李祎，林振泉，劉子鶴

（1 北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029；2 北京化工大學(xué)北京軟物質(zhì)科學(xué)與工程高精尖創(chuàng)新中心，北京100029）

自然進(jìn)化是連續(xù)且不斷篩選的，具體過程包括遺傳多樣性的產(chǎn)生、選擇壓力的脅迫以及適應(yīng)性后代的繁殖等［1］。長期以來，人類一直試圖加快和控制這一過程，以快速獲得具有優(yōu)良表型的生物體或特定生物分子［2］。適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化（adaptive laboratory evolution，ALE）以特定或逐漸增加的脅迫來篩選性能優(yōu)良的突變體，即人為復(fù)制了自然進(jìn)化的過程［3］，并獲得在特定條件下魯棒性較好的突變體［4］。以特定的親本菌株出發(fā)，在基因組水平上對遺傳物質(zhì)進(jìn)行突變或者重組，以創(chuàng)建群體多樣性文庫；將群體文庫在特定的培養(yǎng)條件中進(jìn)行培養(yǎng)，篩選目標(biāo)性狀的菌株［5］。根據(jù)進(jìn)化時間的長短可以將ALE 技術(shù)分為長期模式和短期模式［6］。長期模式通常經(jīng)歷數(shù)百次的傳代，而短期模式往往僅需幾十次甚至數(shù)十小時的傳代即可完成［7］。ALE 過程可能會出現(xiàn)權(quán)衡（tradeoffs）現(xiàn)象，即在選擇壓力下出現(xiàn)相關(guān)變化沿相反方向發(fā)生的事件，而此時可通過適當(dāng)減弱選擇壓力等方法進(jìn)行規(guī)避［8］。ALE 策略已經(jīng)廣泛應(yīng)用于構(gòu)建耐高滲、耐酸性及耐熱性等菌株［9-11］。

多樣性文庫的質(zhì)量直接影響實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化的效率，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化主要是通過物理/化學(xué) 誘 變 方 法［12-18］、轉(zhuǎn) 座 子 突 變［19-21］、基 因 改組［22-25］、易錯PCR［26-28］等方式獲得多樣性突變文庫。近年來，隨著系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究人員開發(fā)出多種基于全基因組水平的多位點(diǎn)多樣性文庫的構(gòu)建策略。為了適應(yīng)當(dāng)前高通量甚至超高通量的研究趨勢［29］，同時快速地復(fù)制自然進(jìn)化的全部過程，自動化連續(xù)進(jìn)化策略成為進(jìn)化工程重要的發(fā)展方向。

釀酒酵母具有遺傳背景清晰、基因操作手段豐富、可利用碳源廣泛等優(yōu)勢［30-32］，已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生物基化學(xué)品和燃料［33］，如類異戊二烯、莽草酸、纖維素乙醇等［34-38］。本綜述將著重介紹近年來在釀酒酵母中基于全基因組水平的多位點(diǎn)快速進(jìn)化及體內(nèi)連續(xù)進(jìn)化的研究進(jìn)展，通過對基因組的編輯，以產(chǎn)生具有遺傳多樣性的細(xì)胞群體，能夠在短期內(nèi)獲得目標(biāo)性狀。

1 基于基因組水平的多位點(diǎn)進(jìn)化策略

由于細(xì)胞代謝過程受到高度的調(diào)控及生物系統(tǒng)的復(fù)雜性，許多遺傳表型不僅需要對目標(biāo)途徑進(jìn)行有效的調(diào)控，還需要在基因組水平進(jìn)行多位點(diǎn)的編輯調(diào)控［39］。因此，基于基因組規(guī)模的多位點(diǎn)進(jìn)化策略能夠有效提高目標(biāo)性狀，減少進(jìn)化所需的時間和成本，是進(jìn)化工程重要的研究熱點(diǎn)之一。

本節(jié)將介紹3類在釀酒酵母中基于基因組的多位點(diǎn)快速進(jìn)化工具（表1）：重組酶介導(dǎo)的進(jìn)化工程、基于寡核苷酸的多位點(diǎn)進(jìn)化工具和CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列）介導(dǎo)的多位點(diǎn)編輯。

