汪君儀，武曉樂，曹月陽，李炳志

（教育部合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心，系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072）

快速發(fā)展的基因組測序技術(shù)推動(dòng)了基因組信息的爆發(fā)式增長，正逐步加深人們對生命過程和調(diào)控的理解［1-3］。合成基因組學(xué)從復(fù)寫已知天然基因組開始，逐步建立基因組合成技術(shù)，探索基因組設(shè)計(jì)原則，嘗試以人工設(shè)計(jì)合成的基因組實(shí)現(xiàn)對生命活動(dòng)的調(diào)控，深度拓展對生命過程的認(rèn)知。

隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展、DNA 合成與組裝技術(shù)的進(jìn)步、合成成本的降低，基因組的從頭合成與重新設(shè)計(jì)日益受到關(guān)注。2002 年脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組成為世界上第一個(gè)人工合成的基因組［4］，2003 年φX174 噬菌體的基因組也被成功合成［5］，2020年新冠肺炎病COVID-19基因組也被迅速從頭化學(xué)合成并組裝出有活性的毒株［6］。隨著DNA 大片段合成組裝技術(shù)的發(fā)展，2008 年原核生物生殖支原體的基因組被成功從頭合成［7］。2010 年Venter 團(tuán)隊(duì)實(shí)現(xiàn)了利用人工合成的蕈狀支原體基因組調(diào)控生命活動(dòng)的目標(biāo)［8］，證實(shí)了化學(xué)合成基因組的生命活性。隨著包括染色體構(gòu)建與轉(zhuǎn)移等基因組合成相關(guān)技術(shù)的發(fā)展［9-14］，合成基因組學(xué)的研究可以在更多的物種范圍和更大的設(shè)計(jì)尺度上探究基因組的基本科學(xué)問題，例如，在大腸桿菌中嘗試進(jìn)行基因組密碼子的刪減研究［15-18］，在支原體中進(jìn)行大規(guī)?；蚪M簡化的研究［19］，在釀酒酵母中進(jìn)行基因組穩(wěn)定性和柔性的研究［20-28］，等等。真核單細(xì)胞模式生物釀酒酵母基因組的設(shè)計(jì)與合成成為科學(xué)家的又一個(gè)重大目標(biāo)。

在合成基因組學(xué)發(fā)展的初期，目標(biāo)主要是利用化學(xué)合成的手段成功復(fù)寫野生型基因組，關(guān)鍵在于建立基因組合成的技術(shù)方法。近年來合成基因組學(xué)不斷地發(fā)展，國內(nèi)外也形成了不少相關(guān)綜述［29-31］，研究者逐漸開始利用合成基因組學(xué)探索生物學(xué)基本問題和原理，這就需通過對基因組進(jìn)行不同的設(shè)計(jì)并以基因組合成的方式驗(yàn)證設(shè)計(jì)的可行性。本文作者將從人工基因組的密碼子改變、人工標(biāo)簽、人工位點(diǎn)、基因組簡化等幾種重要設(shè)計(jì)角度，介紹基因組合成的相關(guān)研究進(jìn)展。

1 人工基因組的密碼子改變

1.1 密碼子豐度的轉(zhuǎn)變

密碼子豐度是表征某一個(gè)密碼子在全基因組編碼中使用頻率的指標(biāo)。遺傳密碼具有簡并性，這導(dǎo)致了對應(yīng)同一種氨基酸會存在多個(gè)不同的密碼子（同義密碼子），同時(shí)，在不同生物間，甚至在同一生物不同蛋白間，編碼相同氨基酸的同義密碼子的使用頻率不同，這就導(dǎo)致了密碼子豐度的差異，通常也稱之為密碼子使用的偏好性［32］。為了讓異源基因更好地在宿主中表達(dá)，根據(jù)宿主細(xì)胞密碼子的偏好性對異源基因進(jìn)行優(yōu)化已經(jīng)成為基因組設(shè)計(jì)中一種成熟的技術(shù)手段，已有多種密碼子優(yōu)化軟件被開發(fā)，如Codon Optimization OnLine［33］。研究表明在釀酒酵母體內(nèi)將同義密碼子中相同的密碼子排列在一起，可以使tRNA 分子循環(huán)利用從而加快翻譯速度［34］。密碼子分布與基因的GC 含量密切相關(guān)，連續(xù)同義密碼子的選擇具有相關(guān)性，傾向于選擇使用相同tRNA的密碼子。

