宋福成，鄧 靖，楊海沛，張之劍，孫玉敏

(1.武警第一機動總隊醫(yī)院 門診部，河北 定州073000；2.武警第一機動總隊醫(yī)院 衛(wèi)生防疫科，河北 定州066000；3.武警第一機動總隊醫(yī)院 外二科，河北 定州066000；4.滄州醫(yī)學高等?？茖W校 內(nèi)科，河北 滄州061001)

葛根素(7，4’-二羥基-8-C-葡萄糖基異黃酮)是從多年生豆科植物葛根中提取的異黃酮[1-2]。多年來，它在我國傳統(tǒng)醫(yī)學中被廣泛應用于心血管疾病的臨床治療，包括心肌梗塞、腦缺血、心絞痛和高血壓。葛根素對心臟功能有保護作用，防止缺血再灌注損傷，改善心肌代謝和減少梗塞面積。已有學者發(fā)現(xiàn)，葛根素可以通過減少活性氧的產(chǎn)生、避免線粒體膜電位的崩潰、減輕后續(xù)細胞凋亡來保護心肌細胞免受缺血再灌注損傷[3]，但關于葛根素對老年大鼠心肌細胞氧化應激的影響尚無報道。本研究通過觀察不同濃度葛根素對老年大鼠心肌細胞氧化應激的影響，旨在探討葛根素的心肌保護機制，為心血管病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑CKX31 型倒置相差顯微鏡(日本 Olympus 公司)，MCO-18AIC 型 CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)，超聲波細胞粉碎機(寧波，新芝公司)，BIO-RAD680 型酶標儀 (上海天呈科技有限公司)，DU800紫外分光光度計(美國 Beckman公司)，細胞培養(yǎng)板(美國，Corning公司)。

葛根素(購自中國藥品生物制品檢定所，批號110752-201301，白色粉末狀，20 mg/支，純度96%)，胎牛血清、胰蛋白酶(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，DMEM 培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素(美國 Gibco 公司)，噻唑藍(MTT，美國 Ameresco 公司)。丙二醛(malonaldehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)。

含葛根素培養(yǎng)液的配制：取適量的葛根素，配置終濃度為1、10、100、250 μg/mL 的培養(yǎng)液。

1.2 原代培養(yǎng)老年大鼠心肌細胞正常健康清潔級20-24月齡SD老年大鼠。 腹腔注射肝素約 10 min 后，頸椎脫臼處死，分離左心室。用胰酶(1 mg/mL)在D-Hanks平衡鹽溶液中消化。離心回收細胞，重新懸浮在平板培養(yǎng)基(DMEM，100 U/mL青霉素和鏈霉素)中，并預先平板在預涂有1%明膠(37℃，30 min)的60 mm培養(yǎng)皿上，以除去非肌細胞。將未貼壁的心肌細胞以每皿1×106個細胞接種在明膠包被的60 mm培養(yǎng)皿上。18 h后，在實驗期間，將心肌細胞洗滌并在無血清維持培養(yǎng)基(DMEM、100 U/ml青霉素和鏈霉素)中培養(yǎng)。分別在實驗前用葛根素處理細胞[4]。

1.3 心肌細胞增殖情況的MTT法檢測胰酶消化細胞，制備單個細胞懸液(細胞密度為 1×106個/ml)。向 96 孔板滴加細胞懸液，每孔200 μl，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng) 12 h，待細胞穩(wěn)定貼壁生長后，分別作用于含終濃度為 0、1、10、100、250 μg/ml葛根素的培養(yǎng)液培養(yǎng) 24、48、72 h，設 6 復孔。每孔加入 5.0 mg/ml 的 MTT 溶液 20 μl，于 37 ℃孵育 4-6 h，棄上清液，離心 5 min，棄培養(yǎng)液。每孔加 150 μl 的 DMSO 振蕩 10 min，充分溶解結(jié)晶物。采用酶聯(lián)免疫檢測儀，于 490 nm 波長處檢測光密度值(OD 值)，并計算細胞存活率 [細胞存活率=(葛根素組 OD 值-空白組 OD 值)/(對照組OD 值-空白組 OD 值)×100%]。

