張卉，袁姚夢，張翀，楊松，5，邢新會

（1 青島農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山東 青島 266109；2 青島農(nóng)業(yè)大學，山東省應用真菌重點實驗室，山東 青島266109； 3 清華大學化學工程系生物化工研究所，工業(yè)生物催化教育部重點實驗室，北京 100084；4 清華大學合成與系統(tǒng)生物學研究中心，北京 100084；5 青島農(nóng)業(yè)大學，青島生物沼氣環(huán)境微生物國際合作基地，山東 青島 266109）

生物經(jīng)濟成為綠色可持續(xù)產(chǎn)業(yè)和社會發(fā)展的重要模式，其核心是生物制造。然而，不可再生的化石資源和與人爭糧的糖基原料已經(jīng)難以作為最優(yōu)原料支撐工業(yè)生物制造的應用發(fā)展［1］，同時木質(zhì)纖維素原料目前仍存在預處理技術(shù)和經(jīng)濟性的局限，因此尋找合適的非糖替代原料是生物制造的重要挑戰(zhàn)［2］。廉價和來源廣泛的有機碳一原料甲醇，主要可以由煤和天然氣生產(chǎn)，并且通過沼氣或城市固體廢物產(chǎn)生的二氧化碳與電解生成的氫氣進行反應獲得可再生的甲醇［3-5］。與傳統(tǒng)的糖基原料相比，甲醇具有更高還原性，可作為碳源生產(chǎn)包括長鏈醇、有機酸和碳氫化合物在內(nèi)的高附加值的化學物質(zhì)［6-7］。

自然界中存在大量以甲醇為碳源的甲基營養(yǎng)型微生物，其獨特的代謝機制使得它們能夠以甲醇為唯一碳源和能源合成細胞生長需要的物質(zhì)和能量［8-9］。目前，自然界發(fā)現(xiàn)的利用甲醇的甲基營養(yǎng)型微生物主要包括甲基細菌和酵母菌，這些甲基微生物可以利用不同類型的甲醇脫氫酶（methanol dehydrogenases，Mdhs），包括吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone， PQQ） 依 賴 的Mdhs［10］、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴的Mdhs［11］、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依賴的醇氧化酶（Aods）［12］。盡管利用天然甲基營養(yǎng)型細菌將甲醇轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸［13-14］、3-羥基丙酸［15］和蛇麻烯［16］等化學產(chǎn)品的研究已經(jīng)取得一些進展，但由于存在遺傳背景不完全清楚、遺傳工具相對較少以及甲醇利用率偏低等局限，制約了天然甲基營養(yǎng)型細菌的廣泛應用發(fā)展［17-18］。近年來，以遺傳操作與工程化改造更為便捷的模式底盤微生物為基礎(chǔ)，將其代謝網(wǎng)絡重塑為能以甲醇作為碳源合成高附加值化學品的合成甲基營養(yǎng)細胞工廠成為重要發(fā)展方向。現(xiàn)有的研究一般利用模式底盤微生物（大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌、釀酒酵母等），通過引入天然甲基營養(yǎng)型微生物的甲醇同化途徑［19］，包括絲氨酸循環(huán)途徑（serine cycle）、核酮糖單磷酸途徑（ribulose monophosphate cycle，RuMP）、 木 酮 糖 單 磷 酸 途 徑 （xylulose monophosphate cycle， XuMP）或核酮糖二磷酸途徑（ribulose bisphosphate cycle， RuBP）構(gòu)建合成甲基營養(yǎng)細胞工廠，其中存在于天然甲基營養(yǎng)型微生物中的RuMP 能夠通過3-己酮糖-6-磷酸合成酶（3-hexulose-6-phosphate synthase， Hps）直接將甲醇氧化產(chǎn)物甲醛與核酮糖-5-磷酸（Ru5P）縮合生成己酮糖-6-磷酸（H6P），該過程可更高效利用輔因子及能量，被認為是十分有效的有機碳一同化途徑［20］。本文系統(tǒng)綜述了合成甲基營養(yǎng)細胞工廠的關(guān)鍵生物元件、核酮糖單磷酸途徑（RuMP）構(gòu)建與甲醇同化途徑設(shè)計優(yōu)化的研究現(xiàn)狀，進而結(jié)合合成甲基營養(yǎng)細胞工廠面臨的機遇和挑戰(zhàn)，對未來的研究方向進行展望。