Venter 團(tuán)隊(duì)在蕈狀支原體基因組（JCVIsyn3.0）的合成過程中，對密碼子豐度轉(zhuǎn)變的原則進(jìn)行了一定程度的探究，野生型蕈狀支原體基因組中腺嘌呤（A）和胸嘧啶（T）的含量極高，TGA 僅作為編碼色氨酸的密碼子而并非終止密碼子，并且偶爾會使用非標(biāo)準(zhǔn)的起始密碼子。該研究將包含三個(gè)必需基因的5000 bp 區(qū)域中密碼子的編碼原則進(jìn)行了三種不同方式的修改：①將編碼色氨酸的密碼子由TGA 更改為TGG，采用非標(biāo)準(zhǔn)的起始密碼子；②根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性對該區(qū)域的密碼子豐度進(jìn)行修改，色氨酸仍由TGA 編碼；③根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性對該區(qū)域的密碼子豐度進(jìn)行修改，使用標(biāo)準(zhǔn)的起始密碼子，色氨酸由TGG 編碼。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這些密碼子更改基本不影響細(xì)胞生長，但若在基因組設(shè)計(jì)中想要大規(guī)模改變密碼子的豐度可能需要伴隨tRNA水平的修飾以保證翻譯能夠正常進(jìn)行［19］。

1.2 密碼子刪除

自然界中大多數(shù)生物均使用64 個(gè)遺傳密碼子編碼20 種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，密碼子具有通用性，即不同的生物使用一套高度相似的密碼子表。通過在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行同義密碼子的替換并消除其對應(yīng)的tRNA，使其無法翻譯所刪除的密碼子，則無法正確翻譯來自病毒、質(zhì)粒和其他細(xì)胞獲得的DNA，從而使重新編碼的生物具備遺傳隔離能力。并且我們可以利用所刪除的密碼子來編碼非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，合成具備新化學(xué)性質(zhì)的蛋白，也可利用非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸來建立生物防逃逸體系。

為了進(jìn)一步探索密碼子的使用規(guī)則及遺傳信息的保存、編碼、交換原理，2013 年Church 團(tuán)隊(duì)提出創(chuàng)建使用63 個(gè)密碼子的生物。在大腸桿菌MG1655 中采取基因編輯的方式利用同義密碼子UAA 替換了所有UAG 終止密碼子，并通過刪除RF1（釋放因子）消除了在密碼子UAG處終止翻譯的功能，從而可以將UAG 用于特異性地編碼非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸［15］。在成功完成單密碼子替換工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開始探索在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行多個(gè)密碼子替換的可行性。2016年，在大腸桿菌全基因組范圍內(nèi)使用同義密碼子系統(tǒng)地替換了7 個(gè)密碼子（包含6個(gè)有義密碼子以及UAG終止密碼子），使大腸桿菌的遺傳密碼子從64 個(gè)減少到57 個(gè)，共涉及到62 214 個(gè)同義密碼子的替換，但最終僅包含57個(gè)密碼子的大腸桿菌無法正常存活，至今也未能成功構(gòu)建。完成替換后將重新編碼的基因組解析為87 個(gè)約50 kb 的片段，并對其中55 個(gè)片段（包含2229 個(gè)基因）進(jìn)行基因功能的驗(yàn)證，其中僅有13 個(gè)重新編碼的必需基因無法支持細(xì)胞生存，99.5%重新編碼的基因無需任何優(yōu)化即可替代野生型基因的功能［16］，這在一定程度上表明了從根本上改變遺傳密碼和大規(guī)模合成基因組重構(gòu)的可行性。

