徐昭勇，胡海洋，許平，唐鴻志

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

隨著基因組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的興起，科學(xué)家開始用嚴(yán)格的工程學(xué)對細(xì)胞的生物行為進(jìn)行改造與控制，由此衍生出了新的研究領(lǐng)域稱為合成生物學(xué)［1］。隨著合成生物學(xué)的快速發(fā)展，越來越多的科學(xué)家不再局限于將多個(gè)基因模塊進(jìn)行組裝從而實(shí)現(xiàn)特定的生物功能，轉(zhuǎn)而開始對不同的微生物菌株進(jìn)行整合［2-7］，依據(jù)相互作用、空間協(xié)調(diào)、菌群穩(wěn)定和生物遏制等原則，人工創(chuàng)建可以滿足特定需求的穩(wěn)定的微生物群落，這些群落被稱為人工合成微生物組［8-9］。人工合成微生物組的迅速發(fā)展，對于理解并操縱天然群落，揭示群落穩(wěn)定互作的分子機(jī)制具有重要意義［10-13］。同時(shí)，由于人工合成微生物組可以穩(wěn)定地執(zhí)行復(fù)雜的任務(wù)，該領(lǐng)域的研究也為合成生物學(xué)在工業(yè)和環(huán)境修復(fù)方面的應(yīng)用開拓了新的方向［14］。

1 構(gòu)建合成微生物組的原則

構(gòu)建人工合成微生物組有四個(gè)關(guān)鍵原則：①相互作用；②空間協(xié)調(diào)；③菌群穩(wěn)定；④生物遏制。遵循這四大原則構(gòu)建的合成微生物組，才能實(shí)現(xiàn)高效穩(wěn)定安全地運(yùn)行。

1.1 相互作用

自然界的生物之間存在著廣泛且多樣的相互作用，微生物之間也存在著復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)，時(shí)刻在進(jìn)行相互競爭和資源交換［15］。但是不同的菌種間的互作程度和依賴程度不一樣，會(huì)造成微生物組的表型不同。合理利用菌群的代謝相互作用（例如分配必需營養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)整代謝路徑等）將有利于使資源的利用率最大化，完成所需要的任務(wù)［16-20］。

1.2 空間協(xié)調(diào)

盡管天然環(huán)境中許多微生物之間存在互作關(guān)系，但不同的微生物之間存在空間界限，同種類的菌株通常聚集在一起形成一個(gè)菌落，而其他菌株則聚集形成其他菌落。在空間上散落分布的不同菌落通常會(huì)在系統(tǒng)中產(chǎn)生資源利用率不同的局部亞菌群，從而增強(qiáng)了局部的相互作用，避免全局性的系統(tǒng)崩潰。所以在構(gòu)建人工微生物組的時(shí)候應(yīng)該考慮到不同微生物之間的空間協(xié)調(diào)，提高微生物組的環(huán)境適應(yīng)力［21-22］。

1.3 菌群穩(wěn)定

人工微生物組的工程應(yīng)用具有一定的挑戰(zhàn)性，可能會(huì)遇到環(huán)境變化以及菌群競爭的挑戰(zhàn)，所以在構(gòu)建時(shí)需要考慮人工微生物組在環(huán)境中的長期穩(wěn)定性，制定相應(yīng)的互作策略來加強(qiáng)各個(gè)菌種之間的合作［12，23-26］。另外，微生物的基因可能會(huì)發(fā)生突變，從而導(dǎo)致功能的喪失，給微生物組的工程應(yīng)用造成困難，所以設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該避免使用突變率較高的基因，并優(yōu)化代謝路徑，使微生物組能夠在長時(shí)間內(nèi)維持菌群的功能［19，27-29］。

1.4 生物遏制

如果在開放環(huán)境中應(yīng)用人工微生物組，則需要對微生物組的細(xì)胞數(shù)量增長進(jìn)行精準(zhǔn)的調(diào)控，利用營養(yǎng)缺陷或致死開關(guān)確保微生物組的菌群密度和功能處于一個(gè)理想的狀態(tài)［30］。此外，還應(yīng)該確保工程菌中人工構(gòu)建的基因不會(huì)釋放到環(huán)境中而造成自然生態(tài)系統(tǒng)的破壞，產(chǎn)生意想不到的負(fù)面后果，所以需要有特定的機(jī)制來降解工程基因線路［31-35］。

