董小敏 李睿 楊進(jìn) 李娜

(1.咸陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 咸陽 712000；2.咸陽市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，陜西 咸陽 712000；3.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571199)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指女性在40歲前由于某種原因出現(xiàn)卵巢功能衰竭，進(jìn)而出現(xiàn)閉經(jīng)、雌激素紊亂等癥狀的婦科疾病[1]。臨床調(diào)查顯示，POF發(fā)病率約為1%～3%，近年來隨著我國女性生活壓力的不斷增加，POF發(fā)病率逐年升高，給女性身心健康造成嚴(yán)重影響[2]。目前，臨床常采用激素替代或促排卵等方法治療POF，但不良反應(yīng)較多，復(fù)發(fā)率高，且可增加卵巢癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。研究顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)在抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡、修復(fù)受損卵巢組織方面發(fā)揮積極作用，且BMSCs易于獲得，在干細(xì)胞治療領(lǐng)域成為研究熱點(diǎn)[3-4]。近年來研究表明，POF卵巢組織與正常卵巢組織間存在多種差異表達(dá)的微小RNA(microRNA，miRNA)，其中miR-204-5p是表達(dá)上調(diào)最多的miRNA之一，在調(diào)節(jié)卵巢功能、雌激素分泌等方面發(fā)揮重要作用[5]。研究報(bào)道，轉(zhuǎn)染miRNA的BMSCs可提高抑制后細(xì)胞的存活能力，進(jìn)而改善治療效果[6]。目前，關(guān)于miR-204-5p對POF卵巢顆粒細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制方面研究尚少，本研究將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染低表達(dá)miR-204-5p的BMSCs注射至POF大鼠，評估沉默miR-204-5p及聯(lián)合BMSCs對POF大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響，并初步探討影響機(jī)制，為臨床POF治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取SPF級雌性Wistar大鼠，6周齡，體質(zhì)量180～200g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2019-0008，使用許可證號:SYXK(京)2019-0022。飼養(yǎng)條件為(26±2)℃恒溫、40%～60%濕度、12 h/12 h明暗交替環(huán)境中，自由飲水和進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)開始前所有大鼠均進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片檢查，篩選動情周期正常的75只大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑和儀器 含有大鼠miR-204-5p基因反義寡核苷酸序列(rno-ASO-miR-204-5p)的重組慢病毒載體(pLVX-shRNA2)，即LV-rno-ASO-miR-204-5p(由上海英駿生物技術(shù)有限公司測序及慢病毒包裝)，病毒滴度為1×109/mL。注射用順鉑(齊魯制藥有限公司，10 mg，批號H37021472)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)，BCA蛋白定量分析試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)，兔抗鼠絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)、B細(xì)胞淋巴瘤-2基因(B-cell lymphoma-2 gene，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 related X protein，Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine protease-3，Caspase-3)單抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(美國Abcam公司)；Elecys2010全自動化學(xué)發(fā)光分析儀(美國羅氏公司)，RM2235徠卡切片機(jī)(德國徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易公司)，7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，CheniDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BMSCs分離培養(yǎng)及鑒定 取3只大鼠脫頸處死，浸泡于75%酒精中，分離脛骨和股骨，注射器吸取含10%胎牛血清、100U/mL青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，反復(fù)沖洗骨髓腔，獲取骨髓腔細(xì)胞單細(xì)胞懸液，以體積比1∶1加入Percoll分離液，于2500 r/min離心3 min，離心半徑10 cm，取中間層單個(gè)核細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PBS)洗滌2次后，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿，細(xì)胞貼壁融合至75%左右進(jìn)行傳代，取第3代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞免疫表型。取第3代細(xì)胞，胰蛋白酶消化后重新接種，待細(xì)胞再次融合至80%時(shí)，分別加入成骨、成脂肪、成軟骨誘導(dǎo)液，后每2～3天換液1次，誘導(dǎo)培養(yǎng)至14 d，分別進(jìn)行茜素紅染色、油紅O染色及阿利新藍(lán)染色觀察。取符合BMSCs生物學(xué)特征的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 重組慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs 取第3代BMSCs細(xì)胞重新接種至96孔板，再次融合70%左右時(shí)，加入感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為20的慢病毒載體LV-rno-ASO-miR-204-5p，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BMSCs細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 模型制備、分組及干預(yù) 選取動情周期正常的75只大鼠，隨機(jī)分為對照組、POF組、BMSCs組、shRNA組、shRNA-BMSCs組，每組各15只。除對照組外，其余各組參照文獻(xiàn)[7]制備大鼠卵巢早衰(POF)模型：每周于同一時(shí)間以6 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射0.5 mg/mL的順鉑生理鹽水溶液(對照組注射等量生理鹽水)，每周注射1次，連續(xù)2周，注射后每天進(jìn)行陰道涂片，監(jiān)測動情周期變化，動情周期紊亂則造模成功。取造模成功大鼠(本實(shí)驗(yàn)均造模成功)，于第2次注射順鉑7d后，shRNA組分別向雙側(cè)卵巢各注射4×107TU的慢病毒載體LV-rno-ASO-miR-204-5p，BMSCs組、shRNA-BMSCs組分別向雙側(cè)卵巢各注射2×106個(gè)BMSCs細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LV-rno-ASO-miR-204-5p的BMSCs細(xì)胞，對照組和POF組注射生理鹽水。

