梅 楠，趙 妮，陳旭陽(yáng)，阮穩(wěn)穩(wěn)，宜 燁，李春麗*

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，陜西 西安710061；2.商洛市中心醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，陜西 商洛726000；3.安康市人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，陜西 安康725000)

乳腺癌嚴(yán)重影響全球女性的身心健康，2018年，GLOBOCCAN[1]的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，全球新診斷的女性乳腺癌病例幾乎占女性癌癥病例的25%，約210萬(wàn)，女性乳腺癌癥死亡率占據(jù)女性癌癥死亡率的15%，總計(jì)達(dá)630萬(wàn)。乳腺癌患者的存活率在不同的階段有很大的差異，Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期的患者總體5年生存率在50%以上，而IV期患者的5年生存率只有27%[2]。因此，及時(shí)有效地預(yù)測(cè)治療乳腺癌的效果，尋找更多的基因靶點(diǎn)和相應(yīng)的突變位點(diǎn)，以便更全面、準(zhǔn)確地指導(dǎo)腫瘤患者的個(gè)體化治療是當(dāng)務(wù)之急。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的開(kāi)展以及分子生物學(xué)在臨床醫(yī)學(xué)中的普遍應(yīng)用，人們對(duì)乳腺癌易感基因及其突變?cè)诎┌Y發(fā)生、發(fā)展中的作用進(jìn)行了廣泛的研究。與乳腺癌密切相關(guān)的易感基因是BRCA家族基因(BRCA1和BRCA2)，其通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞凋亡等一系列生物學(xué)功能，參與保護(hù)和修復(fù)基因的共同通路，維持基因組完整性和穩(wěn)定性，從而抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[3]。Kuchenbaecker團(tuán)隊(duì)通過(guò)前瞻性數(shù)據(jù)進(jìn)行了基于BRCA1和BRCA2突變載體狀態(tài)的癌癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，在乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中，發(fā)現(xiàn)BRCA基因突變的女性患乳腺癌的危險(xiǎn)顯著升高，BRCA1和BRCA2攜帶者在80歲時(shí)累積乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)分別為72%和 69%[4]。PI3K/AKT是驅(qū)動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在乳腺癌中經(jīng)常被激活，抑制該通路還可以增加內(nèi)分泌治療乳腺癌效果[5]。ATM是常染色體隱性突變基因，屬于PI3K蛋白家族成員，與乳腺癌的預(yù)后有較高相關(guān)性，其表達(dá)下調(diào)和缺失導(dǎo)致基因修復(fù)通路失調(diào)，作用于乳腺癌惡性發(fā)展的過(guò)程[6]。大量研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者及其家族中BRCA2突變，比如雜合的c.5722_5723del突變[7]、c.8946_8947delAG突變[8]。BRCA2突變后，可能會(huì)通過(guò)PI3K/AKT通路干擾同源重組蛋白，比如ATM，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂修復(fù)功能障礙，最終促使乳腺癌的發(fā)生。目前，除了生物信息學(xué)技術(shù)的基因測(cè)序?qū)ふ业腂RCA2突變外，還未發(fā)現(xiàn)相關(guān)細(xì)胞體內(nèi)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建BRCA2過(guò)表達(dá)載體和突變載體，來(lái)分析BRCA2和同源重組蛋白共同作用乳腺癌發(fā)展過(guò)程。為進(jìn)一步討論BRCA2基因?qū)θ橄侔┥飳W(xué)功能的影響，及其作用信號(hào)通路和相關(guān)機(jī)制，為后續(xù)BRCA2突變位點(diǎn)功能的分析和探索奠定基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建BRCA2基因過(guò)表達(dá)載體并完成相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以期為乳腺癌的作用信號(hào)通路機(jī)制和分子精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器設(shè)備

BT474細(xì)胞株(上海拜力公司)，Lipofectamine

3000(invitrogen公司)，CCK8試劑盒(七海生物公司)，質(zhì)粒提取試劑盒(天根)，McCoy 5a培養(yǎng)基(Gibco公司)，基質(zhì)膠體和Transwell小室(Corning公司)，1640培養(yǎng)基、胰酶、雙抗(Hyclone公司)，BRCA2兔多克隆抗體和ATM兔單克隆抗體(abcam公司)，F(xiàn)BS(Gibco公司)。小離心機(jī)(1.5 ml)(大龍公司)，離心機(jī)(15 ml)(湘儀公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)，水浴鍋(國(guó)華)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化公司)，流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibu公司)，酶標(biāo)儀(BIO-RAO公司)，凝膠成像系統(tǒng)儀(ATTO公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

