肖晗，劉宜欣

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部代謝與發(fā)育科學(xué)國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，上海200240）

絲狀真菌大多隸屬于子囊菌和擔(dān)子菌，是一類對(duì)生物、環(huán)境和材料等學(xué)科有著重要意義的微生物。絲狀真菌是蛋白分泌的理想宿主，其中曲霉屬和木霉屬的菌株被廣泛用于生產(chǎn)木聚糖酶和纖維素酶［1］。不少擔(dān)子菌因具有較強(qiáng)的重金屬吸附能力，在環(huán)境污染治理方面展示出較大潛力［2］。更為重要的是，絲狀真菌能天然合成多種具有重要生物學(xué)活性的次級(jí)代謝物，例如青霉菌生產(chǎn)的青霉素［3］、曲霉生產(chǎn)的洛伐他?。?］和靈芝生產(chǎn)的靈芝酸［5］等等，是生產(chǎn)高附加值化合物的細(xì)胞工廠。

基于絲狀真菌的各項(xiàng)基礎(chǔ)和應(yīng)用研究高度依賴基因編輯平臺(tái)，比如鑒定基因功能［6］、激活沉默基因簇［7］等。然而，絲狀真菌獨(dú)具的生理性能給這類微生物基因編輯平臺(tái)的構(gòu)建帶來(lái)挑戰(zhàn)。這主要表現(xiàn)在以下四方面：

（1）頂端生長(zhǎng) 絲狀真菌通過(guò)頂端菌絲體的分裂實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)，外源質(zhì)粒難以均勻分布到分裂的多個(gè)菌絲體中［8］。菌絲體的胞質(zhì)成分甚至細(xì)胞器可通過(guò)隔膜孔進(jìn)入到相鄰細(xì)胞中，造成抗性篩選的假陽(yáng)性。

（2）異核性 擔(dān)子菌中的菌絲體細(xì)胞通常包含2個(gè)不同的細(xì)胞核，如果包含有抗性篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子沒有同時(shí)整合到兩個(gè)核中，后續(xù)的轉(zhuǎn)化子由于分裂稀釋會(huì)不再包含抗性標(biāo)記［8］。

（3）同源重組效率低 同源重組是精準(zhǔn)基因編輯的基礎(chǔ)，大部分絲狀真菌中非同源性末端接合（non-homologous end joining， NHEJ）的修復(fù)機(jī)制占主導(dǎo)地位，很難實(shí)現(xiàn)基于同源重組的精準(zhǔn)基因編輯［9］。

（4）遺傳篩選標(biāo)記匱乏 由于遺傳操作工具不成熟，營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記在不少絲狀真菌中尚不可用，可用的篩選標(biāo)記僅有少數(shù)幾種抗生素（如萎銹靈［10］、潮霉素［8］等）的抗性基因。

近年來(lái)，基于RNA介導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶CRISPRCas 系統(tǒng)能在基因組特定位點(diǎn)引入DNA 或RNA 的鏈缺口，誘發(fā)宿主啟動(dòng)自身的防御機(jī)制修補(bǔ)缺口，大幅提高了同源重組效率，減少對(duì)篩選標(biāo)記的依賴，實(shí)現(xiàn)多個(gè)物種的多基因編輯［11-13］。隨著研究的深入，CRISPR-Cas 系統(tǒng)也被應(yīng)用于絲狀真菌中，為構(gòu)建成熟的絲狀真菌基因編輯平臺(tái)奠定基礎(chǔ)。本綜述重點(diǎn)介紹了近三年絲狀真菌基因編輯的最新進(jìn)展，討論了該系統(tǒng)協(xié)助絲狀真菌基因編輯存在的挑戰(zhàn)及可能的解決方法。

1 CRISPR-Cas 系統(tǒng)編輯絲狀真菌的進(jìn)展

自2015 年Liu 等首次將CRISPR-Cas 系統(tǒng)引入模式絲狀真菌里氏木霉中以來(lái)［14］，5 年多時(shí)間里，該系統(tǒng)在越來(lái)越多的絲狀真菌中成功構(gòu)建，它不但能更加高效、快速地編輯模式菌株，更為重要的是，它協(xié)助很多傳統(tǒng)方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)基因編輯的菌株進(jìn)行基因編輯［9，15］，大幅提高了人們對(duì)這類重要微生物的認(rèn)識(shí)和改造。本部分圍繞CRISPRCas 系統(tǒng)的遞送、體內(nèi)表達(dá)、同源臂設(shè)計(jì)和宿主改造幾方面介紹了其編輯絲狀真菌的進(jìn)展。