1 合成甲基營養(yǎng)細胞工廠中甲醇氧化、同化基因及其調(diào)控元件

合成甲基營養(yǎng)細胞工廠中氧化甲醇的第一步反應，一般選用來源于革蘭氏陽性天然甲基營養(yǎng)菌且NAD 為輔助因子的Mdhs。主要原因是NAD依賴的Mdhs 在好氧和厭氧條件下都能將甲醇脫氫產(chǎn)生電子，用于生成代謝產(chǎn)物［21］。然而，該類Mdhs 催化甲醇活性偏低是合成甲基營養(yǎng)細胞工廠構(gòu)建的一個重大瓶頸［22-24］，亟需開發(fā)更加高效的Mdhs。Witthoff 等［25］首先在谷氨酸棒狀桿菌中構(gòu)建了RuMP途徑，發(fā)現(xiàn)異源表達來源于甲醇芽孢桿菌（Bacillus methanolicus）的Mdh 和內(nèi)源激活蛋白（endogenous activator protein，Act）效果最佳。在大腸桿菌中，Müller 等［26］發(fā)現(xiàn)了來自甲醇芽孢桿菌（B. methanolicus）的Mdh2 最有效。隨后，Wu 等［27］首次發(fā)現(xiàn)源于非甲基營養(yǎng)菌的鉤蟲貪銅菌（Cupriavidus necator N-1）中的Mdh2 在大腸桿菌中具有催化活性，并且通過酶定向性進化Mdh2，使其對甲醇催化效率提高6 倍。Whitaker等［22］也發(fā)現(xiàn)非甲基營養(yǎng)的嗜熱脂肪芽孢桿菌（B.stearothermophilus）中的Mdh在大腸桿菌中具有一定催化活性，其氧化甲醇的Km值較低，更加有利于甲醇氧化。最近，為了解決Mdhs 催化效率低的問題，Roth 等［28］用甲醛傳感器開發(fā)噬菌體輔助非連續(xù)進化（PANCE）方法，對來自甲醇芽孢桿菌的Mdh2 進行進化，使其催化活性提高3.5 倍，為Mdhs 進一步改造提供了理論基礎(chǔ)。甲醇氧化生成的甲醛，可以被RuMP途徑中的Hps和6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶（Phi）同化進入下游中心代謝。需要注意的是，除了Mdh、Hps 和Phi 之外，近年來還有研究報道通過計算并加以人工設(shè)計改造的酶，如甲醛酶（Fls）［29］和乙醇醛合成酶（Gal）［30］構(gòu)建全新的代謝路徑實現(xiàn)甲醛同化進入下游代謝。

研究者還發(fā)現(xiàn)通過蛋白組裝策略構(gòu)建的多酶復合物，可以快速固定甲醛，顯著提高甲醇利用效率。例如，Price 等［31］利用無支架的蛋白自組裝策略，使用SH3 配體的相互作用獲得Mdh-Hps-Phi的工程化超分子酶復合物，使得體外果糖-6-磷酸（F6P）的產(chǎn)量提高了97 倍，最終的甲醇體外消耗速率提高了2.3倍。同樣，F(xiàn)an等［32］通過融合蛋白策略，將嗜熱脂肪芽孢桿菌（B. stearothermophilus）來源的Mdh 與甲醇芽孢桿菌（B. methanolicus MGA3）來源的Hps 和Phi 進行融合表達，利用最優(yōu)柔性連接肽（GGGGS）3和（GGGGS）6連接Mdh、Hps 與Phi，形成的融合蛋白酶提高了甲醇氧化及轉(zhuǎn)化成F6P 的效率。在Mdh-Hps-Phi 多酶復合物的級聯(lián)反應中，通過酶復合物降低了酶分子的空間距離，提高甲醛轉(zhuǎn)化成F6P的代謝效率，強化了甲醇消耗。