1.1 基于重組酶介導(dǎo)的進(jìn)化工程

隨著基因組測序和基因合成技術(shù)的發(fā)展，基因組規(guī)模的分析為微生物進(jìn)化的深度研究提供了有效工具，實(shí)現(xiàn)可在堿基對水平和基因組規(guī)模上對DNA 序列進(jìn)行“讀”和“寫”［46］。合成酵母基因組計(jì)劃（Sc2.0）是世界上首個真核基因組合成項(xiàng)目，旨在合成一個高適應(yīng)性及通用性的人工合成酵母基因組［47］。Sc2.0 人工合成基因組中添加了loxPsym 位點(diǎn)［48］，Cre 重組酶能夠特異性識別并介導(dǎo)不同loxPsym 位點(diǎn)（對稱的loxP序列）之間進(jìn)行重組，建立合成型釀酒酵母基因組重排（synthetic chromosome rearrangement and modification by loxPmediated evolution，SCRaMbLE）［49］。SCRaMbLE系統(tǒng)（圖1）通過非必需基因終止密碼子后3 bp 處添加loxPsym 序列，實(shí)現(xiàn)全基因組范圍內(nèi)loxPsym位點(diǎn)間的DNA 片段缺失、倒置、重復(fù)和異位，以產(chǎn)生大量不同基因型-表型的酵母菌株，快速獲得大量的酵母多樣性文庫［33，40］。

表1 釀酒酵母中基因組的多位點(diǎn)快速進(jìn)化工具Tab.1 Multi-site rapid evolution tools for genome in S.cerevisiae

圖1 SCRaMbLE技術(shù)Fig.1 Schematic for SCRaMbLE technology

1.1.1 精準(zhǔn)控制與篩選SCRaMbLE的重排策略

通過β-雌二醇誘導(dǎo)Cre 重組酶表達(dá)激活SCRaMbLE 系統(tǒng)，Cre 重組酶的泄露表達(dá)會影響人工合成染色體的穩(wěn)定性甚至致死，因此需要對Cre重組酶的表達(dá)進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控［50］。Jia 等［51］構(gòu)建了邏輯“與”門開關(guān)控制Cre的表達(dá)，通過半乳糖誘導(dǎo)Cre-EBD 表達(dá)，再將Cre-EBD 結(jié)合雌二醇以形成有活性的Cre重組酶，可在轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞定位水平上調(diào)節(jié)單、雙倍體酵母中的SCRaMbLE。除此之外，Hochrein等［52］將Cre的N末端和C末端分裂，再分別與光敏色素B 和作用因子PIF3 相融合構(gòu)建L-SCRaMbLE 系統(tǒng)，未激活時兩端處于分離狀態(tài)，經(jīng)紅光照射后光敏色素B 和作用因子PIF3 相互作用以重構(gòu)Cre 重組酶使其恢復(fù)功能。L-SCRaMbLE策略可有效控制Cre重組酶泄露表達(dá)，并通過誘導(dǎo)時間、光劑量和感受器濃度控制Cre 重組酶的活性，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)控制基因組重排。

SCRaMbLE 系統(tǒng)利用染色體重排產(chǎn)生了多種基因型的菌株，高效的篩選方法是獲得目標(biāo)菌株的必要途徑。Luo 等［53］通過在loxP 位點(diǎn)的兩翼設(shè)計(jì)對向排列且不攜帶起始密碼子的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記“URA3ΔATG-LEU2ΔATG”模塊，構(gòu)建了高效篩選重組細(xì)胞的ReSCuES 系統(tǒng)（SCRaMbLEd cells using efficient selection）。由于模塊的側(cè)面是兩個相對的loxP位點(diǎn)，其中l(wèi)oxP位點(diǎn)與loxPsym位點(diǎn)之間不會進(jìn)行重組，只有當(dāng)Cre重組酶誘導(dǎo)基因組重排時，模塊才會發(fā)生翻轉(zhuǎn)（LEU2 表達(dá)的同時會關(guān)閉URA3 的表達(dá)），導(dǎo)致兩個標(biāo)記分別處于“開”和“關(guān)”的狀態(tài)，通過缺陷型培養(yǎng)基即可篩選出發(fā)生基因組重排的突變株。利用以上策略精準(zhǔn)控制和篩選SCRaMbLE 菌株，大大縮短了試驗(yàn)時間并減少了煩瑣的操作，加速全基因組規(guī)模的進(jìn)化。

