李童,錢斌,周建弟,徐巖,王棟*

1(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)2(教育部工業(yè)生物技術重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)3(古越龍山紹興酒股份有限公司技術中心,浙江 紹興,312000)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC),是一種具有遺傳毒性及較強致癌性的物質(zhì)[1],天然存在于多種發(fā)酵食品(如醬油、食醋、泡菜)和酒精飲料(如黃酒、白酒、葡萄酒、日本清酒、白蘭地)中[2-4]。2007年國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer,IARC)將EC歸類為2A類致癌物[5],引起人們對長期飲用酒精飲料安全性的擔憂。

研究發(fā)現(xiàn),黃酒中的尿素是EC的主要前體物質(zhì),90%左右的EC是由尿素和乙醇經(jīng)化學反應生成的[6],因此控制黃酒中的尿素含量對于控制EC的生成具有重要意義。關于黃酒中尿素的控制,目前已有許多方法報道,其中利用脲酶是較為直接、簡便的方法。由于黃酒的酸性環(huán)境(pH 4.0左右),大部分研究者將酸性脲酶應用于黃酒中尿素的減除。早期主要是將游離酸性脲酶直接加入黃酒中進行尿素的降解[7-9]；為提高脲酶的重復使用性,近些年來不少研究者將酸性脲酶固定化后處理酒樣[10-13]。

雖然酸性脲酶對黃酒中尿素的降解有一定的效果,但酸性脲酶目前只有在日本和美國的少數(shù)企業(yè)實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),其進口和使用在國內(nèi)有一定的限制[14]。而國內(nèi)對酸性脲酶的研究還停留在實驗階段,尚無商業(yè)化酸性脲酶供應,這大大限制了酸性脲酶處理黃酒的工業(yè)化應用。我國目前市售的脲酶基本上是植物來源的中性脲酶,其價格便宜、來源廣泛，但該酶在中性條件下活性高,而在酸性條件下酶活力很低,一般認為這種中性脲酶不適合用于黃酒中尿素的降解[15]。近幾年國內(nèi)外對脲酶的固定化研究表明,固定化可以提高脲酶的穩(wěn)定性和利用效率[16-18],但關于中性脲酶的研究很少。有研究利用固定化中性脲酶處理黃酒,需將黃酒pH調(diào)至4.8以降低其中的尿素含量[19]。但中性脲酶固定化后是否可以在不改變黃酒特性的條件下用于黃酒中尿素的降解,目前鮮有相關研究報道。

本研究以市售中性脲酶為實驗對象,以酸性脲酶作為對照,對游離酶部分酶學性質(zhì)進行測定分析,探究中性脲酶應用于黃酒中尿素處理的可行性；并將中性脲酶通過共價結合法進行固定化,考察其應用于黃酒中尿素降解的效果,為中國黃酒EC的控制提供一種可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

中性脲酶(來源于Canavaliaensiformis),Sigma公司；酸性脲酶(來源于Lactobacillusfermentum),武田藥品工業(yè)株式會社；黃酒,市售。

1.1.2 實驗試劑

尿素、乳酸、乙醇、乙酸鈉、殼聚糖、海藻酸鈉、高碘酸鈉、三氯乙酸,國藥集團化學試劑公司；甲醇、乙腈,均為色譜級,北京百靈威科技有限公司。

1.1.3 儀器與設備

DK-S34型水浴鍋,上海森信實驗儀器有限公司；Five Easy Plus型pH計,梅特勒-托利多儀器有限公司；SB25-12DT型超聲波清洗儀,寧波新芝生物科技股份有限公司；HYL-C型搖床,太倉市強樂實驗設備有限公司；Agilent 1260 Infinity型高效液相色譜儀,美國安捷倫科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 游離酶性質(zhì)測定