1.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的遞送

聚乙二醇（polyethylene glycerol，PEG）和根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（agrobacteriummediated transformation，AMT）是把CRISPR-Cas系統(tǒng)遞送到絲狀真菌中最主要的兩種方式［16］。外源DNA 片段經(jīng)PEG 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化后，通常以多拷貝的形式隨機(jī)整合到絲狀真菌基因組上［17］，而AMT則傾向于將外源片段以單拷貝的形式隨機(jī)整合到基因組上［18］。經(jīng)PEG 或AMT 遞送的CRISPR-Cas系統(tǒng)，可以是DNA、RNA［9，19］，也可以是體外表達(dá)的Cas 蛋白和體外轉(zhuǎn)錄的引導(dǎo)RNA（guide RNA，gRNA）組裝好的CRISPR-Cas 核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）［20-22］。由于提供了一種瞬時(shí)的、不依賴于體內(nèi)表達(dá)元件和遺傳篩選標(biāo)記的基因編輯方式，RNP在絲狀真菌中的應(yīng)用得到越來(lái)越多的關(guān)注。在2019年的一項(xiàng)研究中，Li等［23］開發(fā)了一種仿生礦化的RNP 遞送系統(tǒng)，將利用磷酸鈣礦化的納米顆粒承載RNP 遞送至植物病原真菌稻瘟病菌的原生質(zhì)體中。仿生礦化處理的RNP 可保護(hù)gRNA 免受酶水解，提高RNA 的穩(wěn)定性，保留Cas9蛋白的酶活性。同時(shí)，他們還使用聚丙烯酸改善仿生礦化的RNP 納米顆粒（biomimetic mineralized RNP nanoparticle，BM-RNP NP）的分散性。通過(guò)觀察與BM-RNP NP 有相似形態(tài)和尺寸分布的EGFP 納米顆粒（BM-EGFP NP）的遞送過(guò)程，發(fā)現(xiàn)BM-EGFP NP 附著在細(xì)胞膜表面可能會(huì)增加經(jīng)胞吞途徑被細(xì)胞攝取的概率。研究者將中斷編碼Sytalone dehydratase 的sdh 基因的BM-RNP NP 加入原生質(zhì)體中，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該基因的編輯效率達(dá)20%，而僅通過(guò)RNP 處理的細(xì)胞中該基因的表達(dá)并未發(fā)生明顯變化。進(jìn)一步序列分析顯示，用BM-RNP NP 處理的米曲霉在7 個(gè)潛在的脫靶位點(diǎn)均未發(fā)生變化。他們認(rèn)為使用仿生礦化的RNP 進(jìn)行基因編輯有望提供一種通用且不依賴DNA 的方法來(lái)提高編輯效率。

此外，CRISPR-Cas 系統(tǒng)還能介導(dǎo)外源片段在絲狀真菌中的定向整合，徹底改變外源片段隨機(jī)整合的遞送模式。Lu 等［24］在根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的TDNA 中間插入了靶向mfa2 基因的CRISPR-Cas 表達(dá)盒，在潮霉素篩選條件下，原本隨機(jī)插入的TDNA片段能定向插入到經(jīng)CRISPR-Cas切割的mfa2的靶位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)該基因的中斷。更進(jìn)一步地，將CRISPR-Cas 系統(tǒng)靶向到上述插入至mfa2 的CRISPR-Cas 表達(dá)盒的潮霉素抗性基因，可在潮霉素抗性基因的靶位點(diǎn)插入同義突變的mfa2 基因用以規(guī)避CRISPR-Cas 的識(shí)別，實(shí)現(xiàn)該基因的回補(bǔ)。類似地，通過(guò)巧妙設(shè)計(jì)CRISPR-Cas 系統(tǒng)，可將外源片段定向整合到基因組的特定位點(diǎn)。Sarkari等［25］首先利用CRISPR-Cas 系統(tǒng)破壞了黑曲霉（Aspergillus niger）整合靶位點(diǎn)pyrG 基因，使得突變株成為尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株。然后，在含有遞送外源片段的表達(dá)盒兩端引入回復(fù)pyrG 功能的同源臂，在同源臂的兩端再引入另一段靶向pyrG 的識(shí)別序列?；诖?，在體內(nèi)產(chǎn)生功能的CRISPR 系統(tǒng)將切割三處識(shí)別序列，切割含有外源片段質(zhì)粒的兩處后產(chǎn)生線性化的、與pyrG 具有同源臂的外源片段，該片段可定向插入到第三處切割pyrG 位點(diǎn)產(chǎn)生的雙鏈缺口處，此時(shí)pyrG功能得到回復(fù)。

1.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的體內(nèi)表達(dá)

在絲狀真菌中構(gòu)建基于CRISPR-Cas 的基因編輯系統(tǒng)的關(guān)鍵在于讓該系統(tǒng)在絲狀真菌中工作，即執(zhí)行對(duì)目標(biāo)DNA/RNA 的切割或靶向的功能。和體外表達(dá)CRISPR-Cas 系統(tǒng)相比，在絲狀真菌體內(nèi)表達(dá)CRISPR-Cas 系統(tǒng)具有不可替代的優(yōu)勢(shì)，也是CRISPR-Cas 系統(tǒng)在絲狀真菌中研究最多、發(fā)展最快的方向之一。其原因可能有兩方面：一方面是因?yàn)槌掷m(xù)表達(dá)的CRISPR-Cas 能提高對(duì)目標(biāo)DNA/RNA 的切割或靶向的概率，進(jìn)而提高基因編輯效率；另一方面，在表達(dá)Cas 蛋白的菌株中遞送gRNA 可降低Cas 蛋白和gRNA 無(wú)法進(jìn)入同一細(xì)胞核的風(fēng)險(xiǎn)。本小節(jié)將系統(tǒng)介紹Cas 蛋白和gRNA 在絲狀真菌體內(nèi)表達(dá)的進(jìn)展。