利用基因組的重新編碼以去除部分有義密碼子，可以促進(jìn)具備非天然氨基酸編碼功能的細(xì)胞的合成。2016 年Chin 團(tuán)隊(duì)提出了利用大于100 kb的DNA 合成片段迭代替換相應(yīng)野生型片段的基因組組裝技術(shù)，在進(jìn)行多次迭代后可以完成整個(gè)大腸桿菌基因組的替換，該方法為全基因組同義密碼子的替換提供了基礎(chǔ)。此外該研究嘗試使用了8種不同的同義密碼子替換方案，并成功地在富含必需基因的操縱子中去除了373 個(gè)有義密碼子［17］。2019年，在此研究基礎(chǔ)上，利用基因組全合成的方式完成了大腸桿菌全基因組范圍內(nèi)2 個(gè)有義密碼子和1個(gè)終止密碼子的替換，并且僅含有61種密碼子的大腸桿菌可以維持正常的生長，該研究重新編碼了18 214 個(gè)密碼子，成功創(chuàng)建使用61 個(gè)密碼子的生物，并刪除了其對應(yīng)的tRNA［18］（圖1）。

2 人工標(biāo)簽

圖1 密碼子刪除相關(guān)研究進(jìn)展［16，18］（2016年Church團(tuán)隊(duì)在大腸桿菌全基因組范圍內(nèi)使用同義密碼子系統(tǒng)地替換了7個(gè)密碼子，90%以上的基因仍具有功能［16］ ；2019年Chin團(tuán)隊(duì)重新編碼了大腸桿菌的18 214個(gè)密碼子，創(chuàng)建了使用61個(gè)密碼子的生物［18］）Fig.1 Research progress on codons deletion[16,18]（In 2016,seven codons were replaced with synonymous alternatives the entire genome of E.coli by Church's group,more than 90%of the genes retained functionality[16];In 2019,Chin's group recoded 18 214 codons to create a strain with a 61-codon genome ［18］）

2010 年，在合成蕈狀支原體基因組研究中，為了區(qū)分合成基因組和天然基因組，在不干擾細(xì)胞活力的前提下在合成型基因組中引入了四個(gè)“水印”序列［8］。在Sc2.0 項(xiàng)目中，利用同義密碼子替換，在合成型基因組中引入了大量的PCR 標(biāo)簽，用于區(qū)分合成型和野生型序列［20］。除此之外，Sc2.0 的設(shè)計(jì)還包括內(nèi)含子及重復(fù)序列的刪除、tRNA 的移位等［35］。在synⅩ染色體的合成過程中，Wu 等［25］開 發(fā) 了 一 種 名 為 混 菌PCR 標(biāo) 簽 定 位（pooled PCRTag mapping， PoPM）的高通量定位策略，用于高效識別合成型染色體中導(dǎo)致生長缺陷的位點(diǎn)。該方法以生長缺陷和長勢正常兩個(gè)混菌庫提取的基因組作為模板，以PCRtag 為引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)，通過結(jié)果分析正常菌株表型庫中缺失的合成型區(qū)域和生長缺陷菌株庫中缺失的野生型區(qū)域，快速定位導(dǎo)致缺陷的基因組位點(diǎn)。

除此之外，利用PCRtag 可以便捷地分析合成型基因組重排前后變化的基因組位點(diǎn)，是一種有效的快速縮小潛在目標(biāo)基因位點(diǎn)所在區(qū)域的方法。Luo 等［36］利用基因組重排對酵母菌株乙醇的耐受性機(jī)制進(jìn)行了探索，將重排后的菌株分為耐受乙醇組和不耐受乙醇組，利用合成型基因組上的PCRtag 對這兩組菌株進(jìn)行PCR 分析，找到了影響乙醇耐受性的基因位點(diǎn)。在利用含有合成型染色體菌株的基因組重排研究中，利用合成型染色體中非必需基因上包含的96 個(gè)PCRtag 對7 株重排后獲得的菌株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中4株菌株都包含一段長度約為11 448 bp 區(qū)域的缺失，在這段區(qū)域內(nèi)進(jìn)一步進(jìn)行基因的刪除分析，獲得了堿性耐受相關(guān)基因的位點(diǎn)［37］。