1.2.4 動情周期監(jiān)測及標(biāo)本采集 完成順鉑注射后第14～28天，每天早上8∶00進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片檢查，監(jiān)測動情周期恢復(fù)情況。干預(yù)前1 d及干預(yù)后(注射慢病毒載體、BMSCs、轉(zhuǎn)染慢病毒載體的BMSCs后)28 d，各組大鼠尾靜脈采血1 mL，室溫靜置分層后，2800 r/min(離心半徑10 cm)，留取上層血清，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。血樣采集完畢脫頸處死大鼠，剖腹取雙側(cè)卵巢組織，右側(cè)放置于40%中性甲醛中固定備用，左側(cè)放置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 FSH、E2水平檢測 取保存于-80 ℃的血清樣品，分別采用化學(xué)發(fā)光法，于全自動化學(xué)發(fā)光分析儀及配套試劑盒檢測血清FSH、E2水平。

1.2.6 觀察卵巢形態(tài) 取保存于40%中性甲醛中的卵巢組織，酒精梯度脫水后進(jìn)行石蠟常規(guī)包埋，制作厚度為5 μm的連續(xù)切片，取切片進(jìn)行二甲苯脫蠟、酒精水化步驟，進(jìn)行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色法染色，中性樹膠封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢形態(tài)，參照Gougeon計(jì)數(shù)各級卵泡數(shù)量，包括始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡及竇卵泡。

1.2.7 顆粒細(xì)胞凋亡檢測 取卵巢組織切片，二甲苯脫蠟、酒精水化，洗滌后晾干，按照TUNEL試劑盒說明書檢測卵泡顆粒細(xì)胞凋亡情況：室溫下每張切片滴加蛋白激酶K處理25 min，然后滴加50 μL TUNEL檢測液(含TdT酶5 μL、dUTP 45 μL),避光37 ℃孵育60 min，PBS洗滌后滴加50 μL Streptavidin-HRP工作液，避光37 ℃孵育30 min，PBS洗滌，進(jìn)行DAB顯色5～10 min，PBS洗滌后進(jìn)行蘇木素復(fù)染3～5 s，立即自來水沖洗，自然晾干后中性樹膠封片，光鏡下觀察卵泡顆粒細(xì)胞凋亡情況，以棕黃色或黃色染色為凋亡細(xì)胞，隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)卵泡顆粒細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算顆粒細(xì)胞凋亡率(100個(gè)卵泡顆粒細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù))。