1.4 心肌細胞氧化應激指標的測定心肌細胞與不同濃度葛根素培養(yǎng)液共培養(yǎng)72 h，消化、洗滌后，收集各組細胞至2 ml EP管，冰浴。采用超聲波裂解心肌細胞(功率600 w，超聲5 s，間隙10 s，20次)。取各組細胞裂解液，應用考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度，按照試劑盒說明書處理樣品，采用化學比色法測定SOD、T-AOC活力及MDA含量。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度葛根素組心肌細胞的存活率與空白對照組(0 μg/ml)比較， 1、10、100 μg/ml 葛根素作用 24、48、72 h后存活率變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；250 μg/ml葛根素組，心肌細胞的存活率下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表 1。

表1 不同濃度葛根素組心肌細胞的存活率

2.2 葛根素對心肌細胞SOD、T-AOC活力及MDA含量的影響0、1、10、100 μg/ml 葛根素組SOD、T-AOC活力呈劑量依賴性增高，MDA含量呈劑量依賴性降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。250 μg/ml葛根素組SOD、T-AOC活力及MDA含量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 葛根素對心肌細胞SOD、T-AOC活力及MDA含量的影響

3 討論

線粒體中活性氧的種類增加可以引起線粒體DNA變異而損傷線粒體，最終導致細胞的衰老。細胞的衰老與線粒體過多的自由基、細胞的凋亡相關，因此探索能抗凋亡、清除細胞內(nèi)自由基的天然藥物對于抗衰老十分重要[5]。葛根素是一種黃酮苷，具有擴張心腦血管、降低心肌氧耗，改善微循環(huán)、抗血小板聚集等作用。已有研究表明，葛根素通過抑制高遷移率族蛋白 B1的釋放，增加抗凋亡基因的表達，從而減少心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡、改善心功能[6]。

有研究顯示：葛根素對心肌具有保護作用，能夠抗心肌細胞凋亡，減輕心肌細胞缺氧/復氧損傷[7-8]。翟毅[9]用葛根素干預大鼠心肌細胞H9c2，發(fā)現(xiàn)葛根素通過激活Akt蛋白來抑制阿霉素誘導的H9c2心肌細胞凋亡。葛根素預處理可提高缺血再灌注新生大鼠原代心肌細胞的活力，減少缺血再灌注損傷引起的活性氧生成、線粒體膜電位喪失、細胞壞死和凋亡[10]。本研究在參考以往研究基礎上，將葛根素濃度范圍設為0-250 μg/ml。結(jié)果顯示：與空白對照組(0 μg/ml)比較， 1、10、100 μg/ml葛根素作用 24、48、72 h后存活率變化不明顯；250 μg/ml葛根素預處理心肌細胞，其存活率下降，表明0-100 μg/ml葛根素預處理對心肌細胞較安全，250 μg/ml葛根素則濃度偏高，不利于心肌細胞生長。

活性氧是體內(nèi)一類氧的單電子還原產(chǎn)物，是電子漏出呼吸鏈消耗2%的氧而生成[11]。活性氧的產(chǎn)生主要是線粒體呼吸鏈大量電子漏出并還原氧分子形成，是機體內(nèi)由氧組成，含氧且性質(zhì)活潑的物質(zhì)的總稱[12]。SOD是機體內(nèi)一種抗氧化酶，在調(diào)節(jié)機體氧化-抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。T-AOC反應各種抗氧化物質(zhì)和包括SOD在內(nèi)的各種抗氧化酶構成的總抗氧化水平。SOD和T-AOC分別從單個酶和總體水平反應細胞抗氧化水平。MDA則反應細胞的氧化水平，是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化而生成的終產(chǎn)物。本研究結(jié)果顯示：0、1、10、100 μg/ml葛根素組SOD、T-AOC活力呈劑量依賴性增高，MDA含量呈劑量依賴性降低。250 μg/ml葛根素組SOD、T-AOC活力及MDA含量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示0-100 μg/ml葛根素可增強心肌細胞的抗氧化水平。

綜上所述，本研究結(jié)果表明0-100 μg/ml葛根素對原代大鼠心肌細胞較為安全，增強心肌細胞抗氧化應激水平。本研究尚存在一定局限性，如葛根素濃度梯度較小、作用時間較短等，將在后續(xù)研究中深入探討。