1.2.1.1 pH對脲酶活力和穩(wěn)定性的影響

最適pH：稱取一定量的中性脲酶和酸性脲酶,分別溶于不同pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)的緩沖液中,其中pH為3.0、4.0、5.0、6.0的緩沖液用0.1 mol/L的檸檬酸和檸檬酸三鈉配制,pH為7.0、8.0的緩沖液用0.1 mol/L的K2HPO4和KH2PO4配制。測定不同pH下的酶活力,以最高酶活力為100%,計算相對酶活力。

pH穩(wěn)定性：分別將中性脲酶和酸性脲酶置于pH為3.5、4.0、5.0、6.0、7.0的緩沖液中,室溫放置24 h后測定酶活力,以初始酶活力為100%,計算殘余酶活力。

1.2.1.2 溫度對脲酶活力和穩(wěn)定性的影響

最適溫度：稱取一定量的中性脲酶和酸性脲酶,分別溶于pH為4.0和7.0的緩沖液中,在不同溫度(4、14、30、37、50、60、80 ℃)下測定酶活力,以最高酶活力為100%,計算相對酶活力。

溫度穩(wěn)定性：將中性脲酶和酸性脲酶分別溶于pH為7.0和4.0的緩沖液中,置于溫度為4、30、50、80 ℃的環(huán)境中保溫24 h后測定酶活力,以初始酶活力為100%,計算殘余酶活力。

1.2.1.3 酒精對脲酶活力和穩(wěn)定性的影響

酒精對酶活力的影響：稱取一定量中性脲酶溶于酒精體積分數(shù)為0%、8%、12%、16%、20%、24%的pH為7.0的緩沖液中；稱取一定量酸性脲酶溶于酒精體積分數(shù)為0%、8%、12%、16%、20%、24%的pH為4.0的緩沖液中,測定不同酒精體積分數(shù)下的酶活力,以最高酶活力為100%,計算相對酶活力。

酒精耐受性：分別將中性脲酶和酸性脲酶溶于酒精體積分數(shù)為0%、8%、14%、20%、30%的緩沖液中,室溫放置24 h后測定酶活力,以初始酶活力為100%,計算殘余酶活力。

1.2.2 固定化酶的制備

制備方法參考文獻[20]。其中殼聚糖質(zhì)量濃度為30 g/L,交聯(lián)劑為自制且無毒性的氧化海藻酸鈉,交聯(lián)劑質(zhì)量濃度為1 g/L,交聯(lián)時間4 h,加酶量0.2 mg/mL,固定化時間6 h。

1.2.3 游離、固定化中性脲酶酶學性質(zhì)測定比較

固定化中性脲酶的最適pH、最適溫度以及酒精對其活力的影響,測定方法同游離酶。對穩(wěn)定性進行測定時,為了考察酶在不同時間的酶活力變化情況,在0～24 h之間取樣測定。

1.2.4 固定化中性脲酶處理黃酒

1.2.4.1 固定化中性脲酶單批次處理黃酒

在pH為7.0,37 ℃的條件下測定酶活力,稱取一定量的酶活力為20 U的游離脲酶和固定化脲酶裝入50 mL三角瓶,加入20 mL酒樣,在30 ℃下200 r/min振蕩處理,于2、4、8、12、24 h取濾液測定尿素含量,計算尿素去除率?？瞻讓φ諡椴患用傅墓潭ɑd體微球。并對處理后的黃酒進行基本理化指標的測定。

1.2.4.2 固定化中性脲酶的重復利用

為了考察固定化脲酶的重復使用性,按上述條件處理黃酒4 h,處理3個批次,分析不同批次的尿素降解效果及黃酒中基本理化指標的變化情況。

1.2.5 測定分析方法

脲酶酶活力通過靛酚藍反應比色法[21]測定。1個酶活力單位即為1 min水解底物尿素產(chǎn)生1 μmol 氨所需的酶量。黃酒中的尿素含量通過高效液相色譜法[22]測定,樣品處理方法和色譜條件參照文獻[23]。黃酒總酸、氨基酸態(tài)氮的測定方法參照GB/T 13662—2018《黃酒》[24]。還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸比色法進行測定[25]。乙醇含量采用高效液相色譜法進行測定[26]。