2 構(gòu)建合成微生物組的策略

2.1 營養(yǎng)互補(bǔ)

在構(gòu)建合成微生物組時(shí)，可以通過人為設(shè)計(jì)菌株之間的營養(yǎng)互補(bǔ)，從而較為方便地實(shí)現(xiàn)互養(yǎng)、共生的目的［36-40］。最常見的方法，是通過基因敲除，使不同菌株之間可以交叉提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)。例如，敲除某種氨基酸的合成基因，不同菌株就可以通過交叉提供生命活動(dòng)所必需的氨基酸來控制菌群組成和生長速率［41-46］。通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)與相應(yīng)氨基酸的產(chǎn)出，可以調(diào)節(jié)代謝物的交換速率并控制微生物的生長速率和菌株比例［41］。2014 年Church 和Wang 等［45］的研究指出，生物合成成本更高的氨基酸（包括蛋氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、精氨酸等）會(huì)對個(gè)體帶來更大的代謝負(fù)擔(dān)。實(shí)現(xiàn)這類氨基酸的互補(bǔ)，可以有效減少個(gè)體的代謝負(fù)擔(dān)，更有利于菌株之間的交叉供養(yǎng)，支持整個(gè)合成微生物組的協(xié)同生長。因此，通過高合成成本氨基酸的互補(bǔ)策略構(gòu)建的微生物組，比通過低合成成本氨基酸的互補(bǔ)策略構(gòu)建的微生物組，有更強(qiáng)的協(xié)同作用。除此以外，通過氨基酸和核苷酸之間的互補(bǔ)（如腺嘌呤和賴氨酸的互補(bǔ)）［47］，以及代謝中間產(chǎn)物的互相供給（如乳酸和甲酸的互相供給）來構(gòu)建人工菌群［48］，也被證明可以實(shí)現(xiàn)類似的效果，為營養(yǎng)互補(bǔ)的設(shè)計(jì)策略提供了更加靈活的執(zhí)行方案。

2.2 代謝途徑分割

目前，合成生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)可以通過單一的底盤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的生物功能，但是有時(shí)仍然會(huì)存在效率低下的問題。效率低下的原因非常復(fù)雜，涉及到細(xì)胞活動(dòng)的各個(gè)方面。部分情況下是由于人工設(shè)計(jì)的代謝途徑負(fù)擔(dān)過重，超過了單一細(xì)胞的承載上限，出現(xiàn)了負(fù)反饋抑制，導(dǎo)致合成細(xì)胞催化效率低下。而如果將其中某些代謝步驟交由另一種兼容性更高的微生物來進(jìn)行，則可以有效減輕單一菌種的代謝負(fù)擔(dān)，提高最終的轉(zhuǎn)化效率［49-52］。例如2017 年宋浩和元英進(jìn)教授課題組［49］將一條微生物產(chǎn)電的代謝通路分配到3 種不同的菌株中，由3 株菌共同完成產(chǎn)電功能。最終，單位原料的產(chǎn)電效率提高了55.7%，并且穩(wěn)定發(fā)電的時(shí)間更長。除此以外，由于不同菌株之間存在代謝系統(tǒng)的差異，在單一的底盤細(xì)胞中整合多宿主來源的代謝元件時(shí)，很難實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的完全降解至三羧酸循環(huán)或產(chǎn)出需要的化合物，往往需要多個(gè)菌種或者細(xì)菌-真菌的聯(lián)合微生物組才能完成目標(biāo)，因此將代謝途徑在不同菌株中進(jìn)行整合是一種構(gòu)建微生物組有潛力的選擇［53-56］。

