劉曉娟，謝雙雙，張 晶，康燕華

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河北 張家口075002)

宮頸癌是女性排名第三位的最常見的婦科惡性腫瘤，也是引起癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。隨著宮頸細胞學(xué)和宮頸病理活檢技術(shù)的發(fā)展，早期和局部晚期癌癥可以更早、更準(zhǔn)確的被檢測，宮頸癌的預(yù)后在最近的第2、3年中得到了顯著改善，但是宮頸癌的發(fā)病機制尚不清楚，并且5年生存率仍不能令人滿意[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的一段RNA，miRNA可通過堿基配對的方式特異性的與靶基因的信使RNA結(jié)合(message RNA，mRNA)，轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達從而參與腫瘤的發(fā)展[3]。一項最新的研究顯示miR-138的水平與宮頸癌患者化療敏感性有關(guān)，但是關(guān)于miR-138在宮頸癌中的作用機制尚不清楚[4]。miRNA 的功能又受到長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)的靶向調(diào)控，LncRNA會通過“海綿”的吸附方式影響miRNA對mRNA的靶向作用[5]。LINC00665是一種新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤密切相關(guān)的LncRNA，在肝細胞癌中，LINC00665可通過靶向miR-186-5p調(diào)節(jié)MAP4K3蛋白的表達發(fā)揮促癌作用[6]。本文主要分析LINC00665通過靶向miR-138/AKT1調(diào)節(jié)宮頸癌細胞增殖和抑制凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

人宮頸癌Hela細胞系(ATCC公司，美國)。DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司，美國)。miR-138類似物(mimic)、LINC00665和AKT1過表達質(zhì)粒以及相應(yīng)的陰性對照(negative control，NC)(Thermo Fisher公司，美國)。Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國)。雙熒光素酶報告試劑盒和相應(yīng)的1000 System熒光檢測儀(Promega公司，美國)。細胞計數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)試劑盒和結(jié)晶紫染色試劑盒(Beyotime生物技術(shù)研究所，中國)。凋亡檢測試劑盒和FACSCalibur TM流式細胞儀(BD Biosciencesg公司，美國)。PCR引物由Genewiz公司(中國)設(shè)計和合成。Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)。逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR試劑盒(Roche公司，瑞士)。ABI 7500 PCR檢測系統(tǒng)(Life technology公司，美國)。AKT1、GAPDH抗體和二抗(Abcam公司，美國)。PVDF膜(Bio-Rad公司，美國)。雌性C57BL/6小鼠購自西安交通大學(xué)實驗動物中心。

1.2 生物信息學(xué)分析

通過工具網(wǎng)站Kaplan-Meier Plotter分析TCGA數(shù)據(jù)庫中宮頸癌患者miR-138水平與生存之間的關(guān)系，預(yù)測LINC00665靶向miR-138和miR-138靶向AKT1的結(jié)合位點。

1.3 雙熒光素酶報告實驗

將細胞分為NC組和mimic組，并分別通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NC和miR-138 mimic。在驗證miR-138靶向AKT1時，分別將野生型的AKT1(AKT1-wt)或突變的AKT1(AKT1-mut)克隆到pMIR-REPORT熒光素酶載體中。在驗證LINC00665時靶向miR-138時，分別將LINC00665-wt和LINC00665-mut克隆到pMIR-REPORT熒光素酶載體中。將Hela細胞接種在6孔板中，然后使用Lipofectamine 2000將克隆和突變的序列轉(zhuǎn)染至細胞中。使用熒光素酶報告檢測儀評估熒光素酶活性。

1.4 qPCR檢測LINC00665D、miR-138和AKT1 mRNA

通過Trizol獲得細胞中總RNA并檢測濃度和純度。使用cDNA試劑盒將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(42℃ 60 min，70℃ 5 min，然后4℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix進行qPCR實驗(在95℃ 10 min，40個循環(huán)，94℃ 15 s，60℃ 1 min， 60℃ 1 min，4℃保存)。比較循環(huán)閾值(ΔΔCt)用于分析RNA的表達。GAPDH和U6表達用于標(biāo)準(zhǔn)化計算。

1.5 Western blot檢測AKT1 蛋白的表達

將細胞裂解后收集總蛋白，并檢測蛋白純度和濃度。使用10%的SDS-PAGE進行電泳實驗分離蛋白，90 V電壓下進行120 min。然后使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜并在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h。分別加AKT1和GAPDH抗體(稀釋1∶1 000)室溫震蕩2 h，后在4℃孵育過夜，加入二抗(稀釋1∶5 000)，孵育 3 h。以GAPDH為內(nèi)參，通過Quantity One軟件分析條帶的灰度值并計算目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達量。

1.6 細胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染

將Hela細胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃ 5% CO2，相對濕度100%。將細胞分為4組，即對照組、mimic組、mimic+LINC00665組和LINC00665組。使用Lipofectamine 2000試劑盒進行瞬時轉(zhuǎn)染，其中mimic組和mimic+LINC00665組通過轉(zhuǎn)染miR-138 mimic質(zhì)粒以過表達miR-138，mimic+LINC00665組和LINC00665組轉(zhuǎn)染AKT1質(zhì)粒過表達AKT1。對照組轉(zhuǎn)染兩種NC質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染24 h 后收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.7 CCK-8檢測細胞活力