1.1.2 基于SCRaMbLE系統(tǒng)的基因組工程

Wu 等［54］開發(fā)了一個基于結(jié)構(gòu)變異的體外SCRaMbLE 系統(tǒng)，并提出“自上而下”和“自下而上”兩種策略?！白陨隙隆辈呗裕蹐D2（a）］利用純化的DNA 重組酶在體外對人工合成環(huán)形synV 染色體的loxPsym 位點(diǎn)間的序列進(jìn)行修飾，在Cre重組酶的誘導(dǎo)下，隨機(jī)地刪除、倒置、異位或重復(fù)loxPsym 位點(diǎn)相鄰的轉(zhuǎn)錄單元（transcription unit，TU）。“自下而上”策略［圖2（b）］由載體和供體片段構(gòu)成，且演化出兩種獨(dú)立的模式：第1個模式的載體具有兩個loxPsym 位點(diǎn)，供體片段每個都帶有TU 和URA3 基因（陽性選擇標(biāo)記）；第2 個模式的載體只含有一個loxPsym 位點(diǎn)，一個或多個供體片段的重組模式進(jìn)入該位點(diǎn)可將URA3 啟動子和編碼序列物理分離。載體、供體庫與Cre重組酶在體外混合使TU 隨機(jī)插入loxPsym 位點(diǎn)，通過TU復(fù)制數(shù)量和方向的變化實(shí)現(xiàn)基因重排。

為了優(yōu)化異源表達(dá)中的途徑和底盤適配性等問題，Liu 等［41］開發(fā)了一種基于SCRaMbLE 的組合策略SCRaMbLE-in［圖2（c）］。首先在體外使用純化的重組酶將調(diào)控元件整合到目標(biāo)途徑中，使目標(biāo)基因表達(dá)多樣化；再通過SCRaMbLE 將組裝的途徑隨機(jī)整合到合成酵母染色體中，誘導(dǎo)基因組重排獲得基因表達(dá)多樣化和底盤優(yōu)化的菌群文庫，實(shí)現(xiàn)了快速的基因組進(jìn)化。由于染色體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對染色體重排起著重要作用，Wang 等［55］應(yīng)用SCRaMbLE 技術(shù)對環(huán)狀synⅤ染色體進(jìn)行基因組重排，發(fā)生了特定染色體的非整倍性重復(fù)，與線性synⅤ相比，SCRaMbLEd的環(huán)狀染色體出現(xiàn)大量的重復(fù)現(xiàn)象。因此，通過對環(huán)狀染色體進(jìn)行基因重排可連續(xù)地產(chǎn)生復(fù)雜的基因型和表型，深入探索了染色體結(jié)構(gòu)對生物表型多樣性的重要影響。

圖2 體外SCRaMbLE［54］與SCRaMbLE-in技術(shù)Fig.2 Schematic for in vitro SCRaMbLE[54]and SCRaMbLE-in technology

SCRaMbLE 系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于提升類胡蘿卜素、青霉素等產(chǎn)量［41，51，55-56］，以及提高底盤細(xì)胞對酸、堿和高滲等耐受性［53，56-58］。由于染色體結(jié)構(gòu)改變和非整數(shù)倍的研究往往基于單個基因組的靜態(tài)對比，SCRaMbLE 系統(tǒng)提供了一個強(qiáng)大的平臺，通過生成大量的基因組結(jié)構(gòu)變異庫，為深入認(rèn)識染色體性狀提供了有效手段［59］。

1.2 基于寡核苷酸的多位點(diǎn)進(jìn)化工具

可以利用生物體自身同源重組介導(dǎo)的修復(fù)機(jī)制引入突變位點(diǎn)，通過引入含堿基突變的寡核苷酸建立突變文庫［60］。2013 年，DiCarlo 等［61］報(bào)告了一種在釀酒酵母中以寡核苷酸介導(dǎo)的基因組多位點(diǎn)編輯技術(shù)YOGE（yeast oligo-mediated genome engineering）。通過敲除錯配修復(fù)相關(guān)的基因Mlh1和Msh2、過表達(dá)DNA 重組酶Rad51 和Rad54 以及優(yōu)化寡核苷酸的設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)化量，將寡核苷酸的錯配率提高到0.2%～2.0%。通過迭代循環(huán)YOGE 的方式可以逐步富集所需基因型，從而在每個循環(huán)中獲得更高的頻率。等位基因替換效率（allelic replacement frequencies，ARF）2%仍不足以進(jìn)行多位點(diǎn)、規(guī)?；幕蚪M編輯［39］。