2.3 解除生長抑制

在微生物應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)或修復(fù)的研究中，菌株出現(xiàn)生長抑制是很常見的現(xiàn)象。例如，某個(gè)關(guān)鍵代謝節(jié)點(diǎn)成為整條代謝途徑中的限速步驟，由于這種限速步驟的反應(yīng)速度較慢，會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)代謝中間產(chǎn)物的積累，從而對整條途徑的代謝速率產(chǎn)生影響［55，57］。如果積累的中間代謝產(chǎn)物本身對菌株具有毒性，則隨著代謝物濃度的升高對細(xì)胞的抑制作用會(huì)越來越強(qiáng)，最終導(dǎo)致整體的代謝嚴(yán)重受阻［58-59］。針對這類限速步驟，目前比較常見的解決方案是引入其他對此類中間代謝產(chǎn)物代謝較快的菌株，幫助及時(shí)轉(zhuǎn)化中間產(chǎn)物，從而促進(jìn)整體反應(yīng)的進(jìn)行。2003 年Gilbert等［57］針對大腸桿菌SD2（Escherichia coli SD2）降解對硫磷時(shí)會(huì)積累中間產(chǎn)物對硝基苯酚的問題，通過引入惡臭假單胞菌KT2440 pSB337（Pseudomonas putida KT2440 pSB337），降解對硝基苯酚，從而有效防止其在培養(yǎng)物中的積累，增大反應(yīng)速率。Muller 等［58］于2019 年的研究發(fā)現(xiàn)，在利用脫硫酸鹽橡菌（Desulfatiglans anilini）降解苯胺時(shí)會(huì)產(chǎn)生危害菌株生長的中間代謝產(chǎn)物硫化氫，通過引入消耗硫化物的光養(yǎng)細(xì)菌桃紅莢硫菌（Thiocapsa roseopersicina）可以去除硫化氫對D.anilini的抑制作用。

2.4 降低突變率

合成微生物組的穩(wěn)定性除了菌群層面的穩(wěn)定，還需要考慮基因組層面的穩(wěn)定，避免經(jīng)過人工編輯的基因發(fā)生突變導(dǎo)致菌群設(shè)計(jì)功能的丟失［60］。降低突變率有三種方法：第一種是降低表達(dá)量，高表達(dá)的遺傳線路會(huì)給菌株帶來較大的代謝負(fù)荷，造成細(xì)胞適應(yīng)性降低，如果不需要較高的表達(dá)水平，使用低拷貝或中等拷貝質(zhì)粒將有助于穩(wěn)定性的提高；第二種是避免重復(fù)序列，如果遺傳線路具有較高的代謝負(fù)荷而且在高拷貝質(zhì)粒上又有重復(fù)序列時(shí)，重復(fù)序列之間的基因容易在對數(shù)生長期丟失，因此在設(shè)計(jì)復(fù)雜的遺傳線路時(shí)，需要在微生物組中適當(dāng)提高終止子的種類，避免出現(xiàn)重復(fù)的序列；第三個(gè)是使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，與非誘導(dǎo)型基因線路相比，誘導(dǎo)型基因線路的代謝負(fù)荷更低、更穩(wěn)定，并且誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以通過微調(diào)實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的有效控制［61］。

3 構(gòu)建合成微生物組方法

合成微生物組通常有兩種設(shè)計(jì)方式，分別是“自下而上”的方法和“自上而下”的方法。其中“自下而上”的方法是指通過理性設(shè)計(jì)，構(gòu)建微生物之間的人工代謝網(wǎng)絡(luò)來完成所需的任務(wù)；而“自上而下”的方法則是針對所需要執(zhí)行的生物功能，通過調(diào)整篩選條件，獲得符合要求的功能菌株［62-64］。在確認(rèn)了設(shè)計(jì)方式之后，即可按照上述策略，用改造或篩選得到的功能菌株構(gòu)建出初始的合成微生物組（圖1）。

3.1 “自下而上”的方法

“自下而上”的方法需要明確微生物的代謝路徑，對功能基因元件進(jìn)行篩選和改造，并將其整合到合適的菌株中。菌株可從自然界篩選得到，也可通過對模式微生物進(jìn)行改造從而得到滿足特殊的功能需求的菌株?；蛟梢詠碜砸褕?bào)道的元件庫，也可以自行篩選獲取。針對合成微生物組所需要執(zhí)行的特定生物功能，根據(jù)現(xiàn)有的微生物代謝庫，查明其代謝通路，明確代謝通路中涉及的基因，在不同宿主中篩選相關(guān)的基因元件，整合到合適的底盤微生物中，使其具備相應(yīng)的功能［65-66］。例如Lorenzo 等［65］于2013 年將E. coli 的乙酸激酶基因（ackA）和耐氧運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）的丙酮酸脫羧酶基因（pdc）和乙醇脫氫酶II 基因（adhB）敲入P.putida，使其能夠無氧降解1，3-二氯-1-丙烯。

圖1 合成微生物組的構(gòu)建步驟及方法Fig.1 Steps and methods for constructing synthetic microbial consortia