此外，在合成甲基營養(yǎng)細胞工廠中，甲醇被Mdhs 氧化產(chǎn)生甲醛，而甲醛對細胞具有毒性，因此，甲醛誘導型啟動子（Pfrm）對于細胞工廠的構(gòu)建十分重要。Pfrm是大腸桿菌中的天然啟動子，受FrmR 蛋白的負反饋調(diào)控，只有在甲醛存在條件下，F(xiàn)rmR 才會優(yōu)先與甲醛結(jié)合，從而解除對啟動子Pfrm抑制，啟動下游基因表達［33-34］。利用這一特點，Rohlhill 等構(gòu)建了基于Pfrm誘導基因表達盒（mdh-hps-phi）表達的質(zhì)粒，避免了甲醛胞內(nèi)積累，實現(xiàn)了對mdh-hps-phi 操縱子的動態(tài)調(diào)控［35］。

2 合成甲基營養(yǎng)細胞工廠中構(gòu)建RuMP同化甲醇

天然甲基營養(yǎng)細胞工廠中的RuMP主要包括三個模塊：包含Hps 和Phi 的甲醛固定模塊；將F6P轉(zhuǎn)化成C3中間代謝物丙酮酸的轉(zhuǎn)化模塊；甲醛受體Ru5P 再生的碳重排模塊，其中高效的甲醛受體再生是甲醇同化的關(guān)鍵所在［5，23，36］。由于典型底盤細胞工廠擁有完整的糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)途徑，在其中引入天然甲基營養(yǎng)型微生物RuMP關(guān)鍵基因mdh、hps和phi，利用其代謝產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，并以糖基碳源作為輔助碳源，可以實現(xiàn)對甲醇的氧化同化。目前的研究策略主要包括：增強甲醛受體再生；共用糖基碳源結(jié)合實驗室適應性進化策略增強甲醇同化；合成甲基營養(yǎng)細胞工廠中甲醛代謝和還原力動態(tài)調(diào)控。

2.1 增強甲醛受體再生

合成甲基營養(yǎng)細胞工廠中甲醛受體Ru5P 不足是限制甲醇同化效率的關(guān)鍵原因，阻斷F6P 進入氧化型磷酸戊糖途徑的代謝流，提高非氧化戊糖磷 酸 途 徑 （non-oxidative pentose phosphate pathway， PPP）相關(guān)基因的表達，是增強Ru5P再生的一種策略。此外，異源表達編碼果糖二磷酸醛縮酶（Fba）和景天庚酮糖二磷酸酶（Glpx）的基因（圖1），并結(jié)合提高本源的6-磷酸果糖激酶（Pfk）、轉(zhuǎn)酮酶（Tkt）、核酮糖磷酸差向異構(gòu)酶（Rpe）和核糖磷酸異構(gòu)酶（Rpi）的表達量，是增強Ru5P 再生的另一策略。基于這些策略，Bennett 等［36-38］在合成甲基營養(yǎng)細胞工廠構(gòu)建時，敲除編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的基因pgi，阻斷了F6P 進入氧化型磷酸戊糖途徑的代謝流，并過表達甲醇芽孢桿菌中編碼五種酶（Pfk，F(xiàn)ba，Glpx，Rpe 和Tkt）的基因，強化了Ru5P 的前體物供給，從而顯著改善了甲醇在大腸桿菌中的同化效率。同樣，Woolston 等［23］過表達編碼Glpx 的基因，并利用小分子抑制劑（碘乙酸鹽）減少糖酵解途徑代謝流量，同樣提高了甲醇同化進入大腸桿菌中心碳代謝的效率。最近，Rohlhill 等［39］利用甲醛誘導啟動子Pfrm過表達pfk、fba、glpx、rpe 和tkt，實現(xiàn)動態(tài)調(diào)控Ru5P 再生，促進甲醇同化過程。