2017年，Barbieri等［62］利用羥基脲減慢復(fù)制叉移動速度、敲除Rad51 基因以提高ARF，在釀酒酵母DNA復(fù)制過程中建立了基于滯后鏈上退火合成寡核苷酸的多重基因組工程技術(shù)eMAGE（eukaryotic MAGE）。在DNA 復(fù)制起始階段，錯配的ssODN（single-stranded DNA oligodeoxynucleotides）由ssDNA退火蛋白（ssDNA annealing protein）介導(dǎo)，在復(fù)制叉的后隨鏈上退火并整合到基因組上引起突變。單個堿基對的錯配、插入或缺失的ARF>40%，對于30 bp 錯配和100 bp 缺失的ARF 只有10%。利用多輪eMAGE 循環(huán)可提高大片段或多個寡核苷酸的ARF，在酵母中引入異源β-胡蘿卜素途徑，并設(shè)計(jì)了74 個精確靶向啟動子、開放閱讀框和終止子的ssODNs 庫，經(jīng)過一輪eMAGE 循環(huán)獲得大量具有不同基因型-表型的菌株。此外，eMAGE可以實(shí)現(xiàn)自動化，為釀酒酵母多位點(diǎn)快速編輯提供了一種高效的編輯策略。

1.3 基于CRISPR系統(tǒng)介導(dǎo)的多位點(diǎn)編輯

同源定向修復(fù)（homology directed repair，HDR）和非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）是雙鏈斷裂（double strand breaks，DSB）修復(fù)的兩種方式，HDR 是釀酒酵母中DSB 的主要修復(fù)方式［63］。近年來，釀酒酵母中CRISPR系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯工具得到了快速發(fā)展，其中利用CRISPR 系統(tǒng)介導(dǎo)的多位點(diǎn)基因編輯技術(shù)構(gòu)建高通量多樣性文庫以進(jìn)行多位點(diǎn)快速進(jìn)化取得極大發(fā)展［64-66］。

1.3.1 基于CRISPR系統(tǒng)的基因組編輯

CRISPR 系統(tǒng)的靶向性取決于目標(biāo)DNA 與gRNA 的互補(bǔ)配對，以及對PAM（protospacer adjacent motif）位點(diǎn)的特異識別，可實(shí)現(xiàn)基因組規(guī)模的編輯［67］。2017 年，Bao 等［43］構(gòu)建了一種基于CRISPR-Cas9 和HDR 輔助修復(fù)的基因組規(guī)模工程（CRISPR-Cas9 and homology directed repair assisted genome scale engineering，CHAnGE），能夠在基因組尺度上快速編輯釀酒酵母，并實(shí)現(xiàn)精確且可追蹤的編輯。CHAnGE 技術(shù)［圖3（a）］需要將gRNA 和HDR 供體組裝到一個gRNA 表達(dá)盒中，該盒分別結(jié)合24 765 個特異序列，覆蓋釀酒酵母中約97.8%的ORF（open reading frame，開放閱讀框）以進(jìn)行全基因組進(jìn)化，并將此表達(dá)盒用作唯一條形碼可通過高通量測序跟蹤每個突變體。利用該技術(shù)獲得了對糠醛和醋酸耐受性分別提高了42 倍和20 倍的突變株。通過對gRNA 的測序，鑒定出敲除SIZ1 可提高酵母的糠醛耐受性，同時敲除SIZ1 和LCB3 基因可進(jìn)一步提高糠醛的耐受性。