1.2.1 Cas蛋白的表達(dá)

Cas 蛋白的密碼子優(yōu)化被認(rèn)為是促使它在絲狀真菌中發(fā)揮功能的關(guān)鍵策略。Liu 等［14］嘗試用人源密碼子優(yōu)化的Cas9 在絲狀真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）中構(gòu)建CRISPR-Cas 系統(tǒng)時(shí)并未獲得成功，采用經(jīng)里氏木霉的密碼子優(yōu)化的Cas9 成功構(gòu)建了CRISPR-Cas9 系統(tǒng)。除了里氏木霉外，采用特定宿主密碼子優(yōu)化Cas9 的策略在多種絲狀真菌如稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）［26］、靈芝（Ganoderma lucidum）［9］等中，也成功構(gòu)建了基于CRISPR-Cas 的基因編輯系統(tǒng)。為了保證Cas 蛋白在絲狀真菌的高效表達(dá)，除了選用內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子外［27］，最新一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在Cas 蛋白中引入內(nèi)含子也能提高靈芝的基因編輯效率［28］。在Cas9 基因的上游引入靈芝內(nèi)源3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因gpd 5'端的內(nèi)含子可使得CRISPR-Cas9中斷5'-單磷酸脫羧酶編碼基因ura3 的效率提高10.6 倍，每轉(zhuǎn)化107個(gè)原生質(zhì)體可獲得14～18 個(gè)基因編輯的突變株，研究者推測(cè)這可能是因?yàn)閮?nèi)含子的加入有利于異源基因的mRNA 在擔(dān)子菌中的積累，進(jìn)一步增強(qiáng)蛋白的表達(dá)［28］。來(lái)源于構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）的AMA1 序列是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能在曲霉屬中自主復(fù)制的元件，Katayama等［29］利用截短至一半的AMA1 序列驅(qū)動(dòng)CRISPR 質(zhì)粒的復(fù)制，將多株米曲霉（Aspergillus oryzae）的基因編輯效率提高到50%～100%，這可能由于AMA1 在細(xì)胞以多拷貝的形式存在，提高了Cas9 和gRNA 的表達(dá)所致。在該質(zhì)粒上加入了能抑制菌絲體生長(zhǎng)的aoace2 基因表達(dá)盒，誘導(dǎo)表達(dá)該基因使得CRISPR 質(zhì)?？焖賮G失，便于多輪的基因編輯［29］。

另外，誘導(dǎo)表達(dá)的Cas9 由于可調(diào)控CRISPRCas系統(tǒng)基因編輯時(shí)的活力，減少脫靶效應(yīng)等，在絲狀真菌中也有不少應(yīng)用。Weber等［30］利用一個(gè)合成的四環(huán)素依賴的系統(tǒng)誘導(dǎo)Cas9 在煙曲霉（Aspergillus fumigatus）中表達(dá)，在轉(zhuǎn)化前加入四環(huán)素篩選表達(dá)Cas9 的菌株，將gRNA 表達(dá)盒和分裂失活的篩選標(biāo)記整合到基因組上，該分裂的篩選標(biāo)記中間有CRISPR-Cas 系統(tǒng)的靶向目標(biāo)基因的識(shí)別序列，兩側(cè)是自我同源序列，經(jīng)切割后同源重組回復(fù)篩選標(biāo)記的基因功能。通過(guò)該設(shè)計(jì)，可以經(jīng)篩選獲得靶基因發(fā)生編輯的突變體。

基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的靶向功能，Huang等［31］在黑曲霉（A. niger）中開發(fā)了單堿基編輯器。具體而言，他們將不具有切割DNA 活力的nCas9 或dCas9 與大鼠的胞嘧啶脫氨酶rAPOBEC1 融合，把CRISPR-Cas 識(shí)別的靶序列的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶（圖1）。該編輯器編輯報(bào)告基因pyrG 和fwnA 的效率為47.36%～100%，編輯非報(bào)告基因prtT 的效率為60%，當(dāng)胞嘧啶位于CRISPR-Cas 識(shí)別序列的第2到第9個(gè)位置之間時(shí)，均可被編輯。

