張順吉 朱洪寬 李超 王剛

(曲靖市第一人民醫(yī)院麻醉科，云南 曲靖 655000)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，乳腺癌發(fā)病率位居女性癌癥首位[1]。乳腺癌的治療取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，雖然靶向治療、內(nèi)分泌治療和聯(lián)合治療已成為患者個(gè)性化治療的研究重點(diǎn)，但手術(shù)仍然是早期患者的最佳選擇[2-3]。麻醉是手術(shù)中的重要環(huán)節(jié)，近年來(lái)研究表明部分麻醉藥具有一定的抗腫瘤作用[4]。異丙酚(propofol，PROP)是一種快速，短效的靜脈麻醉劑，臨床廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)和維持麻醉，近年研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚還可影響腫瘤的生長(zhǎng)增殖及轉(zhuǎn)移[5]。在肝癌中，靜脈麻醉劑PROP通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制肝癌的生長(zhǎng)和侵襲[6]。PROP還可通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)[7]。鎮(zhèn)靜劑右美托咪定可通過(guò)上調(diào)miR-520a-3p抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)凋亡[8]。在乳腺癌中，miR-520a-3p表達(dá)下調(diào)，其高表達(dá)抑制癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲[9]。因此假設(shè)麻醉劑PROP通過(guò)上調(diào) miR-520a-3p抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。本課題以乳腺癌細(xì)胞系MCF-7為研究對(duì)象，研究不同濃度PROP對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響，并探討miR-520a-3p在此機(jī)制中的作用，對(duì)假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為乳腺癌提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和BT-549(購(gòu)自ATCC)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶Trypsin和DMEM高糖(dulbecco's modified eagle medium)培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)；異丙酚(純度99.1%，購(gòu)自上海陶素生化科技有限公司)；二甲基亞礬(Dimethyl sulfoxide，DMSO)和四氮唑藍(lán)(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide，MTT)(購(gòu)自Sigma-Aldrich公司)；Transwell板(購(gòu)自美國(guó)Corning公司)；引物、miR-520a-3p模擬物(miR-520a-3p)、miR-520a-3p抑制劑(anti-miR-520a-3p)、對(duì)照(miR-con和anti-miR-con)(購(gòu)自蘇州吉瑪基因股份有限公司)；Cyclin D1抗體、MMP-2抗體、MMP-9抗體、β-catenin抗體和β-actin抗體(購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司)；Lipofectamine 2000、RNA提取試劑Trizol、 Real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)；顯微鏡、酶標(biāo)儀及Real-time PCR儀(購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司)；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 ①細(xì)胞培養(yǎng)：將乳腺癌MCF-7和BT-549細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS、1%青-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)條件：37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，飽和濕度。將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化傳代。②藥物處理：實(shí)驗(yàn)(PROP)組：將MCF-7和BT-549細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)，然后加入不同濃度(2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L和20.0 μmol/L)的PROP處理48 h；對(duì)照(NC)組：以不加PROP的為對(duì)照組；PROP+轉(zhuǎn)染組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-520a-3p或anti-miR-520a-3p后，過(guò)夜培養(yǎng)然后加入實(shí)驗(yàn)濃度的PROP處理48 h。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7和BT-549細(xì)胞稀釋后以2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞至融合度達(dá)到80%左右時(shí)按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。用無(wú)血清OptiMEM培養(yǎng)液稀釋脂質(zhì)體、miR-con、miR-520a-3p、anti-miR-con和anti-miR-520a-3p，將稀釋好的等體積脂質(zhì)體和載體混合，室溫孵育20 min，加入到培養(yǎng)好的MCF-7細(xì)胞中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，換DMEM高糖完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 Real-time PCR檢測(cè)RNA的表達(dá) 收集MCF-7和BT-549細(xì)胞，Trizol試劑提取MCF-7細(xì)胞總RNA，保存于-80 ℃。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，反應(yīng)程序?yàn)?6 ℃45 min、42 ℃30 min、72 ℃5 min；4 ℃放置10 min，合成的cDNA測(cè)定濃度后置于-80 ℃保存。取cDNA進(jìn)行real-time PCR，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃5 min；94 ℃30 s、59 ℃30 s、72 ℃45 s，45個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞存活率 將MCF-7和BT-549細(xì)胞用胰蛋白酶消化，稀釋細(xì)胞濃度至1×104個(gè)/mL，200 μL/孔接種于96微孔板中，過(guò)夜之后，加入實(shí)驗(yàn)濃度的PROP，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行 MTT 實(shí)驗(yàn)，每孔加入 20 μLMTT(5 mg/mL)，培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)上清，加入150 μL DMSO，室溫混勻5 min，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 吸光度(A)值，細(xì)胞存活率(%)=(對(duì)照組A均值-實(shí)驗(yàn)組A均值)/對(duì)照組A均值×100%。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 ①遷移實(shí)驗(yàn)：將MCF-7和BT-549細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至2×105個(gè)/mL。在Transwell下層培養(yǎng)孔加入500 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，下層同時(shí)加入終濃度為5.0 μmol/L和10.0 μmol/L的PROP，Transwell上層小室加入100 μL MCF-7和BT-549細(xì)胞，將上層小室放入下層培養(yǎng)孔中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用棉簽拭去未遷移的細(xì)胞，甲醛固定遷移細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，拍照，顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。②侵襲實(shí)驗(yàn)：將液化的Matrigel用4 ℃無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶6比例稀釋，然后加入上層Transwell小室，37 ℃使其固化，以下同遷移實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度PROP對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT-549增殖的影響 結(jié)果表明，與NC組相比，2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L和20.0 μmol/L的PROP均可抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT-549存活(P<0.05)，且呈現(xiàn)顯著的劑量依賴趨勢(shì)，PROP劑量越大，對(duì)細(xì)胞存活率抑制效果越顯著，見圖1。