3.2 “自上而下”的方法

“自上而下”的方法相比于前一種方法會(huì)更加直接。針對所需要執(zhí)行的生物功能，可以控制環(huán)境條件篩選獲得不同的功能菌株，比較這些菌株的代謝能力，依據(jù)功能進(jìn)行分類和組合，最終得到一個(gè)最小但能發(fā)揮較大作用的微生物組［67-71］。例如，對于纖維素這類非單一性物質(zhì)，或者其他目前難降解的物質(zhì)的降解，從自然界直接篩選降解微生物時(shí)往往會(huì)分離出多種微生物。2018 年Salles等［72］在富集木質(zhì)纖維素降解菌時(shí)，共篩選出18種降解菌株，這些菌株之間存在互作關(guān)系，通過微生物的鑒定可以將它們按特性進(jìn)行重組。最終得到包含5種菌株的最小微生物組，能夠有效降解木質(zhì)纖維素。

4 合成微生物組的應(yīng)用

4.1 微生物生產(chǎn)

合成微生物組目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物生產(chǎn)和微生物修復(fù)領(lǐng)域［73-74］。在生產(chǎn)領(lǐng)域常見于生物能源、化工產(chǎn)品和藥物的生產(chǎn)［75-79］。其中，生物能源包括沼氣、氫氣等清潔能源，還可以利用合成微生物組直接進(jìn)行生物發(fā)電；化工產(chǎn)品主要用來大量生產(chǎn)異丙醇、異丁醇等；在生物藥物的合成領(lǐng)域，利用合成微生物組可以高效合成紫杉醇的前體物質(zhì)氧化紫杉烷等高價(jià)值產(chǎn)品（表1）。

4.1.1 生物能源

生物能源具有可再生、污染小的特點(diǎn)，被認(rèn)為是綠色能源，是21 世紀(jì)能源開發(fā)和環(huán)境保護(hù)的重點(diǎn)研究對象。Calusinska 等［80］于2012 年分別利用4 種單獨(dú)的純梭狀桿菌菌株（Clostridium ssp.）和由它們共同組成的人工合成的微生物組進(jìn)行氫氣生產(chǎn)，比較它們氫氣的產(chǎn)量和生成速率，每種菌株都能夠利用葡萄糖和淀粉作為碳源有效產(chǎn)生氫氣。結(jié)果表明底物消耗量相同時(shí)單菌株和微生物組的氫氣產(chǎn)量之間沒有明顯差距，但微生物組產(chǎn)生氫氣的速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于純菌株。同時(shí)，微生物組能夠完全消耗淀粉而不需任何預(yù)處理，但純菌株丁酸梭菌（Clostridium butyricum）或巴氏梭菌（Clostridium pasteurianum）只能部分消耗淀粉，底物利用不徹底。蘇海佳教授課題組［48］于2019年通過營養(yǎng)互補(bǔ)構(gòu)建了一套能以淀粉為碳源產(chǎn)生氫氣的微生物組。首先，蠟樣芽孢桿菌A1（Bacillus cereus A1）通過代謝淀粉產(chǎn)生乳酸，而泡囊短波單胞菌B1（Brevundimonas naejangsanensis B1）能利用乳酸作為碳源產(chǎn)生氫氣，同時(shí)在代謝乳酸的過程中會(huì)產(chǎn)生甲酸，甲酸作為電子介體又可以被B.cereus A1利用來加快氫氣的產(chǎn)生。

表1 合成微生物組在生物生產(chǎn)方面的應(yīng)用Tab.1 Applications of synthetic microbial consortia in biosynthesis

Malley 等［68］于2019 年基于“自上而下”的富集方法，篩選得到可以降解木質(zhì)素的菌株來構(gòu)建能夠產(chǎn)生沼氣的微生物組。微生物組的沼氣產(chǎn)量比單菌株高出75%～190%，發(fā)酵速率高出140%～210%。另外，該研究基于這些菌株采用“自下而上”的方案構(gòu)建了幾種合成的微生物組，將新美鞭 菌（Neocallimastix californiae） 和 厭 氧 鞭 菌（Anaeromyces robustus）與產(chǎn)甲烷菌株反芻甲烷桿菌（Methanobacterium bryantii）相互配對，雖然菌株之間也存在相互作用，但產(chǎn)氣速率及底物降解速率并沒有得到明顯提升，而且穩(wěn)定性比天然篩選的微生物組更差。