1.2.8 miR-204-5p、MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)檢測 取-80 ℃保存的卵巢組織75 mg，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)鏈cDNA模板，進(jìn)行基因序列擴(kuò)增，按照RT-qPCR SYBR II試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)體系，反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃預(yù)變性4 min；重復(fù)40個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s)，72 ℃再次延伸5 min。miR-204-5p以U6為內(nèi)參對照，MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3以GAPDH為內(nèi)參對照，2-ΔΔCT法計(jì)算待測基因相對表達(dá)強(qiáng)度。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.9 MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)檢測 取-80 ℃保存的卵巢組織50 mg，液氮研磨并轉(zhuǎn)至離心管中，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，12000 r/min離心10 min，離心半徑為12 cm，BCA法進(jìn)行蛋白定量，取50 μg待測樣本與等量上樣緩沖液混勻后，沸水浴10 min，12000 r/min離心10 min，離心半徑為12 cm，取上清液，進(jìn)行12% SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，電轉(zhuǎn)儀將條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉液室溫封閉2 h，加入兔抗大鼠一抗稀釋液[MAPK、Bcl-2、Bax(1∶1000)，Caspase-3(1∶500)]，4 ℃搖床孵育過夜，PBST洗滌3次×8 min，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶10000)，室溫孵育1 h，暗室中顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值比值表示蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，重復(fù)計(jì)量資料比較采用重復(fù)測量方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗(yàn)；多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs培養(yǎng)、鑒定 BMSCs原代培養(yǎng)1 d后換液，細(xì)胞開始貼壁生長，呈多角形或梭形，培養(yǎng)至第3天可見細(xì)胞集落樣生長(圖1A)，繼續(xù)培養(yǎng)至第5天后細(xì)胞開始快速增殖(圖1B)，培養(yǎng)至第7天細(xì)胞融合至90%以上，呈螺旋狀或纖維樣排列(圖1C)，傳代后細(xì)胞均勻分布，增殖迅速，約3～4天可傳代1代，傳至第3代細(xì)胞形態(tài)無明顯變化(圖1D)。將培養(yǎng)第3代BMSCs細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果顯示，細(xì)胞表面標(biāo)記物CD90、CD44陽性率92%以上，CD34、CD11b陽性率1.25%以下，符合BMSCs表面標(biāo)志物特征(圖2)。將培養(yǎng)第3代BMSCs細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化14 d茜素紅染色可見大量紅色鈣結(jié)節(jié)(圖3A)，成脂肪誘導(dǎo)分化14 d油紅O染色可見紅色球形油脂滴(圖3B)，成軟骨誘導(dǎo)分化14 d阿利新藍(lán)染色可見藍(lán)色酸性粘多糖(圖3C)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)、表面標(biāo)志物及三系分化鑒定均符合BMSCs生物學(xué)特征，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 BMSCs原代及傳代培養(yǎng)

2.2 miR-204-5p轉(zhuǎn)染效率觀察 慢病毒載體LV-rno-ASO-miR-204-5p感染第3代BMSCs細(xì)胞24 h后，于熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光蛋白表達(dá)，傳代后熒光強(qiáng)度仍未見明顯減弱，轉(zhuǎn)染效率均大于90%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究，見圖4。

2.3 大鼠一般情況及動情周期恢復(fù)情況觀察 干預(yù)后對照組大鼠活動量、飲食均正常，體毛光滑有光澤，動情周期均正常；POF組大鼠活動量明顯減少，喜臥，行動遲緩，食欲下降，體毛失去光澤，動情周期未恢復(fù)(包括動情間期延長、動情期縮短或無動情期等)；BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組注射后活動量、飲食等一般情況均有所改善，且shRNA-BMSCs組改善最為明顯，3組動情周期均有所恢復(fù)，其中BMSCs組、shRNA組注射后28 d內(nèi)分別有6只、5只恢復(fù)正常動情周期，shRNA-BMSCs組有11只恢復(fù)正常動情周期；shRNA-BMSCs組動情周期恢復(fù)率(73.33%)高于BMSCs組(40.00%)及shRNA組(33.33%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=3.394、4.921，均P<0.05)。