3 人工位點(diǎn)

染色體的結(jié)構(gòu)以及基因的排列順序都會影響基因的表達(dá)，利用合成型基因組重排快速探究菌株更優(yōu)的生理表型受到廣泛的關(guān)注。Sc2.0 項(xiàng)目中合成型酵母染色體設(shè)計(jì)的一大亮點(diǎn)是在每個(gè)非必需基因的終止密碼子后均插入了一段反向?qū)ΨQ的人工位點(diǎn)-loxPsym 序列［35］，兩個(gè)loxPsym 位點(diǎn)之間的序列在Cre重組酶的作用下可隨機(jī)發(fā)生刪除和反轉(zhuǎn)［38］，從而在合成型酵母體內(nèi)形成了可快速進(jìn)行基因組重排（缺失、重復(fù)、倒置、易位）的SCRaMbLE （Synthetic Chromosome Rearrangement and Modification by LoxPsym-mediated Evolution）系統(tǒng)。為了證明SCRaMbLE 系統(tǒng)在探索基因組多樣性方面的能力，利用合成染色體臂synIXR（包含43 個(gè)loxPsym 位點(diǎn)）進(jìn)行基因組重排，其中64個(gè)SCRaMbLE 菌株深度測序結(jié)果顯示，重排后除了可以獲得基因組缺失、重復(fù)、倒位的菌株還可以獲得發(fā)生大量復(fù)雜重排的菌株，并且這些重排均發(fā)生在所設(shè)計(jì)的loxPsym 位點(diǎn)之間［39］。利用SCRaMbLE 系統(tǒng)可以快速地進(jìn)行大規(guī)模的基因組重排（包含染色體內(nèi)及染色體間的重排），在選擇性條件下可快速有效地進(jìn)行基因組的定向進(jìn)化。SCRaMbLE 系統(tǒng)不斷在應(yīng)用中得到改進(jìn)，逐步使SCRaMbLE 系統(tǒng)成為優(yōu)化宿主、提高產(chǎn)量以及增強(qiáng)菌株耐受性的有效手段。

3.1 SCRaMbLE系統(tǒng)的改進(jìn)

最初設(shè)計(jì)的SCRaMbLE 系統(tǒng)是以雌激素誘導(dǎo)為重排開關(guān)，但在缺乏雌激素誘導(dǎo)的情況下仍然可以觀察到染色體重排引起的合成型酵母的生長缺陷，這表明了單開關(guān)控制下的SCRaMbLE 系統(tǒng)存在開關(guān)的泄漏［39］。Jia 等［40］將半乳糖驅(qū)動(dòng)的Cre酶誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)引入最初的設(shè)計(jì)體系，通過構(gòu)建與門開關(guān)實(shí)現(xiàn)了對SCRaMbLE 系統(tǒng)的精準(zhǔn)控制。與門開關(guān)結(jié)合了轉(zhuǎn)錄控制以及細(xì)胞定位控制，使SCRaMbLE 系統(tǒng)只有在同時(shí)具備半乳糖和雌激素的情況下才可開啟。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開發(fā)了多重SCRaMbLE 迭代循環(huán)（Multiplex SCRaMbLE Iterative Cycling，MuSIC）技術(shù)以產(chǎn)生更多的合成基因組重排變體。Cre 酶表達(dá)的泄漏還會導(dǎo)致重排結(jié)束后基因組的不穩(wěn)定，為了維持重排后基因組的穩(wěn)定性，Lin 等［41］在釀酒酵母中導(dǎo)入與Cre重組系統(tǒng)正交的Vika 重組系統(tǒng)，利用Vika-vox 系統(tǒng)在重排結(jié)束后徹底刪除Cre基因以維持重排后菌株的穩(wěn)定性。