除了生產(chǎn)生物能源以外，利用微生物組直接進(jìn)行生物發(fā)電也逐漸成為研究熱點(diǎn)。宋浩和元英進(jìn)教授課題組［49］于2017 年將E.coli-Lac 進(jìn)行工程改造，敲除了丙酮酸代謝旁路的pflB基因后能夠提高丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的量，為發(fā)電菌株提供足夠的碳源，同時(shí)在系統(tǒng)中引入枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為發(fā)電菌株提供大量核黃素。發(fā)電菌株鐵還原細(xì)菌（Shewanella oneidensis）以乳酸作為碳源并將乳酸氧化為乙酸鹽提供電能，可以保證550 mV 電能的穩(wěn)定輸出。同時(shí)，產(chǎn)生的乙酸鹽可以反過來為E. coli 和B. subtilis 提供營養(yǎng)物質(zhì)。 Chen 等［56］于2017 年 則 構(gòu) 建 了 一 個(gè) 由S.oneidensis MR-1和B.subtilis RH33組成的合成微生物組進(jìn)行發(fā)電，后者可以為前者提供高濃度的核黃素，大大提高生物發(fā)電能力，該微生物燃料電池能夠穩(wěn)定地循環(huán)運(yùn)行500 h以上。

4.1.2 化工產(chǎn)品

異丁醇、異丙醇等需求量大的化工產(chǎn)品除了用傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法提煉，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)得到了越來越廣泛的應(yīng)用。Lin 等［54］于2013 年開發(fā)了一個(gè)合成真菌-細(xì)菌菌群，該菌群利用木質(zhì)纖維素為底物進(jìn)行生物降解產(chǎn)生異丁醇。首先利用里氏木霉（Trichoderma reesei）產(chǎn)生纖維素酶，將纖維素水解為可溶性寡糖，然后寡糖通過其細(xì)胞壁表面的β-葡萄糖苷酶進(jìn)一步被水解為葡萄糖，最后葡萄糖被E.coli發(fā)酵生成異丁醇。研究證明微晶纖維素、膨化氨纖維和預(yù)處理過的玉米秸稈均可以以這樣的方法直接轉(zhuǎn)化為異丁醇，滴度最高達(dá)1.88 g/L，產(chǎn)率最高達(dá)理論最大值的62%。

Hanai等［50］于2019年將酶生產(chǎn)菌株和異丙醇生產(chǎn)菌株耦聯(lián)，生產(chǎn)酶的E.coli在生長過程中產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶并逐漸積累，并在外源誘導(dǎo)物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）和四環(huán)素以及內(nèi)源信號分子N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯（N-acyl homoserine lactones，AHL）的聯(lián)合作用下發(fā)生裂解，釋放出β-葡萄糖苷酶，將環(huán)境中的纖維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，合成異丙醇的E.coli則利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)異丙醇。微生物之間的耦聯(lián)使得每個(gè)菌株表達(dá)蛋白質(zhì)的負(fù)擔(dān)和其他代謝負(fù)擔(dān)大大減小，纖維二糖的糖化效率和異丙醇的生產(chǎn)效率得以顯著提高。

4.1.3 藥物

用生物合成的方法來生產(chǎn)藥物，很大程度上解決了一些天然藥物產(chǎn)量低的問題，能大幅降低生產(chǎn)成本。目前在工業(yè)上已經(jīng)開始使用人工微生物群落進(jìn)行維生素C 的前體2-酮古洛糖酸（2-ketogulonic acid，2-KGA）的生產(chǎn)，由普通生酮基古洛酸菌（Ketogulonicigenium vulgare）和巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）參與完成。元英進(jìn)教授課題組［81］于2011 年的分析表明，B.megaterium 可以為K.vulgare 提供其生長所必需的物質(zhì)（如嘌呤核苷酸）合成的前體。此外，生物進(jìn)行有氧呼吸時(shí)會(huì)產(chǎn)生反應(yīng)性氧脅迫（reactive oxygen stress，ROS），產(chǎn)生ROS 的物質(zhì)如超氧陰離子、過氧化氫和羥基自由基等，可以攻擊DNA，導(dǎo)致DNA 鏈斷裂和點(diǎn)突變。而B. megaterium 在芽孢形成過程中為K.vulgare 提供諸如嘌呤等基本成分，能夠增強(qiáng)K.vulgare 能量的產(chǎn)生并促進(jìn)其生長和代謝，幫助其抵抗ROS。