圖2 BMSCs細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)鑒定

圖3 BMSCs三系分化鑒定

圖4 miR-204-5p轉(zhuǎn)染效率觀察

2.4 各組激素水平比較 干預(yù)前，POF組、BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組FSH水平均高于對照組，E2水平均低于對照組(P<0.05)；干預(yù)后，BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組FSH水平均低于POF組，且shRNA-BMSCs組低于BMSCs組和shRNA組，但3組仍高于對照組(P<0.05)；干預(yù)后，BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組E2水平高于POF組，且shRNA-BMSCs組高于BMSCs組和shRNA組，但3組仍低于對照組(P<0.05)；干預(yù)后，BMSCs組與shRNA組比較，F(xiàn)SH、E2水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與干預(yù)前比較，干預(yù)后POF組FSH水平升高、E2水平降低，BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組FSH水平降低、E2水平升高(P<0.05)；見表2。

2.5 卵巢形態(tài)學(xué)觀察及各級卵泡計(jì)數(shù)比較 HE染色顯示，BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡及竇卵泡數(shù)量均多于POF組，但仍少于對照組(P<0.05)；shRNA-BMSCs組始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡及竇卵泡數(shù)量均多于BMSCs組和shRNA組(P<0.05)，而shRNA組與BMSCs組比較無明顯差異(P>0.05)，見圖5、表3。

表2 各組激素水平比較

圖5 卵巢形態(tài)學(xué)觀察(200×)

表3 大鼠各級卵泡計(jì)數(shù)比較

2.6 卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況比較 對照組、POF組、BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率分別為(22.90±5.70)%、(77.46±9.31)%、(67.52±7.55)%、(66.95±7.40)%、(45.90±5.54)%，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=137.247，P<0.001)；BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率均低于POF組，但仍高于對照組(P<0.05)；shRNA-BMSCs組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率低于BMSCs組和shRNA組(P<0.05)，而shRNA組與BMSCs組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。

圖6 卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況(TUNEL400×)

2.7 miR-204-5p、MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量比較 各組相對表達(dá)量組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組miR-204-5p、MAPK、Bax、Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量均低于POF組，且shRNA-BMSCs組低于BMSCs組和shRNA組，但3組仍高于對照組(P<0.05)；BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量高于POF組，且shRNA-BMSCs組高于BMSCs組和shRNA組，但3組仍低于對照組(P<0.05)；shRNA組與BMSCs組比較，miR-204-5p mRNA相對表達(dá)量較低(P<0.05)，MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 miR-204-5p、MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量比較

2.8 MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量比較 各組MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組MAPK、Bax、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量均低于POF組，且shRNA-BMSCs組低于BMSCs組和shRNA組，但3組仍高于對照組(P<0.05)；BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量高于POF組，且shRNA-BMSCs組高于BMSCs組和shRNA組，但3組仍低于對照組(P<0.05)；shRNA組與BMSCs組比較，MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖7。

圖7 Western blot蛋白免疫印記圖

3 討論

POF發(fā)病原因復(fù)雜多樣，其發(fā)病與遺傳突變、化療藥物損傷、免疫功能障礙、代謝異常等關(guān)系密切，多種因素均可能引起卵巢顆粒細(xì)胞過度凋亡，進(jìn)而引起卵巢閉鎖時(shí)間縮短、性激素分泌紊亂，卵巢組織呈現(xiàn)圍絕經(jīng)期或絕經(jīng)后的衰退狀態(tài)[8-10]。卵巢早衰對育齡期女性的身心均造成嚴(yán)重影響，現(xiàn)有的治療方案不可逆轉(zhuǎn)卵巢顆粒細(xì)胞過度凋亡現(xiàn)象，臨床療效和安全性有待改進(jìn)，探索安全性好、更有效的治療手段有重要臨床意義[11]。