BT474細(xì)胞用1640 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和10 μg/ml 胰島素)于37℃、5% CO2細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2BRCA2過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

從購(gòu)買(mǎi)的cDNA-BRCA2克隆中擴(kuò)增出目的片段，PCR擴(kuò)增條件:預(yù)變性94℃，2 min 30 s；之后每個(gè)循環(huán)變性94℃，20 s；退火60 ℃，30 s；延伸68℃，1 min；共進(jìn)行18個(gè)循環(huán)；68 ℃再延長(zhǎng)5 min；15℃保存。瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證以上PCR產(chǎn)物，采用Qiagen膠回收試劑盒在凝膠成像系統(tǒng)下切膠回收目的片段。將上述回收純化后的產(chǎn)物以及真核表達(dá)載體pCDNA3.1-coGFP進(jìn)行Nhel和Xhol雙酶切，37℃酶切30 min，酶切產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，Qiagen膠回收后利用同源重組的方法，讓酶切后的載體和擴(kuò)增片段進(jìn)行非依賴酶性連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后挑取克隆進(jìn)行菌液PCR，提取質(zhì)粒，最后用Nhel和Xhol 雙酶切進(jìn)行鑒定。將回收得到的質(zhì)粒樣品以空載質(zhì)粒pCDNA3.1-coGFP為對(duì)照，一起進(jìn)行凝膠電泳，送公司測(cè)序。

1.2.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞系

將培養(yǎng)好的BT474細(xì)胞鋪于24孔板，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染BRCA2基因過(guò)表達(dá)組)、空白細(xì)胞對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染組)和陰性對(duì)照組(空載體轉(zhuǎn)染組)，除空白細(xì)胞對(duì)照組，其它兩組每個(gè)孔加入1.0 μg的質(zhì)粒，細(xì)胞貼壁后用lipofect 3000轉(zhuǎn)染試劑的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.4Western blot

將轉(zhuǎn)染后的BT474細(xì)胞以及空白細(xì)胞對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染組用IP裂解液加1 %的PMSF蛋白酶抑制劑來(lái)裂解蛋白，測(cè)量蛋白濃度(BCA法)；用12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，100 V 轉(zhuǎn)膜 1 h，經(jīng)BRCA2、ATM、PALB2、Rad51抗體孵育后顯色。

1.2.5免疫組化檢測(cè)

選取一位病理診斷明確為“右側(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌”的女性患者的癌組織石蠟標(biāo)本切片，采用SP法檢測(cè)BRCA2和ATM蛋白的表達(dá)。在 HE 切片下選取合適的蠟塊連續(xù)切片,約3 μm厚，脫蠟、乙醇脫水、修復(fù)抗原、過(guò)氧化氫、蒸餾水、PBS 緩沖液處理。分別在切片上加一抗BRCA2兔多克隆抗體(1∶200)和一抗ATM兔單克隆抗體(1∶100)，過(guò)夜。DAB顯色，自來(lái)水沖洗，復(fù)染脫水，透明封片，PBS作陰性對(duì)照。細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中出現(xiàn)淡黃至棕黃色為陽(yáng)性顯色，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例確定BRCA2、ATM蛋白表達(dá)。

1.2.6CCK8法

pCDNA3.1(+)-copGFP-BRCA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BT474細(xì)胞 24 h后，接種于96孔板(5×103個(gè)細(xì)胞/孔)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。記0 h(細(xì)胞貼壁時(shí))，分別在第48、72、96 h加入10 μl CCK-8，于37℃培養(yǎng)箱孵育1 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在 450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值(OD)。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，OD取平均值為縱軸)。

1.2.7流式檢測(cè)法

pCDNA3.1(+)-copGFP-BRCA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BT474細(xì)胞 24 h后，接種于6孔板(5×105個(gè)細(xì)胞/孔)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別在第48、72、96 h收集轉(zhuǎn)染的樣品，測(cè)定凋亡率。