Stephanopoulos 等［55］于2015 年將紫杉醇前體（氧化紫杉烷）的合成途徑分為兩個(gè)模塊來生產(chǎn)，分別在E. coli 和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中表達(dá)，這兩者都不能單獨(dú)產(chǎn)生氧化紫杉烷。但是通過設(shè)計(jì)兩者之間的互作聯(lián)系，可以在同一生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)二者穩(wěn)定的共培養(yǎng)：E. coli TaxE1 利用木糖生長產(chǎn)生乙酸鹽，為S. cerevisiae TaxS1 的生長提供唯一碳源，同時(shí)S.cerevisiae TaxS1 利用E.coli TaxE1 代謝產(chǎn)生的紫杉二烯（taxadiene）合成氧化紫杉烷（oxygenated taxanes）。

4.2 微生物修復(fù)

合成微生物組在生物修復(fù)領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用，目前已經(jīng)在BTEX［苯（benzene）、甲苯（toluene）、乙苯（ethylbenzene）、二甲苯（xylenes），統(tǒng)稱為BTEX］、鹵代苯族化合物、塑料等這類難降解、污染大的石油及其衍生產(chǎn)品的降解方面展示出了很好的應(yīng)用前景［82-85］。而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，微生物組降解農(nóng)藥的潛力也被逐步挖掘出來（表2）。

4.2.1 石油及其衍生產(chǎn)品的降解

石油及其衍生產(chǎn)品極大地促進(jìn)了現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，同時(shí)帶來了嚴(yán)重的污染。因此，解決石油及其衍生產(chǎn)品（如烷烴、芳香烴、鹵代烴、塑料等）所引起的污染，是各國研究者關(guān)注的重點(diǎn)。唐鴻志教授課題組［86］于2020 年從被石油污染的土壤中篩選得到能夠降解石油的微生物組，由無色桿菌P3（Achromobacter sp. P3）、鞘氨醇單胞菌P10（Sphingobium sp. P10）和根瘤菌P14（Rhizobium sp. P14）組成，并根據(jù)最小值算法計(jì)算各菌株之間的最優(yōu)構(gòu)成比例，按比例與已報(bào)道的石油降解微生物組PDM 混合，降解效率提高了34.8%，5天內(nèi)石油的總降解率達(dá)到78.9%。

Nagarajan 等［87］于2014 年基于不同菌株對不同單環(huán)芳族化合物進(jìn)行生物降解的能力，選擇了P.putida F1 和斯氏假單胞菌OX1（P.stutzeri OX1）兩種菌株來組建合成微生物組。這兩種菌株都能以苯和甲苯為底物生長，此外，P. putida F1 和P. stutzeri OX1 還分別表現(xiàn)出對于乙苯和鄰二甲苯的降解能力，因此合成的微生物組具備更廣譜的BTEX降解能力。

D.anilini可以在完全缺氧的條件下降解有毒的芳香族化合物苯胺，但是，D.anilini降解苯胺會(huì)積累中間產(chǎn)物硫化物，而硫化物濃度的增加，會(huì)抑制細(xì)胞的生長，在20 mmol/L 的硫化物濃度下就能表現(xiàn)出完全抑制的作用。針對這一問題，Mullera等［58］于2019年引入硫化物代謝細(xì)菌T.roseopersicina進(jìn)行共培養(yǎng)。與每天僅消耗0.006 mmol/L 苯胺的D. anilini 菌株純培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)微生物組的苯胺降解速率顯著提高到0.016 mmol/（L·d）。

苯族化合物難降解，鹵代苯族化合物降解的難度更大。Katayama等［53］于2015年通過構(gòu)建厭氧菌的微生物組實(shí)現(xiàn)了2，4，6-三溴苯酚（2，4，6-tribromophenol，2，4，6-TBP）的礦化。脫鹵素桿菌FTH1（Dehalobacter sp.FTH1）具有還原性脫溴的能力，將2，4，6-TBP脫溴轉(zhuǎn)化為苯酚，在這個(gè)過程中Clostridium sp. Ma13 通過發(fā)酵葡萄糖為Dehalobacter sp.FTH1 提供氫，最后在脫硫酸鹽橡菌DS菌株（Desulfatiglans parachlorophenolica DS）的參與下將苯酚礦化為CO2。