盡管雌激素是一種強(qiáng)力誘導(dǎo)劑，但它具有的活性在濃度較高的情況下可能對人體有毒害。Hochrein 等［42］開發(fā)了一種光控拆分的Cre重組系統(tǒng)（light-controlled induction system， L-SCRaMbLE），該系統(tǒng)中Cre 酶被分裂為N 端和C 端，并分別融合到可以光學(xué)誘導(dǎo)二聚化的兩個(gè)蛋白上，在紅光介導(dǎo)的二聚作用下重構(gòu)Cre 重組酶。L-SCRaMbLE 操作更加簡便，并且可以通過調(diào)節(jié)感光體發(fā)色團(tuán)的濃度、光照射時(shí)間以及光照強(qiáng)度來微調(diào)重組效率。雖然L-SCRaMbLE 系統(tǒng)總體重組效率較低，但較低的重組效率更有利于產(chǎn)生重組多樣性［42］。

利用SCRaMbLE 系統(tǒng)篩選對某些脅迫因素具有更高耐受性的菌株時(shí)，發(fā)現(xiàn)很多菌株耐受性的提高并不是染色體重排導(dǎo)致。為了有效鑒定細(xì)胞是否發(fā)生染色體重排，Luo 等［36］基于營養(yǎng)缺陷型標(biāo)簽URA3 和LEU2 的交替切換設(shè)計(jì)了ReSCuES（reporter of SCRaMbLEd cells using efficient selection）系統(tǒng)。未發(fā)生SCRaMbLE 時(shí)菌株能在缺乏尿嘧啶的培養(yǎng)基中存活，只有發(fā)生染色體重排的菌株才能在缺乏亮氨酸的培養(yǎng)基中存活，該系統(tǒng)可快速鑒別發(fā)生重排的菌株。

單倍體合成型酵母在發(fā)生SCRaMbLE 時(shí)，必需基因的缺失使基因組重排存在高致死率的問題，為此Shen等［43］開發(fā)了雜合二倍體的SCRaMbLE技術(shù)。該研究將單倍體合成型Sc2.0 菌株與單倍體天然親本菌株交配產(chǎn)生雜合二倍體菌株，以此雜合二倍體菌株進(jìn)行SCRaMbLE，并且該技術(shù)也可以在種間雜交中應(yīng)用。利用二倍體菌株進(jìn)行SCRaMbLE 降低重排的致死率，通過環(huán)境選擇可更快更多地產(chǎn)生新的表型。

為了使SCRaMbLE 系統(tǒng)更加可控和便捷，進(jìn)一步開發(fā)了自上而下和自下而上的體外SCRaMbLE系統(tǒng)，該系統(tǒng)由試管中的Cre 重組酶驅(qū)動(dòng)，同時(shí)存在含有多個(gè)loxPsym位點(diǎn)DNA片段，通過相關(guān)轉(zhuǎn)錄單元的重排來優(yōu)化生物合成的通路［44］。Liu 等［45］提出了一種基于重組酶的方法（recombinase-based combinatorial method， SCRaMbLE-in），包含一個(gè)體外重組酶系統(tǒng)，可以在途徑水平上快速實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的多樣化，同時(shí)開啟體內(nèi)SCRaMbLE 系統(tǒng)將體外組裝的路徑整合到合成型酵母基因組中，并在宿主細(xì)胞中進(jìn)行大量的基因組重排，以同時(shí)達(dá)到外源途徑優(yōu)化和底盤菌株優(yōu)化的效果。