1.2.8細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

pCDNA3.1(+)-copGFP-BRCA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BT474細(xì)胞 24 h后，接種于6孔板(5×105個(gè)細(xì)胞/孔)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染24 h后，對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞劃痕，拍照，記為0 h，繼續(xù)培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)染48 h、72 h、96 h后，分別觀察細(xì)胞生長(zhǎng)遷移情況并拍照記錄。

1.2.9Transwell實(shí)驗(yàn)

pCDNA3.1(+)-copGFP-BRCA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BT474細(xì)胞 24 h后，接種于6孔板(5×105個(gè)細(xì)胞/孔)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染24 h后，每個(gè)小室中加入1×105個(gè)細(xì)胞；培養(yǎng)24 h后取出培養(yǎng)板；棄培養(yǎng)基，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定20 min；棄固定液，PBS清洗3次，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，濕棉簽擦去上層未發(fā)生遷移的細(xì)胞，PBS清洗3次后顯微鏡下拍照；細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h、72 h、96 h后重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 真核表達(dá)載體 pCDNA3.1(+)-copGFP-BRCA2的構(gòu)建和鑒定

以購(gòu)買(mǎi)的cDNA-BRCA2克隆出模板，PCR擴(kuò)增人BRCA2的編碼序列，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2；產(chǎn)物以及真核表達(dá)載體pCDNA3.1-coGFP進(jìn)行Nhel和Xhol雙酶切，膠回收后利用同源重組的方法，進(jìn)行非依賴酶性連接酶切后的載體和擴(kuò)增片段。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后挑取克隆進(jìn)行菌液PCR，并選取陽(yáng)性克隆再搖菌提取質(zhì)粒，用Nhel和Xhol 雙酶切鑒定，兩次酶切結(jié)果分別如圖3和圖4。通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)回收得到的質(zhì)粒樣品比空pCDNA3.1-coGFP對(duì)照高，可以確認(rèn)構(gòu)建好的質(zhì)粒序列100%正確，因此確認(rèn)構(gòu)建成功。

圖1 BRCA2-I的兩個(gè)分段

2.2 Western blotting 分別檢測(cè)BRCA2蛋白及HR通路相關(guān)蛋白在BT474細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 BRCA2-II的兩個(gè)分段

圖3 pCDNA3.1-coGFP/NheI,XhoI酶切產(chǎn)物

圖4 pCDNA3.1-coGFP-BRCA2-II/NheI酶切產(chǎn)物

Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中BRCA2、 ATM、PALB2和Rad51蛋白的表達(dá)。如圖5結(jié)果顯示，與空白細(xì)胞對(duì)照組和陰性細(xì)胞對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的BRCA2、ATM、PALB2和Rad51蛋白條帶顯現(xiàn)，其表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)。

圖5 乳腺腫瘤細(xì)胞中蛋白表達(dá)情況(A和B)

2.3 免疫組化檢測(cè)人乳腺癌組織中BRCA2和ATM蛋白的表達(dá)

免疫組化結(jié)果如圖6顯示，BRCA2和ATM在乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)同時(shí)增加，表現(xiàn)為強(qiáng)陽(yáng)性。

圖6 BRCA2和ATM在乳腺癌組織的免疫組化(放大×400)

2.4 BRCA2基因過(guò)表達(dá)后BT474細(xì)胞的增殖凋亡情況

CCK8法檢測(cè)BRCA2基因過(guò)表達(dá)組細(xì)胞系和空白細(xì)胞對(duì)照組以及空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況。在BT474細(xì)胞中，結(jié)果分別如圖7所示，與對(duì)照組相比，BRCA2基因過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖能力降低，其生長(zhǎng)速度顯著低于相應(yīng)的對(duì)照組(P<0.05)，而空白細(xì)胞對(duì)照組和陰性對(duì)照組在不同時(shí)間的增殖速度相比，無(wú)明顯差異(P>0.05)，說(shuō)明BRCA2基因可抑制BT474細(xì)胞的增殖。細(xì)胞凋亡情況的結(jié)果如圖8所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，與對(duì)照組相比，BRCA2基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞系凋亡率逐漸升高(P<0.05)，說(shuō)明BRCA2基因可促進(jìn)BT474細(xì)胞的凋亡。