圖3 CHAnGE與MAGESTIC技術(shù)Fig.3 Schematic of CHAnGE and MAGESTIC in yeast

另外，Roy 等［68］在CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的基礎(chǔ)上開發(fā)了利用短的、可追蹤、可基因組整合的條形碼策略MAGESTIC（multiplexed accurate genome editing with short， trackable， integrated cellular barcodes）［圖3（b）］，實(shí)現(xiàn)了基因組規(guī)模多位點(diǎn)精確編輯。利用寡核苷酸芯片技術(shù)合成了gRNA-同源片段的引導(dǎo)-供體對，質(zhì)粒組裝后將一個短條形碼（31mer）作為標(biāo)記，此標(biāo)記具有基因組條形碼整合功能，可防止質(zhì)粒條形碼丟失以實(shí)現(xiàn)可靠的表型分析。此外，利用LexA-Fkh1p 融合蛋白將供體DNA 募集到斷裂位點(diǎn)，可以將基因組編輯效率提高5倍以上。

1.3.2 基于CRISPR系統(tǒng)的基因組規(guī)模單堿基修飾

胞嘧啶脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase，AID）通過脫氨作用將R-loop 中單鏈DNA 中的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），U-G（鳥嘌呤）錯配通過DNA 復(fù)制和修復(fù)途徑實(shí)現(xiàn)［69］。因此，AID 可對轉(zhuǎn)錄過程中形成的單鏈DNA 區(qū)域進(jìn)行可誘導(dǎo)突變。Nishida 等［44］將來自海鰻的胞嘧啶脫氨酶PmCDA1（petromyzon marinus cytidine deaminase 1）連接到d/nCas9 蛋白C 端構(gòu)建Target-AID 編輯系統(tǒng)［圖4（a）］，可實(shí)現(xiàn)對gRNA 非互補(bǔ)鏈中PAM 序列上游?16～?20 區(qū)域內(nèi)胞嘧啶的突變。利用Target-AID 編輯器對ADE1 和CAN1 基因進(jìn)行同時編輯，兩種基因的獨(dú)立突變頻率分別為54%和51%，雙表型突變的頻率達(dá)到31%［44，70］。

在 此 基 礎(chǔ) 上，2018 年，Després 等［71］通 過pDYSCKO 表達(dá)靶向目標(biāo)基因（例如YFG）和負(fù)篩選標(biāo)記（例如CAN1）的gRNA，利用半乳糖誘導(dǎo)Target-AID 載體上Cas9 不同變體的表達(dá)構(gòu)建了Target-AID 雙篩選系統(tǒng)［圖4（b）］。添加刀豆氨酸進(jìn)行篩選，單、雙倍體的基因突變率分別提高3 倍和4.2 倍，表明雙篩選策略可以富集成功編輯的 細(xì) 胞 群。2020 年，Després 等［72］構(gòu) 建 基 于Target-AID 誘變和多位點(diǎn)基因組編輯的方法，根據(jù)釀酒酵母的必需基因設(shè)計(jì)合成大量可預(yù)測的gRNA，并將其作為突變效應(yīng)的標(biāo)簽，對酵母必需基因進(jìn)行系統(tǒng)的修飾，完成了1500 多個基因中的大約17 000個位點(diǎn)的編輯，并確定了700多個位點(diǎn)的突變對底盤適應(yīng)性的重大影響。

此外，將大腸桿菌的高突變率DNA聚合酶PolⅠ融合到nCas9蛋白的N 端，也可實(shí)現(xiàn)在特定區(qū)域的堿基編輯。Halperin 等［73］在大腸桿菌中建立了一種通過CRISPR 系統(tǒng)突變靶基因的EvolvR 技術(shù)，由gRNA引導(dǎo)的nCas9在目標(biāo)基因座上形成缺口，再由融合的PolⅠ以低保真度合成新鏈并切割置換的鏈。2020年，Tou等［45］使用PolⅠ-5M在釀酒酵母中建立了yEvolvR（yeast EvolvR system）系統(tǒng)［圖4（c）］，將目標(biāo)位點(diǎn)的突變率提高了12 434 倍。yEvolvR 技術(shù)另一個優(yōu)勢是能夠有效提高內(nèi)源基因的多樣性，當(dāng)gRNA 雙重靶向URA3*和CAN1 的條件下，可還原URA3*中的無義突變并使CAN1失活。