2 結果與分析

2.1 游離中性脲酶和酸性脲酶酶學性質(zhì)比較

為了研究中性脲酶應用于黃酒中尿素處理的可行性,首先對游離中性脲酶的酶學性質(zhì)進行測定分析,并與酸性脲酶進行比較。

2.1.1 最適pH及其穩(wěn)定性

脲酶在不同pH 緩沖液中的相對活力測定結果如圖1柱狀圖所示。中性脲酶最適pH為7.0,在pH 3.0時失活,pH 4.0時表現(xiàn)出微弱活性。酸性脲酶最適pH為4.0,且在酸性條件下均保留較高酶活力。pH穩(wěn)定性測定結果如圖1折線圖所示。中性脲酶在酸性條件下的穩(wěn)定性較差,pH<5.0時放置24 h后僅有微弱的酶活力保留；而酸性脲酶在酸性條件下的穩(wěn)定性較好。由于黃酒的pH一般為3.5～4.8[26],因此,脲酶的酸性酶活力及酸穩(wěn)定性是影響其在黃酒中應用的主要因素之一,這也是中性脲酶難以在黃酒中應用的主要原因。

圖1 游離脲酶最適pH及其穩(wěn)定性Fig.1 Optimal pH and the stability pH in free neutral and acid ureases

2.1.2 最適溫度及其穩(wěn)定性

脲酶在不同溫度下的相對酶活力測定結果如圖2柱狀圖所示。中性脲酶和酸性脲酶的最適作用溫度均為37 ℃左右,中性脲酶在中低溫表現(xiàn)出相對較高的酶活力。溫度穩(wěn)定性測定結果如圖2折線圖所示。中性和酸性脲酶對溫度的穩(wěn)定性類似,均在低溫下穩(wěn)定性好,隨著溫度的升高,穩(wěn)定性逐漸降低。

圖2 游離脲酶最適溫度及其穩(wěn)定性Fig.2 Optimal temperature and temperature stability of free neutral and acid ureases

2.1.3 酒精對脲酶活力的影響及其耐受性

黃酒屬于酒精性飲料,酒精體積分數(shù)在8%～14%左右,發(fā)酵過程中甚至更高。本文測定了不同體積分數(shù)酒精對脲酶活性的影響,測定結果如圖3柱狀圖所示。中性脲酶在8%～24%酒精體積分數(shù)下均有相對較高的酶活,其中在酒精體積分數(shù)為16%時,酶活力可達最高酶活性的85%左右,酸性脲酶在不同酒精體積分數(shù)下的酶活力變化規(guī)律基本和中性脲酶相同,但酶活力受高酒精濃度的影響更為明顯。酒精耐受性測定結果如圖3折線圖所示。中性和酸性脲酶對酒精的耐受性均較強,在酒精溶液中放置24 h后均能保留60%以上的初始酶活力。

圖3 酒精對游離脲酶活力的影響及其耐受性Fig.3 Effect of alcohol on free neutral and acid ureases activity and their tolerance

綜上所述,對應用于黃酒中的兩大限制條件,即酸性條件和一定含量的酒精,中性脲酶表現(xiàn)出較好的酒精耐受性,但對于酸性條件較為敏感,限制了中性脲酶在黃酒中的應用。改變中性脲酶的應用pH活性及穩(wěn)定性才有應用于黃酒中的可能。

2.2 固定化中性脲酶酶學性質(zhì)分析

為改善中性脲酶在黃酒中的應用效果,采用較為安全的殼聚糖載體和氧化海藻酸鈉交聯(lián)劑,對其進行固定化,并對固定化中性脲酶的酶學性質(zhì)進行測定分析,通過與游離中性脲酶進行比較,考察其在黃酒中的適用性。

2.2.1 最適pH及其穩(wěn)定性

中性脲酶在不同pH 緩沖液中的相對活力測定結果如圖4-a所示。經(jīng)固定化后,中性脲酶的最適pH由7.0變?yōu)?.0,出現(xiàn)明顯的酸性偏移,在pH 4左右也表現(xiàn)出較高的酶活力,有利于對黃酒的處理。中性脲酶在不同pH下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)如圖4-b所示。相對于游離酶在pH為3.5時迅速失活,pH 4.0時放置2 h后基本失活,固定化酶表現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性。在pH 3.5時放置1.5 h后才基本喪失活性,在pH 4.0時失活時間也提高到8 h,耐酸性有顯著提高。在其他pH條件下固定化酶穩(wěn)定性均有顯著提高。

a-最適pH；b-pH穩(wěn)定性圖4 游離和固定化中性脲酶最適pH及其穩(wěn)定性比較Fig.4 Comparison of optimum pH and stability of free and immobilized neutral ureases