將2×104個細胞接種于96孔板，在培養(yǎng)第24 h、48 h和72 h加入10 μl CCK-8試劑并在37℃培養(yǎng)，通過酶標(biāo)儀450 nm處的光密度計算相對細胞活力。

1.8 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

取消化后的2×105個細胞，分別加入FITC Annexin V和碘化丙啶(PI)10 μl和5 μl，然后室溫、避光下分別孵育15 min，然后通過進行流式細胞術(shù)，通過配套Cell Quest軟件分析凋亡率。

1.9 荷瘤裸鼠實驗

將9只BALB/c裸鼠隨機分為3組，即對照組、miR-138組和miR-138+LINC00665組，每組3只。根據(jù)1.6的方法分別制備NC轉(zhuǎn)染的、miR-138 mimic轉(zhuǎn)染的、miR-138和LINC00665共轉(zhuǎn)染的Hela細胞。分別將3組細胞制成0.2 ml的細胞懸液(6×106個)，皮下注射。當(dāng)對照組小鼠瘤體生長至約1 000 mm3時處死小鼠，取出瘤體檢測腫瘤體積和質(zhì)量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗設(shè)立3個復(fù)孔。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。 統(tǒng)計分析使用SPSS 19軟件。 進行單因素方差分析，兩兩比較使用t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果

在TCGA數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)Kaplan-Meier Plotter分析結(jié)果，miR-138高表達的患者的生存率顯著高于miR-138低表達患者(P<0.05)，見圖1。

圖1 Kaplan-Meier Plotter分析TCGA數(shù)據(jù)庫中不同miR-138水平宮頸癌患者生存曲線

2.2 LINC00665直接靶向miR-138

LINC00665靶向miR-138的結(jié)合位點見圖2。然后通過雙熒光霉素實驗結(jié)果驗證了同時轉(zhuǎn)染miR-138 mimic和LINC00665-wt的細胞的熒光酶素活性顯著降低(P<0.05)，見表1，說明LINC00665直接靶向miR-138。

圖2 LINC00665直接靶向miR-138的結(jié)合位點

表1 LINC00665直接靶向miR-138的雙熒光素酶報告結(jié)果(相對熒光強度)

2.3 miR-138靶向抑制AKT1

miR-138靶向AKT1的結(jié)合位點見圖3。然后通過雙熒光霉素實驗結(jié)果驗證了同時轉(zhuǎn)染miR-138 mimic和AKT1-wt的細胞的熒光酶素活性顯著降低(P<0.05)，見表2，說明miR-138直接靶向AKT1。并且進一步研究也發(fā)現(xiàn)與NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-138 mimic后，細胞中AKT1 mRNA和蛋白的水平顯著降低(P<0.05)，見表2。

圖3 miR-138直接靶向AKT1的結(jié)合位點

表2 miR-138直接靶向AKT1的雙熒光素酶報告結(jié)果以及兩組AKT1 mRNA和蛋白的水平(相對熒光強度)

2.4 各組細胞中LINC00665、miR-138、AKT1 mRNA和蛋白的水平

Mimic組的miR-138水平顯著高于對照組，LINC00665、AKT1 mRNA和蛋白水平顯著低于對照組(P<0.05)。LINC00665組miR-138水平顯著低于對照組，LINC00665、AKT1 mRNA和蛋白水平顯著高于對照組(P<0.05)。Mimic+LINC00665組的miR-138水平顯著低于Mimic組，LINC00665、AKT1 mRNA和蛋白水平顯著高于mimic組(P<0.05)。miR-138對AKT1的抑制作用被LINC00665阻斷，見表3。

表3 各組細胞中LINC00665、miR-138、AKT1 mRNA和蛋白的水平

2.5 各組細胞的細胞生長情況比較

在第48 h和72 h，mimic組的細胞活力顯著低于對照組(P<0.05)，LINC00665組的細胞活力顯著高于對照組(P<0.05)，并且Mimic+LINC00665組的細胞活力顯著高于Mimic組(P<0.05)，過表達LINC00665會部分逆轉(zhuǎn)miR-138對細胞生長的抑制作用，見表4。

表4 各組細胞的相對細胞活力比較(%)

2.6 各組細胞凋亡情況比較

Mimic組的細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05)，LINC00665組的細胞凋亡率顯著低于對照組(P<0.05)，并且Mimic+LINC00665組的細胞凋亡率顯著低于Mimic組(P<0.05)。過表達LINC00665會逆轉(zhuǎn)miR-138對細胞凋亡的促進作用，見圖4和表5。

圖4 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率

表5 各組細胞凋亡率比較

2.7 各組小鼠皮下腫瘤的體積和質(zhì)量比較

miR-138組荷瘤裸鼠的腫瘤體積和質(zhì)量均顯著低于對照組(P<0.05)，miR-138+LINC00665組腫瘤體積和質(zhì)量顯著高于miR-138組(P<0.05)，見圖5和表6。