研究顯示，BMSCs移植可提高POF卵巢儲備功能，主要依賴于干細(xì)胞分泌的旁分泌因子發(fā)揮作用[12]。miR-204-5p定位于人第9染色體，在調(diào)控脂肪組織形成、糖尿病及多種腫瘤干細(xì)胞自我更新等方面扮演重要角色[13-14]。研究表明，過表達(dá)miR-204-5p可抑制人卵巢顆粒細(xì)胞增殖能力，且抑制miR-204-5p的表達(dá)可促進(jìn)人原代顆粒細(xì)胞產(chǎn)生雌激素[15]。Sun等[16]在研究多囊卵巢綜合癥患者卵巢顆粒細(xì)胞增殖、凋亡機(jī)制過程中發(fā)現(xiàn)，miR-204在卵巢顆粒細(xì)胞及卵巢皮質(zhì)組織中異常低表達(dá)，證實(shí)miR-204可通過誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯參與疾病進(jìn)展。因此，miR-204-5p在育齡女性卵巢中異常表達(dá)可能通過抑制顆粒細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，導(dǎo)致雌激素異常分泌及卵泡生長抑制，最終導(dǎo)致POF的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，向POF大鼠雙側(cè)卵巢分別注射慢病毒載體、BMSCs細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒載體的BMSCs細(xì)胞后，3干預(yù)組卵巢組織中miR-204-5p mRNA表達(dá)量均降低，且shRNA-BMSCs組低于BMSCs組和shRNA組，說明POF大鼠miR-204-5p基因表達(dá)被抑制。進(jìn)一步觀察這3組干預(yù)后動情周期均有所恢復(fù)，血清FSH水平、卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率均降低，其中shRNA-BMSCs組較BMSCs組及shRNA組動情周期恢復(fù)率更高，F(xiàn)SH水平、卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率更低；病理染色顯示，3組干預(yù)后各級卵泡數(shù)量多于POF組，shRNA-BMSCs組增多最為明顯，說明下調(diào)miR-204-5p表達(dá)可增強(qiáng)BMSCs對POF大鼠卵巢結(jié)構(gòu)和功能的改善作用，抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。

此外，本研究中BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組卵巢組織中miR-204-5p mRNA及MAPK、Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白相對表達(dá)量均低于POF組，且shRNA-BMSCs組低于BMSCs組和shRNA組，但3組仍高于對照組，Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量與上述結(jié)果相反，提示下調(diào)miR-204-5p增強(qiáng)BMSCs對POF的治療作用可能與下調(diào)MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3基因和蛋白表達(dá)有關(guān)。卵巢顆粒細(xì)胞凋亡過程涉及多條信號通路，MAPK介導(dǎo)信號通路在多種細(xì)胞凋亡啟動過程中發(fā)揮重要作用[17-18]。Bcl-2/Bax/Caspase-3線粒體凋亡信號通路是MAPK下游重要調(diào)控通路[19-20]。石美虹等[21]研究表明，MAPK抑制劑可通過調(diào)控豬卵巢顆粒細(xì)胞周期而抑制細(xì)胞增殖活力，同時(shí)MAPK下游凋亡相關(guān)基因和蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)水平相應(yīng)改變，與本研究結(jié)果相符。Toll等[22]研究表明，沉默miR-204可通過調(diào)控MAPK信號通路參與皮膚鱗癌的進(jìn)展。上述研究均說明抑制miR-204-5p表達(dá)可能通過調(diào)控MAPK及其下游線粒體凋亡信號通路，miR-204-5p被敲除、沉默或失活時(shí)，MAPK活化水平降低，Bcl-2/Bax/Caspase-3通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)隨之抑制，從而抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡信號的啟動。由此，抑制miR-204-5p可通過下調(diào)MAPK及其下游凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)，抑制POF卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-204-5p反義寡核苷酸序列的BMSCs凋亡率更低的機(jī)制，可能與低表達(dá)miR-204-5p可提高BMSCs在體內(nèi)的存活率，從而發(fā)揮協(xié)同增強(qiáng)作用，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

下調(diào)miR-204-5p表達(dá)具有增強(qiáng)BMSCs對POF大鼠卵巢結(jié)構(gòu)和功能的改善作用，抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，可能與下調(diào)MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3基因和蛋白表達(dá)有關(guān)，為臨床POF的治療提供了新思路。