2 自動化連續(xù)進(jìn)化技術(shù)的發(fā)展

傳統(tǒng)的適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化大都只針對自然進(jìn)化中每個步驟的頻繁干預(yù)，這往往限制了進(jìn)化過程的多樣性和擴(kuò)展性。因此，近年來研究人員利用自動化技術(shù)與連續(xù)進(jìn)化相結(jié)合，無需人工干預(yù)［74］，并保持宿主細(xì)胞的穩(wěn)定及樣本的多樣性［75］。本節(jié)將重點(diǎn)介紹釀酒酵母的自動化連續(xù)進(jìn)化技術(shù)和連續(xù)自動化培養(yǎng)工具（表2）。

2.1 連續(xù)自動化進(jìn)化策略

圖4 Target-AID堿基編輯器、Target-AID雙篩選［71］和yEvolvR技術(shù)Fig.4 Schematic for target-AID base editor,double screening selection[71]and yEvolvR technology

表2 用于釀酒酵母的自動化連續(xù)進(jìn)化工具Tab.2 Automated continuous evolution tools for S.cerevisiae

在DNA 的復(fù)制過程中，DNA 聚合酶的校對和錯配修復(fù)對保持生物基因組的穩(wěn)定起著關(guān)鍵作用。研究人員在酵母中發(fā)現(xiàn)與基因組復(fù)制正交的質(zhì)粒復(fù)制系統(tǒng)，通過改變正交質(zhì)粒的DNA聚合酶校對和錯配修復(fù)的效率能夠有效提高正交質(zhì)粒上DNA序列的突變效率，通過連續(xù)培養(yǎng)能夠快速獲得大量多樣性群體［77，80］。正交易錯復(fù)制系統(tǒng)（orthogonal errorprone replication system，OrthoRep）［圖5（a）］是由細(xì)胞質(zhì)中的線性DNA 質(zhì)粒pGKL1（p1）及相應(yīng)的DNA 聚合酶TP-DNAP1 組成，p1 質(zhì)粒的復(fù)制受到TP-DNAP1 嚴(yán)格控制且不依賴于宿主DNA 聚合酶［81］。通過對TP-DNAP1進(jìn)行突變，提高了TPDNAP1依賴p1質(zhì)粒復(fù)制過程中的突變率，并使正交質(zhì)粒上目標(biāo)靶點(diǎn)的單堿基突變率（substitutions per base，s.p.b.）提高到4×10?8［77］。Ravikumar 等［82］將Rd3突變體與核酸外切酶結(jié)構(gòu)域部分基序的突變體雜交構(gòu)建了突變體TP-DNAP1-4-2，其s.p.b.提高了1000 倍（約10?5）。在釀酒酵母中利用OrthoRep 系統(tǒng)對二氫葉酸還原酶進(jìn)行連續(xù)進(jìn)化，將其針對乙胺嘧啶的耐受性提高了4 萬倍。 2018 年，Arzumanyan 等［76］發(fā) 現(xiàn) 了pGKL2/TP-DNAP2 的 質(zhì)粒/DNA 聚 合 酶 與pGKL1 質(zhì) 粒/TP-DNAP1 正 交［圖5（a）］，研究人員將pGKL1 質(zhì)粒/TP-DNAP1與pGKL2質(zhì)粒/TP-DNAP2兩套正交的DNA 復(fù)制系統(tǒng)成功導(dǎo)入釀酒酵母中，利用正交DNA 復(fù)制系統(tǒng)中不同DNA 聚合酶的突變率實(shí)現(xiàn)同時針對多基因進(jìn)行不同突變頻率的進(jìn)化。利用OrthoRep 中兩個正交的DNA 復(fù)制系統(tǒng)，能夠在多種釀酒酵母（如BY4741、W303-1A、CEN.PK2-1C 和BY4743 等）進(jìn)行進(jìn)化［83］。由此可見，OrthoRep 可在不同的釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)生物分子和細(xì)胞功能的高通量進(jìn)化，為構(gòu)建高效生物細(xì)胞工廠提供了新方法。

圖5 OrthoRep、ICE和eVOLVER技術(shù)Fig.5 Schematic diagram of OrthoRep,ICE and eVOLVER technology

