于-20 ℃冰箱，用于CCR7蛋白的測定。

取大鼠左后足連同踝關(guān)節(jié)一起，去除皮毛和肌肉，沖洗干凈，在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，使用脫鈣液脫鈣，每克組織約需脫鈣液30 mL，每7天換液1次，常規(guī)脫鈣2 w，直至大頭針針刺組織無抵抗時為止。脫鈣滿意后，縱行剖開關(guān)節(jié)，常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。

1.2.4 Western blot法(免疫印跡法)檢測AA大鼠滑膜組織PI3K、AKT、VEGF蛋白表達(dá)

制備蛋白提取液，BCA法蛋白定量，配置SDS-聚丙烯酸胺凝膠：濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為10%。按每孔蛋白含量(50～100 μL)相同的原則，于濃縮膠的上樣孔中，加入蛋白上樣液，剝離凝膠，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別滴加一抗，于4 ℃孵育過夜，用顯色液顯色，最后用ImageJ軟件行灰度值分析，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.5 ELISA法檢測AA大鼠血漿中CCR7、PI3K、VEGF的表達(dá)

根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對AA大鼠體征及踝關(guān)節(jié)腫脹程度的影響

A對照組大鼠一般狀態(tài)良好，飲食正常，毛發(fā)光澤，活潑好動，精神狀態(tài)佳，體重上升趨勢，外觀形態(tài)增大；關(guān)節(jié)無紅腫。B模型組大鼠于實驗后出現(xiàn)鼠爪紅腫，且腫脹程度隨時間進(jìn)展逐漸加重，以踝關(guān)節(jié)及后足最為明顯。于第8～9天腫脹最嚴(yán)重，以踝關(guān)節(jié)為主，皮溫升高，皮膚充血紅腫，足墊增厚明顯，部分鼠爪關(guān)節(jié)皮膚出現(xiàn)明顯破潰現(xiàn)象；第21天起腫脹趨于平穩(wěn)，進(jìn)一步出現(xiàn)關(guān)節(jié)強(qiáng)直、不可負(fù)重現(xiàn)象。給予藥物治療后，C、D組大鼠仍精神萎靡、食欲差毛發(fā)枯燥并伴有脫毛等癥狀，但于實驗第9、10天起有飲食水量逐漸恢復(fù)好轉(zhuǎn)，精神狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，大鼠治療后關(guān)節(jié)腫脹、皮膚充血情況有所減輕，尚未出現(xiàn)關(guān)節(jié)強(qiáng)直征象。于造模前使用排水法測量鼠爪體積，并每周記錄鼠爪腫脹體積，于各時間段，B、C、D組鼠爪腫脹體積均高于A組；第14天，C、D組鼠爪腫脹體積較比B組減小(P<0.05)，明顯高于A組(P<0.01)；第21天和第28天，C、D組鼠爪腫脹體積較比B組明顯減小(P<0.01和P<0.05)，但C及D組無顯著差異(P>0.05)，見表1、圖1。

表1 姜黃素對AA大鼠爪體積變化的影響

與A組比較，##P<0.01；與B組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 姜黃素對AA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)改變的影響

根據(jù)關(guān)節(jié)組織病理切片的HE染色可見：A組大鼠關(guān)節(jié)腔清晰完整，關(guān)節(jié)間隙正常，關(guān)節(jié)滑膜無增生，無炎性細(xì)胞浸潤，軟骨表面光滑，未見血管增生現(xiàn)象，無軟骨及骨質(zhì)破壞。B組大鼠滑膜增生混亂，關(guān)節(jié)滑膜層明顯增厚，滑膜中有大量炎性細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤，細(xì)胞排列稀疏，可見部分血管翳形成，軟骨及骨表面有嚴(yán)重的骨破壞。C組及D組大鼠可見滑膜增生，但程度明顯低于B組。關(guān)節(jié)滑膜層有增厚，較比B組減輕，滑膜中少量炎細(xì)胞浸潤，未見血管翳，未見明顯的軟骨及骨破壞，見圖2。

A 對照組：關(guān)節(jié)腔清晰完整，關(guān)節(jié)間隙正常，滑膜無增生；B 模型組：關(guān)節(jié)滑膜明顯增厚，大量炎細(xì)胞浸潤；C 甲氨蝶呤組：關(guān)節(jié)滑膜輕度增厚，少量炎細(xì)胞浸潤；D 姜黃素組：關(guān)節(jié)滑膜有增厚，少量炎細(xì)胞浸潤

2.3 姜黃素對AA大鼠血清中CCR7蛋白含量的影響

在上述研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過ELISA方法對AA大鼠血清中CCR7、蛋白含量進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，與A組比較，B、C、D組的CCR7蛋白含量均有明顯升高(P<0.01)；與B組比較，C、D組蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.01)；C、D組比較無差異。AA大鼠血清CCR7蛋白含量增加，姜黃素能明顯抑制CCR7蛋白含量，見表2、圖3。