表2 合成微生物組在生物修復(fù)方面的應(yīng)用Tab.2 Applications of synthetic microbial consortia in bioremediation

Skariyachan等［88］于2016年從塑料垃圾加工區(qū)篩選出兩株降解塑料的菌株，分別是陰溝腸桿菌屬（Enterobacter spp.）和泛菌屬（Pantoea spp.），以此構(gòu)建的微生物組能夠降解低密度聚乙烯（lowdensity polyethylene，LDPE）薄膜及顆粒。該微生物組能夠利用LDPE 作為碳源，在45°C 和pH 8.5的條件下生長， 效果比微生物保存中心（Microbial Type Culture Collection，MTCC）的三株菌株P(guān). putida MTCC 2445、P. stutzeri MTCC 2643和B.subtilis MTCC 9447 的單菌或由這三株菌株組合成的菌群的降解效果更好。

4.2.2 農(nóng)藥的降解

除草劑、殺蟲劑等農(nóng)藥的使用為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)帶來了很大的增產(chǎn)效益，但隨著農(nóng)藥的過度使用，其在環(huán)境中的殘留以及對人、動(dòng)物帶來的危害正變得愈發(fā)嚴(yán)重。Top 等［89］2003 年直接從降解除草劑利谷?。↙inuron）的培養(yǎng)物中分離出三種菌株，即貪噬菌WDL1（Variovorax sp. WDL1）、食酸戴爾福特菌WDL34（Delftia acidovorans WDL34）和假單胞菌WDL5（Pseudomonas sp.WDL5）。同時(shí)，從利谷隆降解的潛在中間產(chǎn)物如N，O-二甲基羥胺（N，O-dimethylhydroxylamine，N，O-DMHA）和3，4-二氯苯胺（3，4-dichloroaniline，3，4-DCA）的培養(yǎng)物中又分離出2 種菌株，伯氏節(jié)桿菌WDL6（Hyphomicrobium sulfonivorans WDL6）和睪丸酮叢毛單胞菌WDL7（Comamonas testosteroni WDL7）。在這五個(gè)菌株中，只有Variovorax sp.WDL1能夠利用利谷隆作為唯一的能量來源，Variovorax sp.WDL1首先將利谷隆轉(zhuǎn)化為3，4-DCA，同時(shí)產(chǎn)生N，O-DMHA。D.acidovorans WDL34 和C. testosteroni WDL7 在 降解3，4-DCA的同時(shí)，保護(hù)Variovorax sp.WDL1免受3，4-DCA積累而帶來的細(xì)胞毒性脅迫。N，O-DMHA最終可以被H.sulfonivorans WDL6有效吸收。

在殺蟲劑污染的修復(fù)研究方面，Gilbert 等［57］于2003 年構(gòu)建了由兩種工程微生物組成的微生物組，對有機(jī)磷酸酯殺蟲劑對硫磷進(jìn)行生物降解。含有對硫磷水解酶基因的E.coli SD2，能夠?qū)α蛄状x為對硝基苯酚，然而對硝基苯酚的積累會(huì)對菌株自身的生長及對硫磷的降解產(chǎn)生不利影響，引入含有編碼對硝基苯酚礦化基因的菌株P(guān).putida KT2440 pSB337來降解積累的對硝基苯酚，由此實(shí)現(xiàn)對硫磷的完全礦化。