與DNA 聚合酶相比較，生物體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄酶沒有高效的校對活性，從而導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄過程低保真復(fù)制。Crook 等［78］基于逆轉(zhuǎn)錄過程引起的突變開發(fā)出體內(nèi)連續(xù)進(jìn)化技術(shù)ICE（in vivo continuous evolution）［圖5（b）］。Ty1 逆轉(zhuǎn)錄酶可將Ty1 識別區(qū)域的mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過Ty1 整合酶整合到Ty1識別位點(diǎn)以進(jìn)行下一輪突變，通過多輪迭代可產(chǎn)生大量突變的基因。使用中等強(qiáng)度的pTEF1 啟動子控制逆轉(zhuǎn)錄元件的轉(zhuǎn)錄、敲除rrm3基因并過表達(dá)tRNAiMet可以優(yōu)化連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)并將目標(biāo)靶點(diǎn)的突變率提高50 倍。利用ICE 技術(shù)在酵母中生成Spt15 文庫，兩次迭代后獲得了在3.5%1-丁醇中耐受性提高2 倍的突變株。ICE 技術(shù)可以擴(kuò)展到含有LTR（long terminal repeat）逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的真核生物中，并隨著細(xì)胞數(shù)量而擴(kuò)展，但該技術(shù)依賴于逆轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)座頻率在連續(xù)的進(jìn)化中定向位點(diǎn)的使用可能會對基因組的穩(wěn)定性造成影響；依賴特定的逆轉(zhuǎn)錄機(jī)制限制了該技術(shù)的應(yīng)用。

2.2 連續(xù)自動化培養(yǎng)平臺

連續(xù)培養(yǎng)是一種定量表征工程菌株［84］以及跟蹤適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化中遺傳變化的方法［85］，可實(shí)現(xiàn)在精確控制的培養(yǎng)參數(shù)下進(jìn)行連續(xù)進(jìn)化［1］。因此，為了加速模擬自然進(jìn)化的進(jìn)程，連續(xù)自動化培養(yǎng)技術(shù)的開發(fā)在適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化中顯得尤為重要。

2018年，Wong等［86］搭建可擴(kuò)展的高通量自動化細(xì)胞培養(yǎng)的集成平臺（eVOLVER）［圖5（c）］，此平臺利用Python 自主編程控制系統(tǒng)可將多個智能套管并聯(lián)，通過流體控制閥門、LED+二極管進(jìn)行光密度監(jiān)控，比例積分微分（proportional integral derivative，PID）控制加熱器用來調(diào)節(jié)溫度，調(diào)整磁力控制攪拌速率，實(shí)現(xiàn)了實(shí)時檢測光密度、溫度等各種培養(yǎng)參數(shù)及參數(shù)的自動控制。利用eVOLVER 系統(tǒng)將菌體濃度維持在恒定區(qū)域內(nèi)（設(shè)定光吸收的上下閾值），通過改變78 個酵母菌種群的OD 值上限和下限，可獲得酵母種群的進(jìn)化參數(shù)圖，包括種群增長率-平均基因組復(fù)制與光密度-增長率的關(guān)系。eVOLVER系統(tǒng)作為自動化連續(xù)進(jìn)化工具有極強(qiáng)的吸引力，但該系統(tǒng)復(fù)雜的組裝和應(yīng)用計(jì)算機(jī)語言設(shè)計(jì)培養(yǎng)程序?qū)Τ鯇W(xué)者是很大的挑戰(zhàn)［79］。

2020 年，Zhong 等［80］將OrthoRep 系 統(tǒng) 和eVOLVER 系統(tǒng)結(jié)合起來搭建了連續(xù)進(jìn)化（automated continuous evolution，ACE）平臺，該平臺將eVOLVER 系統(tǒng)的嚴(yán)格選擇性、實(shí)時反饋和控制，與OrthoRep 系統(tǒng)對目標(biāo)基因連續(xù)突變的特性相結(jié)合。通過ACE 平臺對二氫葉酸還原酶進(jìn)行連續(xù)進(jìn)化，在3 mmol/L 乙胺嘧啶中只經(jīng)過550 h的連續(xù)進(jìn)化就達(dá)到與Ravikumar 等［82］相同的試驗(yàn)結(jié)果。ACE 為釀酒酵母自動化連續(xù)進(jìn)化提供了前所未有的速度、深度和可擴(kuò)展性，由此可見體內(nèi)連續(xù)進(jìn)化與體外自動化連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)相結(jié)合，大大提高進(jìn)化的速度。連續(xù)自動化培養(yǎng)平臺的構(gòu)建改變了適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化的方式，通過翻譯、突變、選擇和復(fù)制的連續(xù)循環(huán)促進(jìn)了復(fù)雜途徑的進(jìn)化，同時在研究適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制等方面具有廣闊的前景［87］。

