于 利，張 明,王 迪

(盤錦市中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 盤錦124000)

宮頸癌屬于婦科常見惡性腫瘤，隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，我國宮頸癌發(fā)病率逐年上升，臨床采用手術(shù)、放療等治療宮頸癌，但治療效果不佳，患者5年生存率較低[1-2]。目前宮頸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機制尚未闡明，因而探究宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制有助于提高治療效果及改善患者預(yù)后。微小RNA(microRNA，miRNA)可通過調(diào)控下游靶基因表達(dá)從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為，并可影響宮頸癌等腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程[3-4]。微小RNA-4465(microRNA-4465，miR-4465)在結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤呈表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-4465表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5-6]。但miR-4465在宮頸癌發(fā)生過程中的調(diào)控機制尚未闡明。生物信息學(xué)分析顯示核轉(zhuǎn)運蛋白基因α2(karyopherin subunit alpha 2，KPNA2)可能是miR-4465的靶基因，研究表明KPNA2在舌鱗癌中表達(dá)上調(diào)，沉默KPNA2表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲[7]。但miR-4465是否可通過靶向KPNA2而參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程尚未可知。本研究主要分析宮頸癌組織中miR-4465、KPNA2的表達(dá)，探討miR-4465、KPNA2在宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲過程中的作用機制，旨在為進(jìn)一步揭示宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宮頸癌細(xì)胞株Hela購自美國ATCC細(xì)胞庫;杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher公司；Lipofectamine2000購自上海潤成生物科技有限公司；miR-4465寡核苷酸模擬物(miR-4465 mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、miR-4465特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-4465)及其陰性對照(anti-miR-NC)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；KPNA2小干擾RNA(si-KPNA2)、亂序無意義陰性序列(si-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA3.1購自上?？吕咨锟萍加邢薰?；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；雙熒光素酶報告基因載體與熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega公司；RIPA裂解液購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白免疫印跡(Western blot)實驗所需試劑購自上海生工生物工程股份有限公司；兔抗人KPNA2抗體購自上海安妍生物有限公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白1(CyclinD1)、p21抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

宮頸癌組織及癌旁組織標(biāo)本來源：收集2017年3月至2018年12月于本院診治的80例宮頸癌患者為研究對象，所有患者均經(jīng)病理證實為宮頸癌，年齡50-70歲，平均年齡(65.24±7.15)歲，術(shù)前所有患者均未接受放療或化療，術(shù)中切取宮頸癌組織及癌旁組織(≥5 cm)，將組織標(biāo)本置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

宮頸癌細(xì)胞Hela置于含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合度達(dá)到70%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)期Hela細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞生長融合度達(dá)到70%時將培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基，分別將miR-NC、miR-4465 mimics、si-NC、si-KPNA2、miR-4465與pcDNA、miR-4465 mimics與pcDNA-KPNA2轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，分別記作miR-NC組、miR-4465組、si-NC組、si-KPNA2組、miR-4465+pcDNA組、miR-4465+pcDNA-KPNA2組，參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)基更換為含有血清的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測miR-4465、KPNA2 mRNA的表達(dá)水平

采用Trizol法提取宮頸癌組織、癌旁組織與各組Hela細(xì)胞中的總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度。miR-4465正向引物5’-CTCAAGTAGTCTGAC-3’，反向引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；KPNA2正向引物5’-CAACAAGAATCCTGCACCCC-3’，反向引物5’-GCAGGAGTCACAATTGGCAA-3’；U6正向引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACT-3’，反向引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；GAPDH正向引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，反向引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備反轉(zhuǎn)錄體系，反應(yīng)條件：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μl，MgSO42.5 μl，dNTPs 2.5 μl，正反向引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，RNase-Free ddH2O補足體系至25 μl；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95℃ 變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40次循環(huán)。miR-4465以U6為內(nèi)參，KPNA2以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-4465、KPNA2 mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.3雙熒光素酶報告基因檢測miR-4465的靶基因

StarBase預(yù)測顯示KPNA2的3’UTR含有miR-4465的互補序列，將結(jié)合位點與突變位點分別插入熒光素酶報告基因載體分別構(gòu)建野生型載體WT-KPNA2、突變型載體MUT-KPNA2，分別將WT-KPNA2、MUT-KPNA2與miR-NC、miR-4465 mimics共轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照熒光素酶活性檢測試劑盒檢測各組熒光素酶活性。按照Lipofectamine2000試劑說明書分別將miR-NC、miR-4465 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-4465轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，Western blot法檢測各組細(xì)胞中KPNA2蛋白相對表達(dá)量。

1.2.4MTT檢測細(xì)胞增殖

收集各組對數(shù)期Hela細(xì)胞(密度3×104個/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)，每組設(shè)置3個復(fù)孔，每孔加入20 μl的MTT溶液(濃度5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，室溫振蕩孵育5 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值(OD)。實驗重復(fù)3次。

1.2.5Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移及侵襲

細(xì)胞遷移實驗：收集各組對數(shù)期Hela細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度3×104個/ml，接種于Transwell小室的上室(200 μl/孔)，按照每孔600 μl的密度將含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液加入Transwell小室的下室，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌，多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實驗：預(yù)冷培養(yǎng)基按照8∶1的比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠，按照每孔40 μl的密度將Matrigel基質(zhì)膠加入Transwell小室的上室，37 ℃培養(yǎng)箱孵育5 h，同時將各組對數(shù)期Hela細(xì)胞按照每孔200 μl的密度接種于Transwell小室的上室，后續(xù)實驗步驟同細(xì)胞遷移實驗，顯微鏡下觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.6Western blot檢測KPNA2、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表達(dá)