圖7 BRCA2基因抑制乳腺腫瘤細(xì)胞增殖

圖8 BRCA2基因促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡

2.5 BRCA2基因過(guò)表達(dá)后BT474細(xì)胞的侵襲遷移情況

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)BRCA2基因過(guò)表達(dá)后對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響結(jié)果。將BRCA2過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)組及相應(yīng)的對(duì)照組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染BT474細(xì)胞系，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，劃痕48 h、72 h、96 h后，計(jì)算遷移距離。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在BT474細(xì)胞中，BRCA2基因過(guò)表達(dá)組細(xì)胞系和空白細(xì)胞對(duì)照組以及空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞對(duì)比，遷移率降低，遷移能力下降(P<0.05)，因此BRCA2基因抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移(見(jiàn)圖9)。Transwell檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后侵襲能力的變化，結(jié)果表明，BRCA2基因可抑制乳腺腫瘤細(xì)胞侵襲(見(jiàn)圖10)。

圖9 BRCA2基因抑制乳腺腫瘤細(xì)胞遷移(A和B)

圖10 BRCA2基因抑制乳腺腫瘤細(xì)胞侵襲

3 討論

3.1 BRCA通路相關(guān)基因與DNA損傷修復(fù)密切相關(guān)

乳腺癌的發(fā)生不是一條簡(jiǎn)單的基因通路操縱，而是一個(gè)多步驟復(fù)雜通路參與的進(jìn)程，初潮年齡、生育年齡、絕經(jīng)年齡、母乳喂養(yǎng)、家族史、生殖因素、雌激素和生活方式都與此過(guò)程密切相關(guān)[9]。有研究分析表明，乳腺癌相關(guān)基因(BRCA1和BRCA2)的突變占家族性乳腺癌的20%-40%[10]。BRCA相關(guān)蛋白參與了重要的細(xì)胞功能，在調(diào)節(jié)DNA損傷如雙鏈斷裂修復(fù)、基因組穩(wěn)定性、細(xì)胞周期進(jìn)展的生物通路、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和參與DNA損傷的同源重組修復(fù)等方面發(fā)揮著重要作用，從而保護(hù)基因組，抑制腫瘤生長(zhǎng)[11]。

DNA損傷修復(fù)是通過(guò)一系列復(fù)雜的信號(hào)事件和各種酶的活動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而同源重組修復(fù)通路是一種涉及大量蛋白質(zhì)的DNA損傷反應(yīng)途徑，它們?cè)诜浅＞_的操作序列中相互作用，完成DNA的高保真修復(fù)[12]。在乳腺癌中，同源重組修復(fù)途徑不僅涉及BRCA1/2的復(fù)雜協(xié)同作用，還涉及其它相關(guān)的DNA修復(fù)蛋白。一篇綜述中闡述了乳腺癌常見(jiàn)的中、高外顯率基因的大致種系頻率，其中BRCA1、BRCA2、ATM、PALB2和Rad51在乳腺癌中的生殖系突變頻率分別約為2%-3.7%，1%-2.8%，0.3%-1.1%，0.2%-1.3%和0.2%-0.49%[13]。ATM是DNA修復(fù)系統(tǒng)的核心組成部分，激活后可增強(qiáng)DNA雙鏈斷裂的同源重組修復(fù)通路，同時(shí)ATM中的致病種系變異，在DNA損傷反應(yīng)和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)中起作用，導(dǎo)致乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的增加[14]。Rad51是DNA雙鏈斷裂修復(fù)中的關(guān)鍵蛋白，在侵襲性乳腺癌患者中，RAD51核表達(dá)的缺乏與較差的預(yù)后參數(shù)和較短的生存期有關(guān)[15]。PALB2截?cái)嘧儺悤?huì)導(dǎo)致乳腺癌發(fā)病率升高，PALB2能夠通過(guò)結(jié)合單鏈DNA與Rad51直接相互作用，使其成為同源重組介導(dǎo)修復(fù)的關(guān)鍵樞紐，因此PALB2的缺失導(dǎo)致BRCA2和RAD51加載到DNA雙鏈斷裂的位點(diǎn)功能受損[16]。目前都是相關(guān)綜述或者基于單個(gè)基因研究的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)去討論BRCA、ATM、PALB2、RAD51和同源重組的關(guān)系，暫時(shí)還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)將以上幾者結(jié)合后再去進(jìn)一步闡述它們的聯(lián)系，但是本實(shí)驗(yàn)不僅驗(yàn)證BRCA2蛋白在乳腺癌BT474細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)還研究了ATM、PALB2和Rad51蛋白在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。

