聞慶云，周香云，吳遠(yuǎn)雄

(阜陽(yáng)市第三人民醫(yī)院 精神科,安徽 阜陽(yáng)236000)

雙相情感障礙(bipolar disorder，BPD)是一種兼有輕躁狂或躁狂、抑郁發(fā)作的心境障礙，目前通常認(rèn)為環(huán)境因素、遺傳因素與其發(fā)病密切相關(guān)[1]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[2]，哺乳動(dòng)物大腦中葡萄糖代謝受損和線粒體功能障礙是導(dǎo)致BPD發(fā)病的直接因素，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatei-dylinositol 3 kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF1-a)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能在該病發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。近年來(lái)研究指出[3-4]，AKT1基因多態(tài)性與精神病發(fā)作的年齡相關(guān)，且可影響利培酮治療精神分裂癥的療效，但關(guān)于其遺傳位點(diǎn)多態(tài)性與BPD發(fā)病關(guān)聯(lián)的報(bào)道尚少。本研究選取110例BPD患者，分析AKT1基因多態(tài)性與其遺傳易感性的關(guān)系，為BPD的防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年10月-2020年10月阜陽(yáng)市第三人民醫(yī)院收治的110例BPD患者，設(shè)為BPD組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)精神科分會(huì)發(fā)布的《CCMD-3中國(guó)精神障礙分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)》中BPD診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，經(jīng)2位(或以上)副主任醫(yī)師以上職稱的精神科醫(yī)師確診；(2)自我或其直系親屬報(bào)告顯示均屬中國(guó)漢族血緣；(3)受試者之間不存在血緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)各種軀體疾病或腦器質(zhì)性疾病導(dǎo)致的精神障礙；(2)藥物治療導(dǎo)致的精神障礙；(3)精神發(fā)育遲滯；(4)合并嚴(yán)重軀體性疾?。?5)合并癲癇、腦卒中等神經(jīng)系統(tǒng)疾病；(6)妊娠期、哺乳期患者。另選取同期于阜陽(yáng)市第三人民醫(yī)院進(jìn)行體檢的110例健康受試者，設(shè)為健康組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)精神正常的健康人；(2)自我或其直系親屬報(bào)告顯示均屬中國(guó)漢族血緣。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)精神疾病家族史；(2)神經(jīng)系統(tǒng)疾病病史、家族史；(3)家族性遺傳病史；(4)妊娠期、哺乳期婦女。本研究開(kāi)展前已獲取醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1酚-氯仿法提取DNA[6]采集BPD組及健康組空腹肘部靜脈血5 ml，加入抗凝管，靜置分層后3 000 r/min，離心半徑12 cm離心15 min，收集上層血漿待用；取抗凝血0.5 ml，混合等量RIPA細(xì)胞裂解液，8 000 r/min，離心半徑8 cm離心10 min取沉淀，加入酚-氯仿混合液250 μl充分混勻，離心取上清液與等體積氯仿溶液混合，再次離心取上清，加入無(wú)水乙醇充分混勻，離心后棄上清，重復(fù)無(wú)水乙醇操作，室溫風(fēng)干，保存于-20℃?zhèn)溆?。采用紫外分光光度?jì)鑒定DNA濃度，確保各DNA樣本濃度基本保持一致。

1.2.2單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)選取 本研究AKT1基因的全序列由Pubmed核酸數(shù)據(jù)庫(kù)提供。AKT1基因位于14q32，全長(zhǎng)26 395 bp。選取5個(gè)SNP位點(diǎn)rs2494732、rs3001371、rs3803300、rs2498799、rs3730358作為BPD中AKT1基因多態(tài)性的研究位點(diǎn)。