2.2 共用糖基碳源結(jié)合實驗室適應性進化策略強化甲醇同化

圖1 基于共用糖基碳源的合成甲基營養(yǎng)細胞工廠構(gòu)建的代謝途徑［36-38，41-45］（藍色指示代表RuMP途徑；橘色，紫色和灰色號分別指示在合成甲基營養(yǎng)細胞工廠構(gòu)建中敲除edd、rpi和maldh，并以葡萄糖酸為共用糖基的代謝途徑，敲除edd、rpi和pgi并以葡萄糖為共用糖基的代謝途徑以及敲除rpi以木糖為共用糖基的代謝途徑；綠色指示代表異源表達glpx和fba的基因；紅色指示代表亮氨酸響應調(diào)控蛋白的調(diào)控，其中“+”代表激活途徑，“－”代表抑制途徑）Fig.1 The construction of the synthetic methylotrophic cell factory based on the sugar as the co-substrate[36-38,41-45][The blue represents the Rump pathway; the orange, purple and gray represent the metabolic pathway of knocking out genes (edd, rpi and maldh) based on the gluconate as the co-substrate, knocking out genes (edd, rpi and pgi) using glucose as the the co-substrate, knocking out the gene rpi based on the xylose as the co-substrate, respectively; the green represents the heterologous expression of genes glpx and fba. The red represents the regulation of leucine-responsive protein, in which "+" represents the activation pathway and "－" represents the inhibition pathway]

由于在合成甲基營養(yǎng)細胞工廠中引入RuMP途徑的代謝通量偏少，目前研究者普遍以添加糖基碳源結(jié)合實驗室適應性進化（adaptive laboratory evolution，ALE）策略構(gòu)建甲醇利用的合成甲基營養(yǎng)細胞工廠［40］。其中，共用的糖基碳源被用于生成Ru5P，而甲醇主要提供合成甲基細胞中心代謝所需的碳源。因此，根據(jù)不同共用糖基碳源的代謝途徑，計算模擬設(shè)計出不同的營養(yǎng)缺陷菌株，進而結(jié)合ALE 策略以增強合成甲基營養(yǎng)細胞工廠利用甲醇的代謝通量。Meyer 等［41］首先基于模擬代謝網(wǎng)絡分析，發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌底盤中敲除編碼磷酸葡萄糖酸脫水酶的基因edd 和編碼核糖磷酸異構(gòu)酶的基因rpi（圖1）且引入甲醇同化途徑，以葡萄糖酸為共用糖基碳源，并加入0.1 g/L 酵母粉和20 mmol/L 丙酮酸作為輔助碳源，通過傳代培養(yǎng)初次獲得依賴甲醇生長的進化菌株MeSV1.1。隨后，通過敲除進化菌株MeSV1.1 編碼蘋果酸脫氫酶的基因maldh 以平衡胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，進而獲得更依賴甲醇生長的適應性進化菌株MeSV2.1和MeSV2.2。而最終進化菌株MeSV2.2在5 mmol/L 葡萄糖酸和500 mmol/L 甲醇作為碳源的情況下，培養(yǎng)100 h后OD600達到1.3，甲醇消耗速率達到了（13±7）mmol/（g·h）（以CDW計），接近天然的甲基營養(yǎng)菌。Bennett 等［42］以葡萄糖為共用糖基碳源，使進化的大腸桿菌獲得甲醇依賴性生長的特性，進化菌株的比生長速率可以達到0.15 h－1。Chen 等［43］以木糖為共用糖基碳源時，通過ALE 實驗，進化菌株能夠以等摩爾比消耗甲醇 和 木 糖， 獲 得0.17 h－1的 比 生 長 速 率。Tuyishime 等［44］以木糖為甲醇依賴生長工程菌的輔助糖基碳源，最終在谷氨酸棒桿菌進化菌株MX-11 中實現(xiàn)部分利用甲醇合成谷氨酸。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)某些氨基酸（如蘇氨酸）作為甲醇的共同利用底物，可以明顯提高甲醇利用效率，而且激活氨基酸的代謝途徑（即敲除亮氨酸響應調(diào)控蛋白Lrp），也可以提高合成甲基營養(yǎng)細胞工廠同化甲醇效率（圖1）［45］。除此之外，表1［46］總結(jié)了目前合成甲基營養(yǎng)細胞工廠構(gòu)建中，共用糖基碳源增強甲醇同化的研究進展。不同于上述工作，Liao 課題組2020 年最新研究報道利用代謝途徑理性設(shè)計與適應性進化策略，首次實現(xiàn)大腸桿菌底盤中構(gòu)建的合成甲基營養(yǎng)細胞工廠能夠以甲醇作為唯一碳源和能源進行生長，最終獲得的進化菌株倍增時間8.5 h，進化菌株SM1 在72 h 內(nèi)生物量OD600值達到2［24］。