3.2 PI3K/AKT信號(hào)通路在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用

PI3K/AKT作為一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，控制增殖、凋亡、血管生成、代謝和運(yùn)動(dòng)等多種細(xì)胞過(guò)程，是人類癌癥細(xì)胞中最常見(jiàn)的失調(diào)信號(hào)通路之一，這條通路中最重要的靶向調(diào)控點(diǎn)是PI3K、AKT和mTOR[17]。PI3K/AKT通路的改變涉及多個(gè)基因，在乳腺腫瘤中，約20%-50%的乳腺癌發(fā)生PIK3CA突變，不超過(guò)5%的乳腺癌發(fā)生PTEN突變，約3%的TNBC發(fā)生AKT突變，激活此通路會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞生長(zhǎng)存活以及抗腫瘤治療的耐藥性[18]。PI3K/AKT/mTOR通路已被認(rèn)為是乳腺癌的重要信號(hào)通路，其突變經(jīng)常在乳腺癌中被發(fā)現(xiàn)，并與細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤發(fā)生、癌癥進(jìn)展和耐藥性有關(guān)[19]。一項(xiàng)關(guān)于乳腺癌細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)表明，乳腺癌中過(guò)表達(dá)MEG3通過(guò)PI3K/AKT通路下調(diào)miR-21，從而抑制乳腺腫瘤的發(fā)生[20]。在43%-70%的乳腺癌腦轉(zhuǎn)移患者中，存在PI3K/AKT/mTOR通路的激活突變。Franziska等人在體內(nèi)和體外的研究中發(fā)現(xiàn)，AKT抑制劑可降低PIK3CA突變型乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞的細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；其次，與PIK3CA野生型模型相比，顯著抑制了PIK3CA突變腫瘤的生長(zhǎng)，并顯著改善了生存[21]。這進(jìn)一步表明PI3K/AKT通路將會(huì)是一種有前景的治療靶點(diǎn)。

乳腺癌常被分為以下4種亞型，LuminalA亞型、LuminalB亞型、HER2過(guò)表達(dá)亞型以及三陰性導(dǎo)管亞型[22]。在乳腺癌的治療中，雖然激素治療和HER2靶向治療分別對(duì)ER+、HR+和HER2+的乳腺癌產(chǎn)生了較好的治療效果，但是對(duì)于三陰性乳腺癌還沒(méi)有確定的靶向藥物。即使PARP抑制劑可應(yīng)用于BRCA突變?nèi)橄侔?，但其在治療三陰性乳腺癌中的價(jià)值仍需要進(jìn)一步研究。轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌是乳腺癌癥中預(yù)后最差的一種，目前認(rèn)為免疫療法、PARP抑制劑和PI3K/AKT通路靶向抑制劑可用于它的治療，從而改善患者的生存率[23]。

3.3 BRCA2基因介導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路上調(diào)ATM基因抑制乳腺癌BT474細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

人類ATM基因編碼的蛋白屬于磷脂酰肌醇激酶樣激酶(PI3KKs)家族，功能區(qū)是磷脂酰肌醇3激酶，主要參與 DNA損傷反應(yīng)和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)通路。PI3K/AKT和p53通路是乳腺癌細(xì)胞中兩個(gè)重要的調(diào)節(jié)通路，PI3K/AKT的激活和p53通路的抑制會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。當(dāng)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，此時(shí)AKT通過(guò)介導(dǎo)MDM2靶向抑制p53水平，促進(jìn)乳腺癌發(fā)生[24]。ATM-Chk2通路對(duì)基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要，DNA損傷會(huì)導(dǎo)致ATM磷酸化，進(jìn)而激活Chk2活化下游底物，如P53通路，因此其突變可能導(dǎo)致多種腫瘤易感性增加，其中就包括遺傳性乳腺癌[25]。PI3K/AKT信號(hào)通路的活化可以加速細(xì)胞周期進(jìn)程，會(huì)促使DNA損傷的細(xì)胞也進(jìn)入有絲分裂，主要是因?yàn)镻I3K/AKT可磷酸化DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)激酶CHK1的位點(diǎn)，從而使CHK1遠(yuǎn)離ATM，導(dǎo)致DNA損傷檢測(cè)功能的降低，那么PI3K/AKT的去磷酸和失活可能會(huì)提高ATM的抑癌功能[26]。因此，我們認(rèn)為ATM的表達(dá)和P53通路以及PI3K/AKT信號(hào)通路的變化密切相關(guān)，以此幫助調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，維持細(xì)胞內(nèi)基因組穩(wěn)態(tài)。