1.2.3聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)檢測(cè)基因多態(tài)性[7]從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心下載AKT1基因標(biāo)準(zhǔn)序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件primer 5.0設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)5個(gè)AKT1基因SNP rs2494732、rs3001371、rs3803300、rs2498799、rs3730358多態(tài)性的引物序列,見(jiàn)表1。采用PCR擴(kuò)增試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)及TP700實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀(日本寶生物工程株式會(huì)社)擴(kuò)增目的片段，設(shè)置反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸60 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，獲取PCR產(chǎn)物。設(shè)置RELP反應(yīng)體系，DNA模板100 ng，dNTP 1 μM，上、下游引物各0.5 μM，Taq聚合酶10 U，Buffer緩沖液10倍稀釋，dd H2O補(bǔ)充至25 μl。取20 μl PCR產(chǎn)物采用Ampli Taq DNA聚合酶熒光標(biāo)記測(cè)序試劑盒(美國(guó)ABI公司)進(jìn)行純度及內(nèi)引物擴(kuò)增，并采用該公司PRISM 377-96 DNA自動(dòng)測(cè)試儀分析PCR產(chǎn)物序列，經(jīng)Chromas軟件鑒定基因型。由2人分別進(jìn)行判讀，重新檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本，基因分型成功率100%。

表1 AKT1基因多態(tài)性的引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用Logistic回歸分析法分析AKT1基因rs3730358多態(tài)性與BPD遺傳易感性關(guān)系，計(jì)算影響因素比值比(odds ratio，OR)及95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般人口學(xué)資料

對(duì)BPD組和健康組的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)分別進(jìn)行χ2檢驗(yàn)與t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示兩組間均無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明兩組性別、年齡、BMI相匹配，來(lái)自于同一群體,見(jiàn)表2。

表2 本研究所納入兩組受試者的基本信息與性別、年齡、BMI匹配情況

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)分析無(wú)血緣關(guān)系的BPD組與健康組，5個(gè)AKT1基因多態(tài)性位點(diǎn)中，除rs2494732外(χ2=13.240，P<0.001)，rs3001371、rs3803300、rs2498799、rs3730358位點(diǎn)基因型頻率實(shí)際值與理論值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律，表明本研究所選樣本可代表一般人群。

2.3 BPD組與健康組rs3001371、rs3803300、rs2498799、rs3730358基因多態(tài)性

BPD組與健康組rs3730358基因型等級(jí)分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；BPD組rs3730358 T等位基因頻率高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；BPD組與健康組rs3001371、rs3803300、rs2498799基因型等級(jí)分布及等位基因頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 BPD組與健康組rs3001371、rs3803300、rs2498799、rs3730358基因多態(tài)性比較[例(%)]

2.4 AKT1基因rs3730358多態(tài)性與BPD遺傳易感性關(guān)系

經(jīng)Logistic回歸分析，AKT1基因rs3730358位點(diǎn)C/C、C/T、T/T基因型及C、T等位基因可能是BPD遺傳易感性影響因素(P<0.05),見(jiàn)表4。

表4 AKT1基因rs3730358多態(tài)性與BPD遺傳易感性關(guān)系

3 討論

BPD是威脅人類健康的功能性精神障礙疾病，以較高的復(fù)發(fā)率為主要特征，且病程遷延。在當(dāng)前社會(huì)壓力逐漸增加的背景下，BPD患者數(shù)量持續(xù)增加，自殺率與犯罪率也隨之上升，影響社會(huì)安定[8]。目前BPD治療以鋰鹽、卡馬西平等心境穩(wěn)定劑為核心治療藥物，短期療效顯著，但仍面臨著易復(fù)發(fā)、易致殘等問(wèn)題，加之患者自控能力差、精神狀態(tài)異常、習(xí)慣發(fā)生改變、出現(xiàn)抵觸行為，治療難度進(jìn)一步增加。有關(guān)BPD的病因?qū)W研究一直是醫(yī)學(xué)界熱點(diǎn)。調(diào)查資料顯示[9]，BPD存在明顯的家族聚集現(xiàn)象。同時(shí)，經(jīng)典雙生子實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明遺傳是BPD發(fā)病的重要原因，多條染色體區(qū)域或候選基因與其發(fā)病有關(guān)[10-11]。當(dāng)BPD相關(guān)基因發(fā)生遺傳突變時(shí)，對(duì)應(yīng)氨基酸將發(fā)生改變，且可能會(huì)對(duì)編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成影響，導(dǎo)致其功能喪失。此外，BPD具有表型異質(zhì)性，其臨床表現(xiàn)多種多樣，而不同表型可能存在不同的分子遺傳學(xué)機(jī)制。因此，根據(jù)基因多態(tài)性探尋與BPD發(fā)生有關(guān)的遺傳易感性基因具有廣闊的前景。