實驗室適應性進化的結(jié)果如表2 所示，進化菌株突變基因的基本特點是降低了利用共用糖基碳源的相關(guān)酶催化活性，從而實現(xiàn)降低本源的碳代謝途徑和能量代謝途徑（如糖酵解途徑、Entner-Doudoroff 途徑和TCA 循環(huán)）的代謝流，以維持胞內(nèi)碳代謝流和氧化還原的平衡狀態(tài)。值得注意的是Liao 課題組近期研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)甲醛脫毒途徑相關(guān)基因的突變， 即進化菌株CFC526.16 編碼6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因發(fā)生SNP 突變，調(diào)低了Entner-Doudoroff 途徑代謝通量，從而實現(xiàn)RuMP 途徑、糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑的代謝平衡。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)在進化過程中存在插入序列介導的基因組上基因拷貝數(shù)動態(tài)變化現(xiàn)象，一段富含甲醇同化途徑和糖異生途徑所需基因的DNA 大片段（約70 kb）隨著細胞進化代數(shù)增加而相應增加片段拷貝數(shù)，這一動態(tài)變化是與進化菌株的高效甲醇同化代謝過程相一致的［24］。

表1 共用糖基碳源增強甲醇同化Tab.1 Enhancement of methanol assimilation based on the sugar as the co-substrate

表2 甲醇依賴菌株通過ALE獲得的有利突變Tab.2 Summary of mutations obtained by adaptive laboratory evolution in synthetic methanol-dependent strains