取凍存宮頸癌組織、癌旁組織與轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞，加入400 μl RIPA裂解液，冰浴15 min，4 ℃條件下經(jīng)3 000 r/min離心15 min，吸取上清。采用BCA法測定蛋白濃度，取40 μg蛋白樣品加入SDS上樣緩沖液，高溫煮沸15 min，蛋白變性。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗稀釋液(KPNA2稀釋比1∶800，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21稀釋比1∶1 000)，4 ℃孵育24 h，TBST洗滌，孵育二抗稀釋液(稀釋比1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，暗室內(nèi)曝光顯影后應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-4465和KPNA2在宮頸癌組織中的表達(dá)

qRT-PCR與Western blot檢測結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，宮頸癌組織中miR-4465的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，KPNA2 mRNA及蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 KPNA2蛋白表達(dá)

表1 miR-4465和KPNA2在宮頸癌組織中的表達(dá)

2.2 miR-4465靶向調(diào)控KPNA2的表達(dá)

StarBase預(yù)測顯示miR-4465與KPNA2存在結(jié)合位點，見圖2A。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型載體WT-KPNA2的細(xì)胞實驗中，miR-4465組熒光素酶活性顯著低于miR-NC組(P<0.05)；轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-KPNA2的細(xì)胞實驗中，miR-4465組熒光素酶活性與miR-NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。Western blot檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-4465組KPNA2蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-4465組KPNA2蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見圖2B、表3。

圖2 miR-4465靶向調(diào)控KPNA2

表2 雙熒光素酶報告實驗

表3 miR-4465調(diào)控KPNA2蛋白表達(dá)

2.3 miR-4465過表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響

與miR-NC組相比，miR-4465組細(xì)胞增殖活力顯著降低(P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，p21蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見圖3、表4。

圖3 增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表4 miR-4465過表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響

2.4 干擾KPNA2表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響

與si-NC組相比，si-KPNA2組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，p21蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見圖4、表5。

圖4 KPNA2和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 干擾KPNA2表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響

2.5 KPNA2過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-4465過表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用

實驗結(jié)果顯示，與miR-4465+pcDNA組相比，miR-4465+pcDNA-KPNA2組細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，p21蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見圖5、表6。

圖5 KPNA2和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表6 KPNA2過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-4465過表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用

3 討論

宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程與多種基因、信號通路異常有關(guān)，既往研究顯示miRNA在宮頸癌中表達(dá)異常，并可通過調(diào)控靶基因表達(dá)從而影響宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)過程[8-9]。但仍有部分miRNA在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制尚未闡明。因而本研究積極探尋新型miRNA，通過生物學(xué)信息分析miRNA的靶基因并進(jìn)行驗證，探討miRNA與靶基因在宮頸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中的作用機制。

miR-4465在卵巢癌中表達(dá)下調(diào)，長鏈非編碼RNA SNHG6(LncRNA SNHG6)可通過競爭性結(jié)合miR-4465從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖及遷移[10]。研究表明miR-4465可通過調(diào)控靶基因表達(dá)從而參與非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程[11-12]。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示miR-4465在宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)，提示miR-4465表達(dá)量降低可能促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生。本研究通過生物學(xué)信息分析與雙熒光素酶報告實驗證實KPNA2是miR-4465的靶基因，研究表明KPNA2表達(dá)量升高可促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌、肝癌細(xì)胞生長[13-14]。相關(guān)報道指出KPNA2還可參與口腔鱗癌發(fā)生及發(fā)展過程[15]。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示KPNA2在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，提示KPNA2在宮頸癌發(fā)生過程中可能發(fā)揮癌基因作用。

本研究進(jìn)一步探討miR-4465、KPNA2在宮頸癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機制，采用體外細(xì)胞實驗進(jìn)行驗證，miR-4465過表達(dá)后宮頸癌細(xì)胞增殖活力顯著降低，遷移與侵襲能力明顯減弱，提示miR-4465過表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。研究表明CyclinD1可與細(xì)胞周期依賴蛋白激酶4(CDK4)結(jié)合形成復(fù)合體從而正向調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，p21可抑制CyclinD1與CDK4結(jié)合從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G1期，抑制細(xì)胞增殖[16]?；|(zhì)金屬蛋白酶可降解細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜等，增強腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，MMP-2、MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶，研究表明MMP-2、MMP-9在宮頸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)并可促進(jìn)細(xì)胞遷移及侵襲[17]。本研究結(jié)果顯示miR-4465過表達(dá)后CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)量顯著降低，p21表達(dá)量顯著升高，干擾KPNA2表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用與miR-4465過表達(dá)后的作用相同，提示miR-4465過表達(dá)或干擾KPNA2表達(dá)可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。同時本研究結(jié)果顯示KPNA2過表達(dá)可明顯減弱miR-4465過表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用，提示miR-4465過表達(dá)可能通過下調(diào)KPNA2的表達(dá)從而降低宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。

綜上所述，miR-4465可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，其作用機制與miR-4465靶向調(diào)控KPNA2的表達(dá)有關(guān)，可為揭示宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制提供新方向，miR-4465可能作為宮頸癌靶向治療的潛在靶點。