PALB2也屬于乳腺癌易感基因，最初被鑒定為一種與BRCA2互相作用的蛋白，隨后也被證明與BRCA1相互作用，對(duì)BRCA基因組功能至關(guān)重要， 其單等位基因缺失突變會(huì)使患乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加，而且這種風(fēng)險(xiǎn)可能與攜帶BRCA2突變患病風(fēng)險(xiǎn)重疊[27]。Rad51在乳腺癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)，作用于損傷的單鏈DNA形成核蛋白絲，介導(dǎo)雙鏈DNA之間的鏈間轉(zhuǎn)移修復(fù)，Rad51蛋白和多種腫瘤抑制蛋白相互作用，包括p53、BRCA1和BRCA2[28]。ATM、PALB2、Rad51為同源重組修復(fù)通路相關(guān)蛋白，參與并協(xié)同BRCA2抑癌作用，共同維護(hù)基因組的穩(wěn)定。當(dāng)DNA受損時(shí)，可刺激ATM活化，此時(shí)同源重組修復(fù)通路被激活，各個(gè)細(xì)胞周期檢測(cè)機(jī)制發(fā)揮作用使G1/S、S、G2/M期阻滯，開(kāi)始DNA損傷修復(fù)，ATM使BRCA2的伙伴和定位者PALB2磷酸化，PALB2則通過(guò)其氨基和羧基末端獨(dú)立地與BRCA1和BRCA2相互作用，促進(jìn)RAD51核蛋白絲的穩(wěn)定，而B(niǎo)RCA1相關(guān)環(huán)域蛋白1 (BARD1)與BRCA1形成穩(wěn)定的異源二聚體，提高 BRCA1的活性，促進(jìn)同源重組修復(fù)通路的激活[29]。有一些相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ATM、Rad51、PALB2影響乳腺癌細(xì)胞周期，比如青蒿琥酯通過(guò)激活A(yù)TM可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞G2/M期的阻滯[30]，Rad51的下調(diào)可以使乳腺癌細(xì)胞在G2/M期阻滯[31]，而B(niǎo)RCA1、PALB2和BRCA2組成了BRCA1-PALB2-BRCA2軸，在檢查點(diǎn)激活和檢查點(diǎn)維護(hù)中都發(fā)揮重要作用，尤其是G2/M檢查點(diǎn)[32]。大部分研究都是在單基因的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)去觀察這幾個(gè)基因在腫瘤細(xì)胞的作用方式，還有一些綜述在基因?qū)W方面分析它們的互相聯(lián)系和在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制，很少有報(bào)道將以上幾個(gè)基因結(jié)合起來(lái)，利用細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)去更詳細(xì)地驗(yàn)證它們的關(guān)系以及在乳腺癌細(xì)胞中的功能。在本實(shí)驗(yàn)中，免疫組化結(jié)果顯示在人乳腺癌組織中，BRCA2和ATM蛋白表達(dá)同時(shí)升高，而且都呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。Western blot結(jié)果清楚地顯示BRCA2過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染乳腺癌BT474細(xì)胞后，其表達(dá)量上升，而且ATM、PALB2、Rad51相關(guān)蛋白的條帶也相應(yīng)顯現(xiàn)。與兩個(gè)對(duì)照組相比，BRCA2表達(dá)量增加的同時(shí)，以上幾個(gè)蛋白表達(dá)量也同時(shí)增加，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了BRCA2基因過(guò)表達(dá)的真核表達(dá)載體，也初步驗(yàn)證ATM、PALB2、Rad51和BRCA2蛋白共同參與同源重組修復(fù)通路。