5 總結(jié)與展望

與單一微生物相比，合成微生物組表現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢，例如能明顯降低菌株的代謝負(fù)擔(dān)，彌補(bǔ)單一菌株自身的缺陷，并且能夠?yàn)槎嘣虮磉_(dá)提供平臺，適應(yīng)更復(fù)雜的應(yīng)用場景［90-94］。構(gòu)建合成微生物組分為“自下而上”和“自上而下”兩種方法，遵循4個(gè)基本原則，即：①相互作用，保證菌群中每種菌株的相互作用能夠使整體資源利用率最大化；②空間協(xié)調(diào)，保證菌群中每個(gè)局部的菌落之間相互協(xié)調(diào)；③菌群穩(wěn)定，保證合成微生物組能在環(huán)境中維持長時(shí)間的穩(wěn)定狀態(tài)；④生物遏制，保證人工菌群及人工構(gòu)建的基因不會(huì)泄漏至開放環(huán)境中?，F(xiàn)在比較普遍的構(gòu)建策略有4種，分別是：①營養(yǎng)互補(bǔ)，通過在一個(gè)菌群中設(shè)計(jì)不同的營養(yǎng)缺陷型菌株，互相提供特定的必需營養(yǎng)物，實(shí)現(xiàn)不同菌株之間的穩(wěn)定共生；②代謝途徑分割，將一條代謝途徑分割至不同的菌株當(dāng)中，實(shí)現(xiàn)代謝耦合，減輕單一菌種的代謝負(fù)擔(dān)，可以有效提高催化效率；③解除生長抑制，微生物在代謝某些化合物時(shí)產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物會(huì)抑制微生物的生長，引入其他微生物來消耗這類中間代謝產(chǎn)物，可有效解除生長抑制；④降低突變率，維持合成微生物組長期穩(wěn)定的重要方法是降低突變率，維持基因的穩(wěn)定，從而維持功能的穩(wěn)定。

隨著合成生物學(xué)和微生物組學(xué)的快速發(fā)展并深度融合，合成微生物組已經(jīng)成為現(xiàn)在微生物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，由此開發(fā)的各種生物合成平臺、生物治理平臺在實(shí)際應(yīng)用方面，都具有廣闊的發(fā)展前景［73，95-99］。目前已經(jīng)有研究將合成微生物組應(yīng)用于微生物生產(chǎn)、微生物修復(fù)等領(lǐng)域。在微生物生產(chǎn)領(lǐng)域，可以利用合成微生物組生產(chǎn)氫氣、甲烷等能源物質(zhì)，異丁醇、異丙醇等化工產(chǎn)品，以及2-酮古洛糖酸、氧化紫杉烷等藥物。在微生物修復(fù)領(lǐng)域，利用合成微生物組降解石油、BTEX、苯胺、鹵代苯、農(nóng)藥等污染物，可以擴(kuò)大用于環(huán)境修復(fù)的微生物的底物譜，提高降解效率，使微生物能夠更廣泛地應(yīng)用于環(huán)境修復(fù)中。

雖然合成微生物組已經(jīng)有了不少應(yīng)用，但是目前合成微生物組還存在一些亟待解決的問題。第一是需要開發(fā)適于進(jìn)行正交遺傳線路操作的底盤菌株，這些底盤菌株需要在具備特定合成/降解功能的基礎(chǔ)上，具備良好的兼容性與穩(wěn)定性，且易于進(jìn)行遺傳操作，有明確的基因組圖譜，理想情況下還需具備新陳代謝模型。新底盤菌株的開發(fā)必定會(huì)推動(dòng)合成微生物組研究在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用［100］。第二，多種污染物構(gòu)成的復(fù)合污染比單一污染物更為復(fù)雜，這給原位生物修復(fù)工作帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，因此，原位修復(fù)領(lǐng)域的合成微生物組設(shè)計(jì)需要朝著多種污染并行處理的方向發(fā)展［101］。第三，計(jì)算生物學(xué)推動(dòng)了合成微生物組的發(fā)展，在重構(gòu)菌群，解析菌種之間的相互關(guān)系方面有了一定的應(yīng)用。但是，依然存在很多問題，例如無法準(zhǔn)確預(yù)測群落演替、復(fù)雜菌群內(nèi)部的相互作用模型不準(zhǔn)確等，今后還需要針對這些問題進(jìn)行解決［75］。合成微生物組正在成為微生物研究領(lǐng)域、合成生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，隨著我們對各個(gè)微生物性質(zhì)了解的深入，合成微生物組研究將會(huì)迎來更大的突破。

符號說明

AHL——N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯（N-acyl homoserine lactones）

3，4-DCA——3，4-二氯苯胺（3，4-dichloroaniline）

N，O-DMHA—N，O-二甲基羥胺（N，O-dimethylhydroxylamine）

IPTG— 異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）

2-KGA——2-酮古洛糖酸（2-keto-gulonic acid）

LDPE— 低密度聚乙烯（low-density polyethylene）

MTCC— 微生物保存中心（Microbial Type Culture Collection）

ROS——反應(yīng)性氧脅迫（reactive oxygen stress）