雖然Cas9至今仍是絲狀真菌中應(yīng)用最多的Cas蛋白，但近兩年，開發(fā)Cas12a（Cpf1）在絲狀真菌中進(jìn)行基因編輯的研究逐漸增多［32-35］。Cas12a和Cas9 同屬于Class ⅡCRISPR-Cas 系統(tǒng)，識(shí)別序列、切割方式并不相同。Cas12a 識(shí)別的原間隔序列（protospacer）為5'端富含胸腺嘧啶的TTTN，而Cas9 識(shí)別的protospacer 為3'端富含鳥嘌呤的NGG；Cas12a 切割DNA 雙鏈產(chǎn)生黏性末端，而Cas9 切割雙鏈DNA 產(chǎn)生平末端。和Cas9 相比，Cas12a 可以識(shí)別一個(gè)簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)錄本中多個(gè)串聯(lián)的crRNA，為多基因編輯提供便利。Liu 等利用密碼子優(yōu)化的AsCpf1 在嗜熱毀絲菌（Myceliophthora thermophila）中構(gòu)建了基于CRISPR-Cas12a的多基因編輯系統(tǒng)。他們用一個(gè)單獨(dú)的crRNA 陣列或三個(gè)單獨(dú)的crRNA 同時(shí)靶向碳代謝抑制的轉(zhuǎn)錄因子cre-1 和兩個(gè)與纖維素酶生產(chǎn)相關(guān)的基因res-1 和gh1-1，在一步轉(zhuǎn)化中除了包括Cas12a 和crRNA 的庫(kù)（或單一陣列）以外，還有供體DNA 用于修復(fù)缺口。和只轉(zhuǎn)化供體DNA 的對(duì)照相比，用crRNA庫(kù)和crRNA 陣列分別達(dá)到40%和32%的三基因編輯效率?；贑RISPR-Cas12a 介導(dǎo)的高效多基因編輯，Liu 等［35］進(jìn)一步開發(fā)了CRISPR-Cas 輔助的標(biāo)記回收技術(shù)。在編輯的多基因的其中一個(gè)基因內(nèi)部插入neo 標(biāo)記，在第二次編輯其他基因時(shí)同時(shí)靶向neo將其敲除，同時(shí)引入bar標(biāo)記。以此類推，在連續(xù)轉(zhuǎn)化中迭代替換標(biāo)記基因，減少對(duì)多個(gè)篩選標(biāo)記的依賴。此外，研究者們還在構(gòu)巢曲霉（A.nidulans）［34］、棉阿舒囊霉菌（Ashbya gossypii）［33］等絲狀真菌中建立了基于CRISPR-Cas12a 的基因編輯工具。在最新的一項(xiàng)研究中，將不具有切割DNA活力的dCas12a 和一個(gè)含有三個(gè)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄激活因子VP64-p65-Rta（VPR）融合（圖1），靶向調(diào)節(jié)構(gòu)巢曲霉（A.nidulans）中生物合成基因簇的調(diào)控區(qū)域，可激活基因表達(dá)并提高天然產(chǎn)物的產(chǎn)量［32］。

1.2.2 gRNA的表達(dá)

作為CRISPR-Cas 系統(tǒng)中另一核心組成成分，gRNA 的高效表達(dá)對(duì)于該系統(tǒng)在絲狀真菌中功能實(shí)現(xiàn)也同樣重要。gRNA 在真核細(xì)胞中的表達(dá)是由RNA 聚合酶Ⅲ型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的，在對(duì)體內(nèi)RNA 聚合酶Ⅲ型啟動(dòng)子元件不甚清楚的時(shí)候，不少研究者采用了轉(zhuǎn)化經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄的成熟的gRNA 的方式，成功實(shí)現(xiàn)了黑曲霉（A.niger）［36］、里氏木霉（T.reesei）［14］、靈芝（G. lucidum）［9］、多節(jié)孢屬菌（Sporormiella minima）［37］等多種絲狀真菌的基因編輯。但是，和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄gRNA 相比，體外轉(zhuǎn)錄gRNA 雖然不依賴體內(nèi)的啟動(dòng)子元件轉(zhuǎn)錄，也存在以下局限：①成本高，過(guò)程復(fù)雜；②很難保證細(xì)胞對(duì)其完全吸收；③進(jìn)入胞內(nèi)后，在等待Cas蛋白表達(dá)的過(guò)程中，可能被胞內(nèi)RNA 酶降解而進(jìn)一步降低RNP 的濃度。此外，還有研究認(rèn)為體外轉(zhuǎn)錄的gRNA 由于穩(wěn)定性較差不適合轉(zhuǎn)化絲狀真菌［38］。

圖1 CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的絲狀真菌基因編輯［RNP—核糖核蛋白；BM-RNP—仿生礦化的RNP；PEG—聚乙二醇；AMT—根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化；DSB—DNA 雙鏈缺口；NHEJ—非同源末端連接；HR—同源重組；APOBEC1—載脂蛋白B mRNA 編輯酶（胞嘧啶脫氨酶）；VPR—含有三個(gè)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄激活因子；CRISPRa—CRISPR介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)］Fig.1 CRISPR-Cas system assisted gene editing for filamentous fungi(RNP—ribonucleoprotein; BM-RNP—biomimetic mineralized RNP; PEG—polyethylene glycerol; AMT—agrobacterium-mediated transformation;DSB—double stranded break;NHEJ—non-homologous end joining;HR—homologous recombination;APOBEC1—apolipoprotein B mRNA editing enzyme;VPR—VP64-p65-Rta,a tripartite transcriptional activator domain;CRISPRa—CRISPR activation)