在Yasir團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中[33]，通過(guò)體外模型，發(fā)現(xiàn)抑制PI3K通路可以降低三陰性乳腺癌細(xì)胞BRCA1/2的表達(dá)，同時(shí)獲得PARP激活的產(chǎn)物蛋白，這表明抑制PI3K會(huì)損傷同源重組修復(fù)通路。在一項(xiàng)關(guān)于他莫昔芬耐藥乳腺癌細(xì)胞的研究中[34]，發(fā)現(xiàn)耐他莫昔芬的乳腺癌細(xì)胞中磷酸化AKT的表達(dá)明顯高于對(duì)照組細(xì)胞，且BARD1/BRCA1表達(dá)上調(diào)，認(rèn)為耐他莫昔芬的乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療產(chǎn)生耐藥是因?yàn)镻I3K/AKT通路激活導(dǎo)致BARD1和BRCA1上調(diào)，BARD1/BRCA1的降低會(huì)使他莫昔芬耐藥的乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物重新敏感。因此，我們考慮PI3K/AKT信號(hào)通路和同源重組修復(fù)通路互相聯(lián)系，互相影響，進(jìn)一步推測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路和本實(shí)驗(yàn)研究的BRCA2目的基因有潛在作用通路。

為了驗(yàn)證ATM是否介導(dǎo)BRCA1的磷酸化，Li[35]等使用siRNA干擾的ATM和其抑制劑作用于人乳腺癌MCF-10A細(xì)胞，如預(yù)期猜想一樣，在紫外線損傷的MCF-10A細(xì)胞中，siRNA干擾的ATM會(huì)顯著降低細(xì)胞中BRCA1的磷酸化和p53的乙酰化，表明 ATM介導(dǎo)了人乳腺上皮細(xì)胞中DNA損傷引起的BRCA1磷酸化和p53功能。本實(shí)驗(yàn)在BRCA2基因過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至乳腺腫瘤細(xì)胞后，使用CCK8和流式細(xì)胞儀，觀察到了BRCA2抑制乳腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、促進(jìn)凋亡的現(xiàn)象，Transwell和愈合實(shí)驗(yàn)表明BRCA2基因抑制乳腺腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲，進(jìn)一步證明BRCA2對(duì)乳腺癌有抑制效應(yīng)。鑒于BRCA2和BRCA1基因在同源重組修復(fù)通路中是協(xié)同作用，而且PI3K/AKT和ATM以及BRCA2在乳腺癌的發(fā)展和后續(xù)治療中是互相影響的，因此我們推測(cè)，ATM基因可通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)BRCA2的磷酸化，進(jìn)一步影響人乳腺癌細(xì)胞的存活和凋亡。

綜上所述，BRCA2 作為一種重要的抑癌基因，可抑制乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究通過(guò)構(gòu)建 BRCA2基因過(guò)表達(dá)真核載體，發(fā)現(xiàn) BRCA2 基因過(guò)表達(dá)后可同時(shí)上調(diào)ATM、Rad51、PALB2蛋白的表達(dá)，抑制乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。本研究闡述了BRCA2基因和PI3K/AKT信號(hào)通路以及同源重組修復(fù)通路的關(guān)系，進(jìn)一步探究ATM基因和BRCA2基因的互相作用機(jī)制，認(rèn)為BRCA2基因通過(guò)PI3K/AKT通路上調(diào)ATM抑制乳腺癌的增殖、遷移和侵襲。今后，我們將進(jìn)一步完成PI3K/AKT抑制劑處理乳腺癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，探究 BRCA2 基因突變后乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的具體機(jī)制，以進(jìn)一步確認(rèn)BRCA2基因介導(dǎo) PI3K/AKT 信號(hào)通路以及其他信號(hào)通路靶向ATM基因，在乳腺癌中發(fā)揮關(guān)鍵作用的過(guò)程。由此發(fā)現(xiàn)更多基因水平的藥物靶點(diǎn)，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床中BRCA2 相關(guān)性乳腺癌的診斷，達(dá)到精準(zhǔn)有效的個(gè)體化靶向治療。