3.2 SCRaMbLE系統(tǒng)的應(yīng)用

合成型酵母染色體的重排是優(yōu)化宿主、提高產(chǎn)量以及增強(qiáng)菌株耐受性的有效手段。研究人員利用含有合成型染色體的釀酒酵母進(jìn)行SCRaMbLE，得到了可以利用木糖的宿主細(xì)胞，提高了釀酒酵母中紫色桿菌素、脫氧紫色桿菌素前體、青霉素、β-胡蘿卜素、類胡蘿卜素等次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量［40，46-47］。并且通過重排產(chǎn)生了乙醇耐受性增強(qiáng)、耐堿性增強(qiáng)的菌株，同時(shí)對釀酒酵母的耐乙醇機(jī)制及耐堿機(jī)制進(jìn)行了更加深入的探究［36-37］。此外利用SCRaMbLE 系統(tǒng)進(jìn)行基因組規(guī)模的基因敲除是研究基因間相互作用的有效途徑之一，可以利用SCRaMbLE 系統(tǒng)隨機(jī)產(chǎn)生缺失突變體，以此來探索基因合成致死的相互作用［48］。隨著SCRaMbLE系統(tǒng)應(yīng)用的逐漸成熟，研究人員開發(fā)了一種基于此系統(tǒng)的基因組簡化方法（SCRaMbLE-based genome compaction，SGC），并通過迭代SGC 實(shí)現(xiàn)了合成型染色體臂（synXIIL）中39 個(gè)非必需基因的刪除［49］。

4 基因組簡化

在自然界中大多數(shù)生物為了能夠適應(yīng)多種環(huán)境，體內(nèi)含有很多與細(xì)胞基本生長無關(guān)的基因，簡化基因組的研究可以促進(jìn)基因功能的解析，減少基因組中冗余的基因，增加細(xì)胞對能量的利用效率，增強(qiáng)細(xì)胞的可控性，有助于生物遺傳調(diào)控的研究，為合成基因組的設(shè)計(jì)提供基礎(chǔ)。

近年來，基因組簡化研究也取得了快速發(fā)展（圖2）。利用Tn5 轉(zhuǎn)座子的衍生物將E.coli K-12 的基因組減小了200 kb［50］，在粟酒裂殖酵母體內(nèi)敲除了冗余的223 個(gè)基因，將基因組減小了657.3 kb［50］。使用改良的轉(zhuǎn)座子誘變法，經(jīng)過不斷地設(shè)計(jì)、合成、測試，確定了維持細(xì)胞生長的必需及準(zhǔn)必需基因，構(gòu)建了簡化的蕈狀支原體JCVIsyn3.0 菌株，該基因組（531 kb）大小僅有原基因組JCVI-syn1.0 （1079 kb）的1 2 左右，比自然界中已知可獨(dú)立存活的最小基因組M. genitalium（580 kb）還要小［19］。該簡化過程中刪除了428 個(gè)基因，但仍有149個(gè)功能未知的基因，這表明還存在著某些維持生命所必需的功能是未知的，JCVIsyn3.0 可作為進(jìn)一步基因組功能研究以及全基因組設(shè)計(jì)探索的平臺［19］。

5 展 望

合成基因組學(xué)研究發(fā)展迅速，從病毒基因組和原核生物基因組的全合成，已經(jīng)快速發(fā)展到真核生物基因組的合成階段，釀酒酵母6條染色體已經(jīng)完成人工設(shè)計(jì)合成?，F(xiàn)在已經(jīng)提出了基因組編寫計(jì)劃［52］，將有更多的多細(xì)胞生物基因組進(jìn)入設(shè)計(jì)合成研究的計(jì)劃。但目前合成基因組學(xué)的發(fā)展仍處于起步階段，還面臨著很多技術(shù)的挑戰(zhàn)。

圖2 基因組簡化的研究進(jìn)展［19，50-51］［（a）利用Tn5轉(zhuǎn)座子的衍生物將大腸桿菌K-12的基因組縮減200 kb［50］；（b）利用LATOUR刪除法將粟酒裂殖酵母基因組縮減657.3 kb［51］；（c）利用全基因組設(shè)計(jì)和化學(xué)合成的方法簡化支原體JCVI-syn1.0（1079 kb），通過設(shè)計(jì)、合成、測試三個(gè)步驟的循環(huán)，保留了必需基因和準(zhǔn)必需基因，得到支原體JCVI-syn3.0（531 kb，473個(gè)基因）［19］］Fig.2 Advances in genome simplification[19,50-51][(a)Simplification of the E.coli K-12 genome.The deletion procedure has reduced the genome at an average of 200 kb by using specialized transpo‐sons (Tn5 derivatives) to create deletions in the E. coli K-12 chromosome[50]. (b) Simplification of the Schizosaccharomyces pombe genome. Re‐searchers have reduced the genome of S. pombe by 657.3 kb using a large-scale gene deletion method called LATOUR[51]. (c) Simplification and chemical synthesis of M. mycoides genome. Using whole-genome design and complete chemical synthesis, researchers have minimized the 1079-kilobase pair synthetic genome of M.mycoides JCVI-syn1.0.Three cycles of design,synthesis, and testing,with the retention of essential and quasiessential genes,produced JCVI-syn3.0(531 kilobase pairs,473 genes)[19]]