表2 姜黃素對AA大鼠血清中CCR7蛋白含量的影響

與A組比較，##P<0.01；與B組比較，**P<0.01

2.4 姜黃素對AA大鼠滑膜組織CCR7蛋白表達(dá)的影響

為探討AA大鼠滑膜組織CCR7蛋白的表達(dá)及姜黃素對其表達(dá)的影響，通過Western blot方法檢測CCR7蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與A組比較，B、C、D組CCR7蛋白表達(dá)均有顯著增加(P<0.01)；與B組比較，C、D組蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.01)；C及D組相比無差異(P>0.05)。AA大鼠滑膜組織CCR7蛋白表達(dá)增加，姜黃素能明顯抑制CCR7蛋白表達(dá)，見圖4。

與A組比較，##P<0.01；與B組比較，**P<0.01

2.5 大鼠血清中CCR7含量與鼠爪腫脹體積的相關(guān)性分析

明確AA大鼠炎癥反應(yīng)與鼠爪腫脹體積的相關(guān)性，進(jìn)一步對AA大鼠血清中CCR7蛋白含量與鼠爪腫脹程度進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，AA大鼠血清中CCR7蛋白含量與鼠爪腫脹程度呈正相關(guān)、高度相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.8784(P<0.01)，CCR7是AA大鼠重要的炎性介質(zhì)，參與AA的發(fā)病過程，見圖5。

r=0.8784，P<0.01

3 討 論

AA大鼠類風(fēng)濕模型是公認(rèn)的類風(fēng)濕動物模型，其表現(xiàn)為局部關(guān)節(jié)炎和全身性炎癥反應(yīng)[6]。本實驗通過使用佐劑經(jīng)典途徑建造大鼠的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型，并于不同時間點觀察大鼠體征、體重、足趾腫脹程度及病理染色切片，結(jié)果表明模型組大鼠均可見精神萎靡、毛發(fā)枯燥、行動不靈活、后肢跛行、鼠爪腫脹甚至強(qiáng)直等表現(xiàn)，鼠爪體積和關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯增高，同時HE染色可見有滑膜增生混亂、滑膜中炎細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤、軟骨及骨組織表面破壞等征象，與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[7]。而姜黃素組能明顯減輕大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度，鼠爪腫脹體積和關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯低于模型組，HE染色關(guān)節(jié)滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤及軟骨的損傷明顯減輕。提示姜黃素減緩關(guān)節(jié)滑膜組織增生、炎性細(xì)胞浸潤以及軟骨的破壞損傷。

有研究表明，多種趨化因子及受體在RA滑膜組織中表達(dá)明顯增高[8]，提示兩者參與滑膜增生過程。其中，趨化因子受體CCR7可特異地與趨化因子結(jié)合，CCR7與其配體聯(lián)合作用可介導(dǎo)多種免疫細(xì)胞的遷移，并參與自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展，而在靜止的單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面則未有表達(dá)[9]。

1988年，Valente等人發(fā)現(xiàn)首個趨化因子CCL2后，趨化因子及受體的結(jié)構(gòu)與功能、作用途徑成為研究的熱點話題。國內(nèi)外研究表明，多種趨化因子及受體在RA滑膜組織中表達(dá)明顯增高，提示兩者參與滑膜增生過程。細(xì)胞因子-趨化性細(xì)胞因子間的相互作用可能在炎癥性滑膜炎疾病的發(fā)生、發(fā)展及持續(xù)階段均起著重要作用。其中，趨化因子受體CCR7可特異地與趨化因子結(jié)合，CCR7與其配體聯(lián)合作用可介導(dǎo)多種免疫細(xì)胞的遷移，并參與自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展，而在靜止的單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面則未有表達(dá)。提示，CCR7在RA中發(fā)揮重要作用。新近研究表明，CCL19、CCL21和CCR7在RA患者的滑膜組織和滑液中高表達(dá)，RA患者血漿中CCR7升高[10]，且在RA的滑膜中發(fā)現(xiàn)有異位的生發(fā)中心，并與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[11]。

姜黃素(curcumin，CUR)是姜黃最具活性的成分，具備多種作用，包括抗炎、抗腫瘤、抑制血管新生等[4，12]1053-1064。因為血管翳形成是RA重要的病理特征，故推測姜黃素具有抗類風(fēng)濕的作用，但機(jī)制尚不清楚。

我們應(yīng)用Western blot和ELISA法分別檢測AA大鼠滑膜組織及血清中CCR7的蛋白含量，結(jié)果顯示模型組CCR7表達(dá)明顯高于對照組，經(jīng)甲氨蝶呤及姜黃素等進(jìn)行藥物治療后，CCR7明顯降低。進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示AA大鼠血清中CCR7蛋白含量與鼠爪腫脹程度呈正相關(guān)、高度相關(guān)r=0.8784(P<0.01)，提示CCR7參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程，同時姜黃素可以通過抑制CCR7對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎起到治療作用。

綜上所述，姜黃素在AA大鼠滑膜組織炎癥的病理改變過程中有明顯的抑制作用，證明了姜黃素對RA的滑膜炎癥有較好的治療作用。從而為姜黃素臨床上治療提供了實驗和理論依據(jù)。