AKT是一種高保守性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其作為PI3K信號(hào)通路下游關(guān)鍵效應(yīng)分子，具有維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、促細(xì)胞增殖、拮抗凋亡等生理功能[12]。活化的PI3K在細(xì)胞膜上生成3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidyl inositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3)，進(jìn)而與AKT結(jié)構(gòu)域結(jié)合，誘使AKT轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜上，磷酸化后進(jìn)入胞漿與細(xì)胞核中，發(fā)揮對(duì)應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。腫瘤、糖尿病、精神分裂癥等疾病中可見(jiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路異常，該通路過(guò)度激活可能是腫瘤發(fā)生及耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制之一[13-15]。然而在精神類疾病中，PI3K/AKT信號(hào)通路受到明顯抑制，導(dǎo)致中樞神經(jīng)元及海馬干細(xì)胞功能降低，從而誘發(fā)精神疾病如BPD發(fā)生。Jia等[16]研究顯示，3種抗雙極性藥物鋰鹽、卡馬西平、丙戊酸可通過(guò)調(diào)節(jié)原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路增加糖原含量，從而改善疾病癥狀。此外，有研究表明[17]，因精神疾病自殺患者的腦組織中，AKT表達(dá)明顯降低，采用抗精神病藥物處理圍絕經(jīng)期抑郁樣大鼠后，AKT表達(dá)明顯上調(diào)，且進(jìn)一步上調(diào)其表達(dá)可顯著增強(qiáng)抗精神病藥物療效。目前關(guān)于AKT1基因多態(tài)性與BPD遺傳易感性的研究尚少，本研究選取AKT1-rs3001371、rs3803300、rs2498799、rs3730358多態(tài)性位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，BPD組與健康組rs3730358基因型等級(jí)分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BPD組rs3730358 T等位基因頻率高于健康組，且經(jīng)Logistic回歸分析，rs3730358位點(diǎn)C/C、C/T、T/T基因型及C、T等位基因可能是BPD遺傳易感性影響因素，提示AKT1-rs3730358位點(diǎn)攜帶T等位基因者與BPD遺傳易感性關(guān)系密切，推測(cè)與rs3730358位點(diǎn)突變及神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放有關(guān)，進(jìn)而增加BPD易感性風(fēng)險(xiǎn)，然而關(guān)于該位點(diǎn)的文獻(xiàn)尚少，關(guān)于其具體功能仍需大量的后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，AKT1-rs3730358位點(diǎn)基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群BPD遺傳易感性關(guān)系密切。目前有報(bào)道并不支持AKT1是BPD的候選基因，例如Millischer等[18]人在瑞典BD患者中的報(bào)道指出，對(duì)全基因組關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)的分析未發(fā)現(xiàn)BPD與AKT1區(qū)域之間存在任何關(guān)聯(lián)，表明AKT1是否是BPD的候選基因仍存在爭(zhēng)議，本研究結(jié)果與其存在較大差異。BPD在不同區(qū)域、種族人群中存在遺傳上的異質(zhì)性，且其發(fā)生是多個(gè)不同基因的積累作用，而實(shí)際上單個(gè)基因所發(fā)揮的作用很小，同時(shí)BPD發(fā)生受到環(huán)境因素的影響。因此，即便證實(shí)某基因與BPD具有關(guān)聯(lián)性，也并不代表BPD的病因已被明確，尚需要尋找更大的樣本量，并進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)SNP研究。