不難看出，體內(nèi)轉(zhuǎn)錄gRNA的方法往往更受歡迎。在絲狀真菌中體內(nèi)表達(dá)gRNA主要分為兩類元件：一類是用RNA 聚合酶Ⅱ型啟動(dòng)子和具有自我剪切功能的核酶；另一類是用宿主內(nèi)源的RNA 聚合酶Ⅲ型啟動(dòng)子（圖2）。真核生物中RNA 聚合酶Ⅱ型啟動(dòng)子比Ⅲ型更為常見。但RNA 聚合酶Ⅱ型啟動(dòng)子負(fù)責(zé)mRNA 的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后會(huì)在轉(zhuǎn)錄本5'端加帽，3'端加PolyA 尾，引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行蛋白翻譯。在gRNA 的5'端引入錘頭型核酶HH和3'端引入丁型肝炎病毒（HDV）核酶將介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本自我剪切去掉兩端的修飾，避免后續(xù)出核而無(wú)法行使引導(dǎo)和靶向的功能。利用該方法驅(qū)動(dòng)gRNA 的表達(dá)在棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）［39］、互生交鏈孢菌（Alternaria alternata）［40］、皮炎芽生菌（Blastomyces dermatitidis）［41］、黑曲霉（A.niger）［42］等絲狀真菌中實(shí)現(xiàn)了基因編輯。關(guān)于利用宿主內(nèi)源的RNA 聚合酶Ⅲ型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gRNA的表達(dá)，u6 基因的啟動(dòng)子在絲狀真菌中使用最廣泛［15，43-46］。我們?cè)谧钚乱豁?xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，利用靈芝u6 基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gRNA 轉(zhuǎn)錄時(shí)，在3'端引入HDV 能進(jìn)一步提升基因編輯的效率，推測(cè)可能是因?yàn)橛蒔olyT 終止的轉(zhuǎn)錄本會(huì)產(chǎn)生不同長(zhǎng)短的含有T 的gRNA，而引入HDV 后產(chǎn)生了大小均一的gRNA，有利于RNP 更好地發(fā)揮功能［15］。除了U6啟動(dòng)子外，5S rRNA基因的啟動(dòng)子能更加高效驅(qū)動(dòng)gRNA 在黑曲霉中的表達(dá)。Zheng等［47］用5S rRNA基因啟動(dòng)子表達(dá)gRNA，中斷黑曲霉（A. niger）的一個(gè)假定的多肽合成酶編碼基因albA 的效率高達(dá)96%，而用不同的U6 啟動(dòng)子中斷albA 的效率只有15%～23%。他們還發(fā)現(xiàn)利用截短5'端區(qū)域的5S rRNA 基因啟動(dòng)子并沒有明顯降低CRISPR-Cas的編輯效率。此外，Song 等［48］測(cè)試了37 個(gè)tRNA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)CRISPR-Cas 系統(tǒng)在黑曲霉中基因編輯的效率，發(fā)現(xiàn)其中36 個(gè)都能成功介導(dǎo)目標(biāo)基因的編輯［48］。在2019 年的一項(xiàng)研究中，Shi 等［38］系統(tǒng)比較了三種體內(nèi)表達(dá)gRNA的方式對(duì)水稻惡苗病菌基因編輯效率的影響［38］。當(dāng)用RNA 聚合酶Ⅱ型啟動(dòng)子加上自我剪切核酶的方式中斷Fusarium cyclin C1 編碼基因fcc1 時(shí)，并不能獲得基因編輯的突變體。而用RNA 聚合酶Ⅲ型U6和5S rRNA 啟動(dòng)子中斷fcc1 時(shí)，效率分別是37.5%和79.2%，表明用5S rRNA啟動(dòng)子表達(dá)的策略更為有效［38］。

圖2 CRISPR-Cas系統(tǒng)在絲狀真菌中體內(nèi)表達(dá)策略（針對(duì)Cas 蛋白的體內(nèi)表達(dá)，有密碼子優(yōu)化，采用組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)蛋白表達(dá)和在Cas 基因5'端引入內(nèi)含子等策略。針對(duì)gRNA 的體內(nèi)表達(dá)，有用RNA 聚合酶II型啟動(dòng)子聯(lián)合具有自我剪切功能的核酶表達(dá)gRNA、RNA 聚合酶III型啟動(dòng)子表達(dá)gRNA、RNA 聚合酶III型啟動(dòng)子聯(lián)合具有自我剪切功能的核酶表達(dá)gRNA等策略）Fig.2 Strategies for in vivo expression of the CRISPR-Cas system in filamentous fungi（For in vivo expression of Cas protein,strategies include codon-optimization,adopting constitutive promoter for driving the expression of Cas protein,and incorporating intron sequence at the 5' end of cas gene. For in vivo expression of gRNA, strategies include adopting polymerase II promoter together with the self-cleaving ribozymes for gRNA expression,adopting polymerase III promoter for gRNA expression,and adopting polymerase III promoter together with the self-cleaving ribozyme for gRNA expression)

1.3 同源臂的設(shè)計(jì)