圖5 荷瘤裸鼠實驗檢測LINC00665和miR-138對腫瘤生長的影響

表6 各組小鼠腫瘤體積和質(zhì)量比較

3 討論

宮頸癌是婦科最常見的腫瘤之一，2018年的一項癌癥統(tǒng)計顯示全世界有570 000例新的宮頸癌病例，約有311 000例死于這種疾病[7]。盡管許多早期診斷宮頸癌的新生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，并且靶向療法、免疫療法等新的治療手段被不斷地應(yīng)用于宮頸癌的治療，但由于腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和獲得性耐藥的發(fā)生，宮頸癌的5年總生存率仍然很差。探究宮頸癌發(fā)生、進展的分子機制，是提高早期的臨床診斷，并發(fā)現(xiàn)宮頸癌癌的新治療策略和靶標(biāo)的重要手段。

最新研究顯示LncRNA、miRNA以及靶基因的mRNA的調(diào)控途徑在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。miRNA是一系列小分子非編碼單鏈RNA，由22個核苷酸組成，它可以識別并通過堿基配對的方式與mRNA結(jié)合并誘導(dǎo)mRNA降解或翻譯抑制[8]。LncRNA是一類長鏈RNA，其長度超過200個核苷酸，不具有蛋白質(zhì)翻譯功能。LncRNA可以通過競爭內(nèi)源性RNA的方式作為“海綿”miRNA，從而調(diào)節(jié)miRNA在mRNA降解和翻譯中的作用[9]。在LncRNA-miRNA-mRNA途徑中，miRNA是關(guān)鍵，但是miRNA種類繁多，從中尋找一種有意義的miRNA難度較大。生物信息學(xué)和人類基因組學(xué)的發(fā)展在一定程度上解決了這一問題，TCGA數(shù)據(jù)庫收錄了全球30多種腫瘤的標(biāo)本，并通過基因探針的方式對人類基因組轉(zhuǎn)錄水平進行了檢測，然后通過生物信息學(xué)方法分析不同基因的表達特點[10]。我們首先通過Kaplan-Meier Plotter分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中miR-138與宮頸癌患者生存率的關(guān)系，結(jié)果顯示miR-138高表達的患者的生存率顯著高于miR-138低表達患者，提示miR-138在宮頸癌中可能發(fā)揮抑癌作用。并且通過預(yù)測和雙熒光素酶報告驗證了miR-138靶向抑制AKT1 mRNA和蛋白的表達。AKT1是PI3K/AKT通路中的重要蛋白，并且過往研究已經(jīng)證實了AKT1具有促進宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲以及耐藥的作用[11-12]。這些結(jié)果顯示miR-138可能通過靶向抑制AKT1發(fā)揮抑癌作用。一項最新研究顯示miR-138可通過靶向抑制sirt-1調(diào)控肺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[13]。并且miR-138在結(jié)直腸癌、膀胱癌、前列腺癌中均發(fā)揮抑癌作用[14-16]。國內(nèi)一項研究顯示miR-138的表達與宮頸癌患者化療敏感性有關(guān)，但是miR-138-5p對宮頸癌細胞生物學(xué)行為的影響尚不明確，關(guān)于LncRNA對miR-138靶向調(diào)控AKT1的作用也不清楚。

LINC00665可以通過靶向miR-149-3p調(diào)控RNF2促進胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[17]。本次研究結(jié)果也顯示LINC00665可直接靶向miR-138。為進一步分析LINC00665和miR-138對宮頸癌細胞的影響，我們將Hela細胞分為對照組、Mimic組、Mimic+LINC00665組和LINC00665組。結(jié)果顯示過表達LINC00665顯著抑制了miR-138的表達，并且阻斷了miR-138對AKT1的抑制作用，說明LINC00665可通過靶向miR-138促進AKT1的表達。進一步的研究結(jié)果也顯示了Mimic組的細胞活力顯著低于對照組，細胞凋亡率顯著高于對照組，LINC00665組的細胞活力顯著高于對照組，細胞凋亡率顯著低于對照組。Mimic+LINC00665組的細胞活力顯著高于Mimic組，細胞凋亡率顯著低于Mimic組。miR-138會抑制Hela細胞生長并促進細胞凋亡，而LINC00665會通過靶向miR-138阻斷miR-138對細胞的抑制作用。體內(nèi)實驗也顯示了miR-138組荷瘤裸鼠的腫瘤體積和質(zhì)量均顯著低于對照組，miR-138+LINC00665組腫瘤體積和質(zhì)量顯著高于miR-138組。這說明了LINC00665通過靶向miR-138參與宮頸癌的進展。

綜上所述，miR-138靶向抑制AKT1的表達，LINC00665直接靶向miR-138，并且可通過靶向miR-138促進AKT1的表達。LINC00665通過靶向調(diào)控miR-138/AKT1促進Hela細胞的增殖并抑制凋亡。但是關(guān)于LINC00665通過miR-138/AKT1對宮頸癌的影響尚不清楚，并且關(guān)于LINC00665和miR-138在宮頸癌患者中的臨床意義也需要進一步研究。