2.2 不同濃度PROP抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT-549遷移和侵襲 根據(jù)結(jié)果2.1和經(jīng)濟(jì)角度，選擇5.0 μmol/L和10.0 μmol/L濃度的PROP對(duì)MCF-7和BT-549的遷移和侵襲進(jìn)行研究。與NC組相比，5.0 μmol/L和10.0 μmol/L PROP組MCF-7和BT-549遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)，MMP-2和MMP-9表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)，且劑量越大效果越顯著(圖2、表1)。說(shuō)明PROP可抑制MCF-7和BT-549細(xì)胞遷移和侵襲。

圖1 不同濃度PROP對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7、BT-549增殖的影響

圖2 不同濃度PROP抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7遷移和侵襲

表1 不同濃度PROP抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7遷移和侵襲

2.3 不同濃度PROP可促進(jìn)miR-520a-3p表達(dá) 與NC組相比，5.0 μmol/L和10.0μmol/L PROP組MCF-7和BT-549細(xì)胞中miR-520a-3p表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，且 PROP濃度越高，miR-520a-3p表達(dá)量升高越顯著(圖3)。說(shuō)明PROP可促進(jìn)MCF-7和BT-549細(xì)胞中miR-520a-3p的表達(dá)。

2.4 高表達(dá)miR-520a-3p可抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖、遷移和侵襲 結(jié)果顯示，與miR-con組相比，miR-520a-3p組MCF-7和BT-549細(xì)胞中miR-520a-3p表達(dá)顯著升高(P<0.05)，Cyclin D1、MMP-2和MMP-9表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞存活率、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)也顯著降低(P<0.05)，見圖4。

圖3 不同濃度PROP對(duì)miR-520a-3p表達(dá)的影響

圖4 高表達(dá)miR-520a-3p可抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT-549增殖、遷移和侵襲

2.5 低表達(dá)miR-520a-3p可以部分逆轉(zhuǎn)PROP對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT-549增殖、遷移和侵襲的影響(PROP：10 μmol/L) 根據(jù)結(jié)果2.1～2.3，選擇對(duì)MCF-7和BT-549細(xì)胞抑制率約50%的10 μmol/L PROP進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，10 μmol/L PROP組促進(jìn)miR-520a-3p表達(dá)(P<0.05)，抑制MCF-7和BT-549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲(P<0.05)；而與PROP+anti-miR-con組相比，PROP+anti-miR-520a-3p組則結(jié)果相反，MCF-7和BT-549細(xì)胞中miR-520a-3p表達(dá)降低，Cyclin D1、MMP-2和MMP-9表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞存活率、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)也顯著上升(P<0.05)(圖5)。說(shuō)明抑制miR-520a-3p表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)PROP對(duì)乳腺癌MCF-7和BT-549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