當(dāng)CRISPR-Cas 系統(tǒng)產(chǎn)生DNA 雙鏈缺口（double-strand break，DSB）時(shí)，宿主會(huì)通過(guò)非同源末端連接（none homologous end joining，NHEJ）或同源介導(dǎo)的修復(fù)（homology-directed repair， HDR）修補(bǔ)缺口（圖3）。盡管經(jīng)NHEJ 能在切割位點(diǎn)處缺失或插入片段可導(dǎo)致靶基因失活，但這樣的編輯方式具有隨機(jī)性，且不能引入研究者想要的變化。相比之下，HDR 則更為重要，因?yàn)樵贑RISPR-Cas 產(chǎn)生DSB 的同時(shí)引入HDR 供體修補(bǔ)缺口，宿主則有可能按照研究者的設(shè)計(jì)精準(zhǔn)編輯靶位點(diǎn)，為研究基因功能、定點(diǎn)突變等奠定基礎(chǔ)。關(guān)于同源重組供體的設(shè)計(jì)，在絲狀真菌中以線性雙鏈DNA 為主，通常在中心位置引入突變，兩側(cè)的同源臂緊鄰基因組DSBs，長(zhǎng)度為1～2kb 左右［15，49-52］。也有不少研究發(fā)現(xiàn)不超過(guò)40 bp 的短同源臂就能協(xié)助CRISPR-Cas 實(shí)現(xiàn)多種曲霉屬絲狀真菌的精準(zhǔn)基因編輯［53-54］。Dong等［54］還發(fā)現(xiàn)在黑曲霉中，同源臂距離雙鏈缺口越近，基因編輯效率越高。具體而言，他們?cè)O(shè)計(jì)了三段線性的雙鏈DNA供體，供體中間是抗性篩選標(biāo)記基因hygB，兩側(cè)同源臂長(zhǎng)度均為39 bp，距離切口分別為0 bp、1 kb和5 kb，經(jīng)CRISPR-Cas 介導(dǎo)的hygB 的整合效率分別是80%、50%和10%。除了線性同源重組供體外，Katayama 等［29］利用環(huán)狀DNA 供體在米曲霉（A. oryzae）中成功實(shí)現(xiàn)基因編輯（圖3）。此外，在里氏木霉（Trichoderma reesei）中，環(huán)狀DNA供體也可介導(dǎo)高效的基因編輯［14］。有研究者發(fā)現(xiàn)，和線性DNA供體相比，環(huán)狀DNA供體介導(dǎo)的靶基因編輯效率更高。他們推測(cè)原因是完整的環(huán)狀DNA 由于缺少DSB，不大會(huì)通過(guò)在絲狀真菌中占有主導(dǎo)地位的NHEJ修復(fù)途徑整合到染色體上，因此，降低了篩選的假陽(yáng)性率［39］。

圖3 同源重組供體的設(shè)計(jì)（線性雙鏈DNA 供體，其兩側(cè)同源臂長(zhǎng)39 bp， 距離CRISPR-Cas 系統(tǒng)產(chǎn)生的DNA 雙鏈缺口5 kb 以內(nèi)；環(huán)狀DNA 供體，兩側(cè)同源臂長(zhǎng)約0.5～2 kb，中間往往包含篩選標(biāo)記；單鏈寡核苷酸，供體中突變位點(diǎn)和PAM之間距離不超過(guò)7 bp）Fig.3 Design of homologous recombination donor(For linearized DNA,it is flanked by 39 bp HR arms,which are within 5 kb from DSB as generated by CRIPSR-Cas.For circular DNA,it is flanked by HR arms with the size from 0.5 to 2 kb, and a selective marker is usually contained in the middle. For oligo, the intended mutation and PAM sequence are interspaced by no more than 7 bp)

近年來(lái)，單鏈寡核苷酸也被設(shè)計(jì)用于CRISPRCas 編輯絲狀真菌基因時(shí)的同源重組供體。N?dvig等［55］設(shè)計(jì)了90 bp 的寡核苷酸鏈GE-Oligo1 和GEOligo2，分別與CRISPR-Cas 系統(tǒng)靶向的yA 基因的反義鏈和正義鏈互補(bǔ)，在供體中心引入了AAC 至TAA 的無(wú)義突變。無(wú)論轉(zhuǎn)化GE-Oligo1 還是GEOligo2，大于90%的轉(zhuǎn)化子都表現(xiàn)出yA 基因中斷的表型。隨機(jī)挑取基因中斷菌株測(cè)序發(fā)現(xiàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)化GE-Oligo1時(shí)，12個(gè)隨機(jī)挑取的基因中斷株中有10 株發(fā)生了和設(shè)計(jì)一致的變化，另外兩株除了包含設(shè)計(jì)的變化以外，一株在TAA 下游3 個(gè)堿基處發(fā)生了單堿基缺失，另一株在TAA 下游插入了69個(gè)堿基的重復(fù)序列；當(dāng)轉(zhuǎn)化GE-Oligo2時(shí)，所有隨機(jī)挑選基因中斷菌株都發(fā)生了和設(shè)計(jì)一致的變化，且沒有其他變化發(fā)生［55］。最近的一項(xiàng)研究表明，僅60 bp 長(zhǎng)度的單鏈寡核苷酸也可以協(xié)助CRISPR-Cas 系統(tǒng)精準(zhǔn)改變黑曲霉（A.niger）的靶序列，但需要精巧的設(shè)計(jì)。Kun 等［56］首先利用設(shè)計(jì)了90 bp 的單鏈寡核苷酸修復(fù)CRISPR-Cas 系統(tǒng)切割黑曲霉轉(zhuǎn)錄因子gaaR 的缺口，該供體包含了兩處點(diǎn)突變：一處是CRISPR-Cas 系統(tǒng)識(shí)別的PAM；另一處是距離PAM位點(diǎn)52 bp的突變。遺憾的是用該供體轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化子只在PAM 的位點(diǎn)發(fā)生了突變，離它較遠(yuǎn)的突變并沒有發(fā)生，保持同樣的設(shè)計(jì)，將寡核苷酸鏈長(zhǎng)度增加至200 bp 仍然不能獲得預(yù)期的變化，這說(shuō)明這些寡核苷酸修復(fù)模板并沒有完全插入到雙鏈缺口中。鑒于此，Kun 等重新設(shè)計(jì)了長(zhǎng)度為60 bp 的寡核苷酸供體，將PAM 和預(yù)期突變位點(diǎn)的距離縮短至7 個(gè)堿基。在挑取的5 個(gè)轉(zhuǎn)化子中，4 個(gè)發(fā)生了預(yù)期變化，僅有1 個(gè)轉(zhuǎn)化子只發(fā)生了PAM 位點(diǎn)的突變。他們還設(shè)計(jì)了另一條60 bp 的寡核苷酸修補(bǔ)模板，除了包括上述2 個(gè)突變外，在距離PAM 15 bp 范圍以內(nèi)還增加了5 處點(diǎn)突變。在隨機(jī)挑取的5 個(gè)轉(zhuǎn)化子中，同樣有4 個(gè)都發(fā)生了預(yù)期的7 處改變。綜上，研究者推測(cè)距離DSBs 5'端不長(zhǎng)于12個(gè)堿基的序列，更傾向于作為同源重組的修補(bǔ)模板［56］。