基因組的理性設(shè)計(jì)需要借助更多的技術(shù)手段，例如利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)（computer-aided design ， CAD）進(jìn)行的大規(guī)?；蚪M設(shè)計(jì)以及利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行基因組的可視化和質(zhì)量控制等。目前使用的合成基因組CAD 軟件雖然可以進(jìn)行大規(guī)模的染色體水平DNA 序列設(shè)計(jì)，但設(shè)計(jì)后基因組的功能驗(yàn)證仍然只能通過實(shí)驗(yàn)來完成。開發(fā)根據(jù)基因組設(shè)計(jì)預(yù)測生物生存能力及表型的軟件還面臨著巨大的挑戰(zhàn)。伴隨著人工智能的發(fā)展，大量生物信息的整合，將來可以通過機(jī)器學(xué)習(xí)的方法來促進(jìn)人工基因組表型的預(yù)測。然而，目前數(shù)據(jù)不兼容及缺乏足夠的描述性元數(shù)據(jù)的問題還有待解決［29］。我們對基因組功能的了解逐漸深入，可以獲得的生物基本數(shù)據(jù)快速增多，這將可以幫助我們進(jìn)一步加大設(shè)計(jì)尺度，探究基因組設(shè)計(jì)的邊界。

Sc2.0 項(xiàng)目中提出的SCRaMbLE 系統(tǒng)可在短時(shí)間實(shí)現(xiàn)基因組大規(guī)模的重排， SCRaMbLE 系統(tǒng)的誘導(dǎo)方式、重排效率、應(yīng)用對象等方面也在不斷地改進(jìn)，但目前SCRaMbLE 系統(tǒng)大多只應(yīng)用于含有單條或兩條合成型染色體的菌株中。在酵母全基因組合成完成后，全基因組重排系統(tǒng)將會產(chǎn)生更多更復(fù)雜的染色體內(nèi)和染色體間的基因組重排。另一方面，目前SCRaMBLE 系統(tǒng)完全依賴于Creloxp 位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，還可以將與Cre 酶正交的重組酶系統(tǒng)引入已完成基因分區(qū)的細(xì)胞內(nèi)，構(gòu)建可誘導(dǎo)的基因組模塊化重排系統(tǒng)。越來越多的酪氨酸重組酶系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)，從最初的Cre/Loxp 和FLP/FRT系統(tǒng)到新發(fā)現(xiàn)的Vika/vox、Dre/rox、VCre/Vloxp、SCre/Sloxp 等系統(tǒng)均被證明可在異源宿主中發(fā)揮重組作用［53］，這些重組酶均可用于嘗試構(gòu)建正交化的重組系統(tǒng)。利用基因組模塊化重排系統(tǒng)有望解析不同的基因組合與生物性能的關(guān)聯(lián)性。

目前針對基因組簡化的方法主要是從理性簡化的角度，對已知的冗余基因、重復(fù)序列、高度可變區(qū)、轉(zhuǎn)座子以及內(nèi)含子等進(jìn)行刪除，通過不斷“設(shè)計(jì)-合成-測試”的循環(huán)來實(shí)現(xiàn)基因組的簡化，工作量較大。利用SCRaMBLE系統(tǒng)進(jìn)行多輪隨機(jī)刪除，還可在保證菌株適應(yīng)度的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)基因組的持續(xù)簡化，進(jìn)一步探究基因組簡化的規(guī)律。