2.6 低表達(dá)miR-520a-3p逆轉(zhuǎn)PROP對(duì)MCF-7和BT-549細(xì)胞中Wnt/β-catenin細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(PROP：10 μmol/L) Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，10 μmol/L PROP組抑制MCF-7和BT-549細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)(P<0.05)；而與PROP+anti-miR-con組相比，PROP+anti-miR-520a-3p組則結(jié)果相反，MCF-7和BT-549細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖6)。說(shuō)明10 μmol/L PROP可抑制MCF-7和BT-549細(xì)胞的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，而抑制miR-520a-3p表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)PROP對(duì)MCF-7和BT-549細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制作用。

圖5 低表達(dá)miR-520a-3p可以部分逆轉(zhuǎn)PROP對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT-549增殖、遷移和侵襲的影響

圖6 Western Blot檢測(cè)β-catenin蛋白表達(dá)

3 討論

PROP是一種應(yīng)用廣泛的全身麻醉藥物。研究表明，PROP對(duì)腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，影響患者預(yù)后，但根本機(jī)制尚不清楚[10]。PROP可抑制肺癌細(xì)胞活性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是肺癌手術(shù)理想的麻醉劑[11]。PROP能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。Li R等[13-14]發(fā)現(xiàn)，與揮發(fā)性麻醉劑相比，PROP對(duì)乳腺癌手術(shù)是有益的，其可能通過(guò)破壞癌細(xì)胞功能，保護(hù)機(jī)體免疫功能，減少手術(shù)壓力，改善患者預(yù)后及術(shù)后恢復(fù)。本研究結(jié)果表明，PROP可抑制乳腺癌MCF-7和BT-549細(xì)胞中Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，具有劑量依賴趨勢(shì)。Cyclin D1是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，Cyclin D1下調(diào)表達(dá)可阻滯細(xì)胞周期，影響細(xì)胞增殖[15]。有報(bào)道表明，PROP可以通過(guò)下調(diào)miR-21的表達(dá)抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和EMT，下調(diào)miR-24信號(hào)通路誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞凋亡[16-17]。本研究與上述結(jié)論基本一致，證實(shí)了PROP對(duì)乳腺癌有抑制作用，但具體機(jī)制尚不清楚。

研究表明，鎮(zhèn)靜劑右美托咪定可通過(guò)調(diào)控miR-520a-3p抑制骨肉瘤[8]。而miR-520a-3p在乳腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，其過(guò)表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[9]。根據(jù)前述研究結(jié)果[6-9]，本研究假設(shè)PROP可能通過(guò)上調(diào)miR-520a-3p抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而抑制乳腺癌。結(jié)果表明，PROP促進(jìn)MCF-7和BT-549細(xì)胞中miR-502a-3p的表達(dá)，而上調(diào)miR-520a-3p可下調(diào)Cyclin D1、MMP-2和MMP-9，抑制MCF-7和BT-549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，與上述研究結(jié)果一致[9]；而下調(diào)miR-520a-3p則逆轉(zhuǎn)PROP對(duì)乳腺癌MCF-7和BT-549細(xì)胞的抑制作用，說(shuō)明PROP通過(guò)上調(diào)miR-520a-3p發(fā)揮抑制乳腺癌細(xì)胞的作用。

正常成熟細(xì)胞中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路通常處于關(guān)閉狀態(tài)，其異常激活通常導(dǎo)致癌癥等疾病的發(fā)生[18]。乳腺癌中，Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵因子β-catenin通常表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明乳腺癌中Wnt /β-catenin信號(hào)通路被激活[19]。大量研究表明，在乳腺癌中異常表達(dá)的部分miRNA可通過(guò)調(diào)控Wnt /β-catenin信號(hào)通路參與癌癥的發(fā)生和進(jìn)展[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PROP可抑制MCF-7細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)，而抑制miR-520a-3p則逆轉(zhuǎn)了PROP對(duì)β-catenin的抑制作用，說(shuō)明PROP可能通過(guò)miR-520a-3p調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

4 結(jié)論與啟示

本研究發(fā)現(xiàn)，PROP可通過(guò)上調(diào)miR-520a-3p抑制Wnt /β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而抑制乳腺癌MCF-7和BT-549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。PROP可抑制乳腺癌，可能是乳腺癌手術(shù)的理想麻醉劑。本研究只進(jìn)行了乳腺癌MCF-7和BT-549細(xì)胞的體外試驗(yàn)，尚需進(jìn)行大樣本多中心的臨床研究佐證。下一步將對(duì)臨床乳腺癌手術(shù)樣本進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證PROP對(duì)乳腺癌的抑制作用和抑制機(jī)制。