2.3 合成甲基營養(yǎng)細胞工廠中甲醛代謝和還原力動態(tài)調(diào)控

在合成甲基營養(yǎng)細胞工廠構(gòu)建中，引入異源Mdhs 不僅生成甲醛，還會伴隨還原力（還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADH）的產(chǎn)生。從熱力學角度分析，NADH 的積累會增加催化反應的吉布斯自由能，不利于合成甲基營養(yǎng)細胞工廠氧化甲醇的第一步反應。在以糖基作為碳源生長時，TCA 循環(huán)同樣也產(chǎn)生NADH，而天然甲基營養(yǎng)型細菌普遍缺少完整的TCA 循環(huán)，這就有利于NADH 平衡，而且有研究證明較低代謝活性的TCA 有 利 于 甲 醇 同 化［20］。基 于 此，Keller 等［40］在開展進化甲醇依賴菌株研究時，通過代謝流平衡分析（FBA）證實在葡萄糖酸鹽和甲醇的雙碳源下，生長不需要完整的TCA 循環(huán)，進而將TCA循環(huán)中依賴于NADH 的蘋果酸脫氫酶（Maldh）的基因敲除，以增加進化菌株對甲醇的依賴性。同樣，Rohlhill 等［39］也將干擾甲醛代謝的基因maldh 敲除，并使用甲醛誘導型啟動子Pfrm調(diào)控磷酸戊糖途徑的rpe 和tkt 基因表達。除此之外，為了克服NADH 積累，驅(qū)動甲醇氧化，Price 等［31］利用蛋白質(zhì)工程手段改造RuMP 關(guān)鍵酶活性時，使用大腸桿菌來源的乳酸脫氫酶（Ldh）催化丙酮酸，從而循環(huán)再生NAD+（圖2）以促進甲醇轉(zhuǎn)化。在合成甲基營養(yǎng)細胞工廠構(gòu)建中，多余的NADH 通過轉(zhuǎn)化酶再生為NADPH，從而有利于生產(chǎn)賴氨酸［47］和1，3-丙二醇［48］等高消耗NADPH的化學品。

圖2 細胞工廠內(nèi)甲醛代謝和還原力的動態(tài)調(diào)控Fig.2 Dynamic regulation of formaldehyde metabolism and reducing power in the cell factory

3 其他途徑在合成甲基營養(yǎng)細胞工廠中同化甲醇的應用

除了RuMP途徑，還可以引入并改造絲氨酸循環(huán)途徑和XuMP 途徑構(gòu)建合成甲基營養(yǎng)細胞工廠。而且，有研究者通過計算設(shè)計出簡化有機碳一同化途徑的新穎酶，通過人工合成甲醇利用途徑以實現(xiàn)甲醇的高效利用。

Liao 課題組［49］首先在大腸桿菌中重構(gòu)扭脫甲基桿菌（Methylorubrum extorquens）的絲氨酸循環(huán)途徑，以木糖作為共底物碳源，實現(xiàn)1分子甲酸和1 分子碳酸氫鹽生成1 分子乙酰輔酶A，該過程消耗3 分子ATP 和1 分子NADH。最近，Bar-Even 課題組［50］構(gòu)建的高絲氨酸循環(huán)途徑是依賴于大腸桿菌本源絲氨酸醛縮酶（serine aldolase， SAL）和4- 羥基-2- 氧代丁酸酯醛縮酶（4-hydroxy-2-oxobutanoate aldolase， HAL）的兩個混雜甲醛醛縮醛酶反應，該途徑只消耗1分子ATP生成乙酰輔酶A，其效率優(yōu)于改良的絲氨酸循環(huán)。在XuMP途徑重構(gòu)的研究中，姜岷教授課題組初次在釀酒酵母細胞基因組上整合畢赤酵母甲醇代謝途徑，實現(xiàn)釀酒酵母同化甲醇以增加生物量［51］。

Bogorad 等［52］將非氧化糖酵解（NOG）與RuMP 途徑相結(jié)合，將甲醇轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，形成了一種不依賴ATP 的非氧化糖酵解甲醇縮合途徑（MCC）。基于計算設(shè)計的甲醛酶（Fls）途徑、合成乙酰輔酶A（SACA）途徑和2-羥酰基輔酶A裂解酶（Hacl）途徑都是能夠代謝甲醛的線性途徑，是甲醇同化的可行性選擇［29，30，53］。其中，合成SACA途徑是現(xiàn)有途徑最短、ATP非依賴和氧氣不敏感的甲醇同化途徑，可獲得體外50%的甲醇同化效率［30］。最近，中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所的馬延和研究員課題組通過計算篩選出苯甲酰甲酸酯脫羧酶（Gals） 和轉(zhuǎn)醛縮酶（TalBF178Y）兩種工程酶進行人工反應，構(gòu)建了新的體外C1同化途徑（乙醇醛同化途徑），優(yōu)化該途徑使其碳效率達到88%［54］。