1.4 宿主的改造

在CRISPR-Cas 編輯絲狀真菌的研究中，針對(duì)宿主改造的研究尚不多見。如前所述，NHEJ 和HDR 是宿主修復(fù)DSB 的兩種形式，抑制或敲除NHEJ是大幅提高宿主HDR的有效策略，也是目前發(fā)現(xiàn)通過(guò)改造宿主細(xì)胞來(lái)提高CRISPR-Cas 精準(zhǔn)編輯絲狀真菌基因效率的唯一策略。研究者們通常使用NHEJ 途徑失活的絲狀真菌突變體為出發(fā)菌株，構(gòu)建CRISPR-Cas 系統(tǒng)［56-57］。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)在NHEJ 沒被抑制的絲狀菌株中，CRISPRCas 系統(tǒng)介導(dǎo)的微同源重組同樣能高效地發(fā)生［53］（表1），這提示我們可能存在不與NHEJ 競(jìng)爭(zhēng)的多種同源重組修復(fù)途徑。如何改造宿主對(duì)DSBs 進(jìn)行高效的修復(fù)，可能還需依賴CRISPR-Cas 等工具首先解析絲狀真菌中的相關(guān)修復(fù)途徑，才可能提出行之有效的策略。

2 CRISPR-Cas系統(tǒng)編輯絲狀真菌的挑戰(zhàn)及可能的解決方法

CRISPR-Cas 系統(tǒng)改變了外源片段在絲狀真菌中的整合方式，不僅大幅提高多種模式菌株如構(gòu)巢曲霉（A. nidulans）、里氏木霉（T. reesei）等基因編輯的效率，甚至實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)方法無(wú)法編輯的、遺傳操作困難的非模式菌株如靈芝（G. lucidum）等的精準(zhǔn)基因編輯［9，15］。盡管如此，CRISPR-Cas系統(tǒng)并沒有改變外源片段轉(zhuǎn)化絲狀真菌的效率，此外，編輯效率低也是CRISPR-Cas 系統(tǒng)在非模式絲狀真菌中應(yīng)用的另一大挑戰(zhàn)（表1），本小節(jié)將針對(duì)這些挑戰(zhàn)分析可能的原因并提出對(duì)應(yīng)的解決辦法。

2.1 轉(zhuǎn)化效率低

絲狀真菌的細(xì)胞壁是吸收外源DNA 的障礙，人們往往以去掉細(xì)胞壁的原生質(zhì)體作為受體接受外源片段，而原生質(zhì)體的低再生率限制了轉(zhuǎn)化效率［58］。嘗試開發(fā)不依賴于原生質(zhì)體的遞送外源片段的方式可能是一種解決方法，這可以從其他難操作宿主的遞送方式的有關(guān)研究中獲得啟發(fā)。在2015 年的一項(xiàng)研究中，研究者設(shè)計(jì)了菱形縮頸的芯片，當(dāng)細(xì)胞通過(guò)比其直徑小的縮頸時(shí)，經(jīng)歷快速的機(jī)械變形可形成短暫的膜破裂或孔洞，gRNA和Cas 蛋白在此時(shí)可以從周圍的介質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞中。利用該方法，Han等［59］成功將CRISPR-Cas系統(tǒng)遞送到了多種細(xì)胞中，包括難于轉(zhuǎn)染的淋巴瘤細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。此外，向自然界學(xué)習(xí)病毒侵染絲狀真菌的過(guò)程［60］，也可開發(fā)高效的、不依賴于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的外源片段遞送方式，其關(guān)鍵在于系統(tǒng)鑒定病毒在絲狀真菌體內(nèi)的復(fù)制元件。退而求其次，即便經(jīng)原生質(zhì)體再生限制了轉(zhuǎn)化效率，挖掘菌株特異的自主復(fù)制元件用于裝載外源片段，也能極大地提高轉(zhuǎn)化效率。在前文中提到，AMA1是曲霉屬中唯一發(fā)現(xiàn)的自主復(fù)制元件，有研究表明它能把黑曲霉（A.niger）的轉(zhuǎn)化效率提高10～100 倍［61］， 也 可 在 產(chǎn) 黃 青 霉 菌（Penicillium chrysogenum）中實(shí)現(xiàn)高效的基因敲除［20］。

表1 CRISPR-Cas系統(tǒng)編輯絲狀真菌的典型例子Tab.1 Examples of CRISPR-Cas system assisted gene editing in filamentous fungi.