3 小結(jié)與展望

適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化加速了自然進(jìn)化的過程，釋放出微生物在生物技術(shù)應(yīng)用中的巨大潛能，并可有效改善目標(biāo)表型，極大推動合成生物學(xué)細(xì)胞工廠的構(gòu)建，在解決資源緊缺、生命健康、環(huán)境污染等重大難題方面提供強(qiáng)大的技術(shù)支撐［88］。釀酒酵母各種表型受到復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)和反向代謝工程分析手段，解析釀酒酵母魯棒性和適應(yīng)性的分子基礎(chǔ)，加深對復(fù)雜基因型-表型相互作用的理解并提高網(wǎng)絡(luò)模型準(zhǔn)確性，設(shè)計(jì)出符合人類需求的工程化釀酒酵母，已成為合成生物學(xué)重要的發(fā)展方向［89］。隨著適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化新策略和新工具的發(fā)展，適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化大大加速了改造代謝途徑及細(xì)胞耐受性的效率，在提高目標(biāo)產(chǎn)物合成水平、拓展底物利用范圍、提升底盤細(xì)胞的耐受性等方面得到廣泛應(yīng)用。由傳統(tǒng)單一堿基、單一基因的隨機(jī)進(jìn)化模式到多基因、多途徑的全基因組進(jìn)化策略，如合成型釀酒酵母基因組重排（SCRaMbLE）、寡核苷酸介導(dǎo)的多位點(diǎn)進(jìn)化工具（YOGE、eMAGE） 和基于CRISPR 系統(tǒng)的多位點(diǎn)編輯（CHAnGE、Targeted-AID 等）；利用正交復(fù)制系統(tǒng)和逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)構(gòu)建體內(nèi)連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)，減少人為干預(yù)并加快進(jìn)化速度。隨著合成生物學(xué)技術(shù)與其他學(xué)科進(jìn)行深度交叉融合，將基因組連續(xù)進(jìn)化技術(shù)與其自動化技術(shù)相結(jié)合（eVOLVER 和ACE），加速代謝工程改造過程，實(shí)現(xiàn)對釀酒酵母可預(yù)測、可調(diào)控的系統(tǒng)性工程改造，加深了對細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控及其生物過程的認(rèn)知。

隨著適應(yīng)性試驗(yàn)進(jìn)化技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞工廠的構(gòu)建與篩選往往受限于目標(biāo)表型的測定，研究人員還需不斷改進(jìn)和優(yōu)化現(xiàn)有的技術(shù)，如利用生物傳感器（轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、蛋白質(zhì)傳感器、核糖開關(guān)等）將難以檢測的表型轉(zhuǎn)化為可快速測定的表型［90-92］，將連續(xù)進(jìn)化技術(shù)與微流控技術(shù)、自動化技術(shù)相結(jié)合建立高通量的篩選平臺［92-96］，進(jìn)一步優(yōu)化自動連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)提高其實(shí)用性，不斷拓展適應(yīng)性試驗(yàn)進(jìn)化的應(yīng)用。除此之外，適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化獲得的性狀優(yōu)良菌株往往含有大量的突變位點(diǎn)，其中與目標(biāo)表型強(qiáng)關(guān)聯(lián)的突變點(diǎn)比較有限，開發(fā)更為高效精確的生物信息學(xué)算法，降低了遺傳機(jī)理解析的難度。

總之，適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化為細(xì)胞工廠的構(gòu)建提供了強(qiáng)大的工具，在未來的發(fā)展中將連續(xù)進(jìn)化技術(shù)與先進(jìn)的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)、自動化技術(shù)及高通量篩選技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來，將極大促進(jìn)復(fù)雜生命現(xiàn)象的解析，推動代謝工程、系統(tǒng)生物學(xué)、合成生物學(xué)快速發(fā)展。