總之，計算設(shè)計獲得新穎途徑能力的不斷增強，可以加快碳同化效率，減少能量消耗，為高效同化甲醇合成甲基營養(yǎng)細胞工廠的工程化改造提供新思路。

4 合成甲基營養(yǎng)細胞工廠面臨的挑戰(zhàn)及未來展望

合成甲基營養(yǎng)細胞工廠的構(gòu)建，是基于天然甲基營養(yǎng)型微生物，借鑒其轉(zhuǎn)化和利用甲醇的代謝機制，利用工程化方法改造底盤細胞，從而構(gòu)建甲醇依賴型合成甲基營養(yǎng)菌株。由于模式底盤細胞的遺傳背景清晰、遺傳操作工具豐富、可工程化利用的生物元件成熟，蛋白質(zhì)工程改造和代謝產(chǎn)物生物傳感器的不斷發(fā)展，為合成甲基營養(yǎng)細胞工廠的創(chuàng)制提供了基礎(chǔ)保障［55-56］。

最近Liao 課題組突破性獲得以甲醇作為唯一碳源和能源生長的大腸桿菌進化菌株［24］，為深入研究合成甲基營養(yǎng)細胞工廠起到重要的推動作用。不過相比于天然甲基微生物倍增時間為3～4 h，合成甲基細胞工廠生長效力還顯著偏低［24］，如何進一步提高其生長速率和生物量得率，以實現(xiàn)合成甲基細胞工廠高效催化甲醇轉(zhuǎn)化成高附加值化學產(chǎn)品仍是研究焦點。目前以甲醇為唯一碳源和能源的合成甲基營養(yǎng)菌株構(gòu)建面臨著巨大挑戰(zhàn)，存在三大主要問題亟需解決。第一，甲醇和甲醛等物質(zhì)對細胞的毒性問題［57］。即使是天然甲基微生物，對有機醇類的耐受也有一定局限［14，58-60］。谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌等非甲基細菌對甲醇耐受性更低，為了解決這個問題，一方面，可以從甲醇依賴的谷氨酸棒狀桿菌或大腸桿菌的ALE 實驗中獲得相關(guān)基因的突變位點，開展甲醇耐受的組合突變改造；另一方面，可以利用全基因組規(guī)模CRISPRi技術(shù)開發(fā)的高通量基因型和表型關(guān)聯(lián)方法對菌體的耐受機制展開研究，獲得提升耐受性的關(guān)鍵功能基因位點［61-62］，此外也可以借鑒其他有機醇的耐受機制加以改造［59］。第二，甲醛和甲醛受體的合理匹配問題。胞內(nèi)甲醛不足導致RuMP途徑同化效率低的問題，可通過蛋白質(zhì)設(shè)計策略和甲醇生物傳感器輔助PANCE 的高通量篩選更高效異源Mdhs來解決［28］，而針對甲醛過量積累導致的細胞毒性，可以設(shè)計甲醛生物傳感器動態(tài)調(diào)控甲醛合成與同化的代謝過程。而解決甲醛受體再生問題，主要通過精細表達異源RuMP相關(guān)基因，或挖掘RuMP潛在局部轉(zhuǎn)錄調(diào)控子從轉(zhuǎn)錄層面進行系統(tǒng)優(yōu)化調(diào)控［19］。第三，理性設(shè)計結(jié)合ALE，驅(qū)動RuMP代謝流合理分配及向下游代謝途徑轉(zhuǎn)化。其中，通過增加前體物的含量、敲除旁支途徑使得RuMP代謝流在甲醇的選擇壓力下向下游代謝模塊途徑拖拽。最近以CO2為碳源的自養(yǎng)型大腸桿菌［63］和酵母菌［64］的研究充分證實理性設(shè)計和ALE相結(jié)合進行微生物代謝重塑的可行性。