2.2 編輯效率低

CRISPR-Cas 系統(tǒng)編輯一些絲狀真菌的效率較低，可能有以下幾方面原因：第一，CRISPR-Cas系統(tǒng)發(fā)揮功能的前提是Cas 蛋白和gRNA 同時(shí)進(jìn)入同一個(gè)細(xì)胞核對(duì)DNA 進(jìn)行切除，很多絲狀真菌具有異核性，中斷其中一個(gè)細(xì)胞核的基因并不意味著另一個(gè)細(xì)胞核的基因能被有效中斷，這樣的菌株往往因?yàn)槿匀痪哂性摶虻墓δ芏槐缓Y選獲得；第二，絲狀真菌內(nèi)源的防御機(jī)制阻礙CRISPRCas 系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞；第三，絲狀真菌內(nèi)源的防御機(jī)制包括重復(fù)序列誘發(fā)的點(diǎn)突變和RNA 沉默等［62］，抑制了CRISPR-Cas系統(tǒng)的活力，導(dǎo)致即便CRIPSR-Cas系統(tǒng)同時(shí)進(jìn)入所有細(xì)胞核，它們卻不能有效行使靶向和/或切割功能，進(jìn)而降低了編輯效率。

針對(duì)第一點(diǎn)，通過(guò)孢子分離等手段獲得單核、單倍體的突變體，以它為出發(fā)菌株進(jìn)行基因編輯，或許是一種解決辦法。針對(duì)第二點(diǎn)和第三點(diǎn)，消除或緩解絲狀真菌的多種內(nèi)源防御是建立在對(duì)其充分認(rèn)識(shí)和理解基礎(chǔ)之上的。而正因?yàn)椴磺宄烙鶛C(jī)制的關(guān)鍵遺傳決定因子，導(dǎo)致某些絲狀真菌的編輯效率無(wú)法得到顯著提高。鑒于此，構(gòu)建親緣關(guān)系相近的模式絲狀真菌的全基因組基因中斷突變體庫(kù)，利用報(bào)告系統(tǒng)考察突變體的表型，將有效地協(xié)助研究者解決上述問題。

3 總結(jié)與展望

絲狀真菌成熟基因編輯平臺(tái)的構(gòu)建，對(duì)挖掘這類微生物在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等多種行業(yè)的應(yīng)用價(jià)值與潛力起關(guān)鍵作用。CRISPR-Cas 系統(tǒng)由于其組成和設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、特定靶向的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)在多種模式和/或非模式絲狀真菌中得到越來(lái)越多的應(yīng)用?；贑RISPR-Cas 系統(tǒng)開發(fā)的絲狀真菌基因編輯形式包括特定位點(diǎn)的插入［24-25］、缺失［9］、堿基轉(zhuǎn)換［31］和轉(zhuǎn)錄激活［32］。編輯的基因涵蓋了易篩選的標(biāo)記基因［14］，非篩選標(biāo)記的其他功能基因［15］，甚至功能未知的基因［63］，同時(shí)編輯的5個(gè)基因［33］。編輯的尺度可以是改變1 個(gè)堿基［55-56］，也可以是缺失長(zhǎng)達(dá)48 kb的基因簇［47］。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)中斷宿主NHEJ 的關(guān)鍵基因和精妙的同源重組供體設(shè)計(jì)，使得CRISPR-Cas 系統(tǒng)能在特定位點(diǎn)引入變化，提高了編輯的精準(zhǔn)性。

CRISPR-Cas 系統(tǒng)確實(shí)提高了不少絲狀真菌的同源重組效率，在有些菌株中能達(dá)到100%的編輯效率，節(jié)省了篩選標(biāo)記的使用，克服了這類微生物可使用篩選標(biāo)記少的限制［35］。然而，在大多數(shù)非模式絲狀真菌中，CRISPR-Cas 系統(tǒng)的基因編輯效率并不高［15，64］，很可能是因?yàn)槿藗儗?duì)這些難操作的宿主的代謝調(diào)控、防御機(jī)制認(rèn)識(shí)有限，尚不清楚宿主特異性限制CRISPR-Cas 功能的決定因素。如2.2 中所討論的，構(gòu)建全基因組范圍的基因中斷突變體庫(kù)將為解決這一基礎(chǔ)科學(xué)問題奠定基礎(chǔ)。關(guān)于構(gòu)建全基因組范圍的突變體庫(kù)，我們目前已在一些模式絲狀真菌如Aspergillus nidulans［65］、Neurospora crassa［66］等中看到希望。

致謝：感謝科技部“國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃”（2018YFA09 00600）、國(guó)家自然科學(xué)基金（319713144和31600071）和上海市自然科學(xué)基金（17ZR1448900 和18ZR1420300）對(duì)肖晗博士的資助。感謝上海交通大學(xué)鐘建江教授等的支持和有益討論。