然而，由于ALE 自發(fā)突變率很低，需要通過長期連續(xù)傳代培養(yǎng)以富集突變。近年來，包括CRISPRi［61］、CRISPRa［65］、CREATE［66］在 內(nèi) 的CRISPR 技術(shù)的迅速發(fā)展為在全基因組范圍內(nèi)定制化設(shè)計基因型干擾和突變奠定了基礎(chǔ)。在連續(xù)傳代方面，近幾年，eVOLVER 作為可定制的自動化細胞培養(yǎng)的集成裝置，根據(jù)用戶需求提供自動化培養(yǎng)生長的實驗參數(shù)，可以實現(xiàn)快速重新配置以適應幾乎所有的自動化連續(xù)培養(yǎng)實驗［67］。我們自主研發(fā)的基于液滴微流控技術(shù)的高通量自動化微生物連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)（MMC）［68］，可實現(xiàn)穩(wěn)定傳代100 代，顯著提升微生物適應性進化、耐受性表型樣本獲取的效率。未來需要將基于CRISPR 的全基因組靶向基因編輯技術(shù)與高通量自動化ALE 技術(shù)結(jié)合起來，能夠大幅度提升合成甲基營養(yǎng)細胞工廠的構(gòu)建效率，最終突破目前面臨的構(gòu)建以甲醇為唯一碳源的人工合成甲基營養(yǎng)細胞工廠的“生命暗物質(zhì)”瓶頸，為發(fā)展基于高效合成甲基營養(yǎng)細胞工廠的生物制造提供技術(shù)基礎(chǔ)。

符號說明

3PG——3-磷酸甘油酸(3-phosphoglycerate)

6PG—6-磷酸葡萄糖酸(6-phosphogluconate)

AcCoA— 乙酰輔酶A(acetyl-CoA)

DHAP— 磷酸二羥丙酮(dihydroxyacetone phosphate)

E4P— 赤蘚糖-4-磷酸(erythrose 4-phosphate)

Edd— 磷酸葡萄糖酸脫水酶(phosphogluconate dehydratase)

F6P——果糖-6-磷酸(fructose 6-phosphate)

Fba— 果糖二磷酸醛縮酶(fructose bisphosphate aldolase)

G3P—3-磷酸甘油醛(glyceraldehyde 3-phosphate)

G6P— 葡萄糖-6-磷酸(glucose 6-phosphate)

GlpX— 景天庚酮糖二磷酸酶(sedoheptulose bisphosphatase)

GltA——檸檬酸合成酶(citrate synthase)

Gly— 甘氨酸(glycine)

H6P— 己酮糖-6-磷酸(hexulose 6-phosphate)

Hps— 3-己酮糖-6-磷酸合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase)

Mal——蘋果酸(malate)

Maldh— 蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase)

Mdh— 甲醇脫氫酶（methanol dehydrogenase）

NADH— 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide hydride)

NADPH——還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydride)

OAA——草酰乙酸(oxaloacetate)

PEP— 磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate)

Pfk— 磷酸果糖激酶(phosphofructokinase)

Pgi— 磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(phosphoglucose isomerase)

Phi— 6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶(6-phospho 3-hexuloisomerase)

PYC——丙酮酸(pyruvate)

R5P— 核糖-5-磷酸(ribose 5-phosphate)

Rpe— 核酮糖磷酸差向異構(gòu)酶(ribulose phosphate epimerase)

Rpi——核糖磷酸異構(gòu)酶(ribose phosphate isomerase)

Ru5P— 核酮糖-5-磷酸(ribulose 5-phosphate)

S7P— 景天庚酮糖-7-磷酸(sedoheptulose 7-phosphate)

Ser— 絲氨酸(serine)

Tal— 轉(zhuǎn)醛酶(transaldolase)

Thr— 蘇氨酸t(yī)hreonine)

Tkt— 轉(zhuǎn)酮酶(transketolase)

Xu5P— 木酮糖-5-磷酸(xylulose 5-phosphate)