2.2.2 最適溫度及其穩(wěn)定性

中性脲酶在不同溫度下的相對活力測定結果如圖5-a所示。經(jīng)固定化后,脲酶的最適溫度由37 ℃提高到50 ℃。脲酶在不同溫度下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)如圖5-b所示。固定化酶與游離酶的溫度穩(wěn)定性基本類似,在不同溫度下,固定化酶穩(wěn)定性略強于游離酶。在高溫條件下(80 ℃),游離酶和固定化酶均在4 h后基本失活。

a-最適溫度；b-溫度穩(wěn)定性圖5 游離和固定化中性脲酶最適溫度及其穩(wěn)定性比較Fig.5 Comparison of optimum temperature and stability of free and immobilized neutral ureases

2.2.3 酒精對脲酶活力的影響及其耐受性

中性脲酶對酒精的耐受性測定結果如圖6-a所示。游離中性脲酶本身有較好的酒精耐受性,固定化后基本保持了較好的酒精耐受性,其中在酒精體積分數(shù)為16%的條件下活性是最高酶活力的80%左右,與游離酶相差不大。脲酶在不同酒精體積分數(shù)下的穩(wěn)定性結果如圖6-b所示。游離酶在較寬的酒精體積分數(shù)范圍(0%～30%)內(nèi)的穩(wěn)定性變化基本相同,放置24 h后均可保留69%以上酶活力。固定化酶在酒精體積分數(shù)為8%、14%、20%的穩(wěn)定性高,24 h后均能保留80%左右的初始酶活力。在30%的酒精體積分數(shù)下穩(wěn)定性要差一些,但24 h后依然能保留60%左右的初始酶活力。相對而言,固定化酶對酒精的穩(wěn)定性又有一定的改善。

a-酒精對酶活力的影響；b-酒精耐受力圖6 不同體積分數(shù)酒精對游離和固定化中性脲酶活力及其耐受性的影響Fig.6 Effect of alcohol on the activity and tolerance of free and immobilized neutral ureases

2.3 固定化中性脲酶處理黃酒

將固定化中性脲酶處理尿素含量較高(24.86 mg/L)的黃酒,其尿素的降解結果如圖7所示。固定化酶處理黃酒4 h,尿素降解較快,降解率超過60%；處理24 h后,黃酒中尿素含量低于1 mg/L,降低了98.15%。而在相同加酶量的條件下,游離酶對黃酒中尿素基本沒有降解作用。固定化載體(空白微球)在該處理條件下對黃酒中尿素含量的影響也很小(<10%),因此,固定化中性脲酶降解黃酒中尿素的作用效果比較顯著。

圖7 固定化中性脲酶處理黃酒Fig.7 Treatment of Huangjiu with immobilized neutral urease注：酒樣pH 3.90,尿素初始質(zhì)量濃度24.86 mg/L

同時,對上述處理過的黃酒主要理化指標進行測定,測定結果如表1所示。固定化中性脲酶處理對黃酒中還原糖、氨基酸態(tài)氮和酒精含量的影響不大(變化率在10%左右),這些指標略有下降主要是因為固定化酶顆粒有較高含水量(93.08%),對酒樣有一定的稀釋作用?？偹嵯陆德噬愿?除稀釋作用外,微球本身偏中性的pH環(huán)境也對總酸含量變化有一定影響。但總體來說,經(jīng)固定化酶處理后黃酒的各項基本理化指標均符合黃酒國標要求。

表1 固定化中性脲酶處理對黃酒主要理化指標的影響Table 1 Effect of treatment with immobilized neutral urease on the primary parameters of Huangjiu

進一步將固定化酶重復利用多批次處理黃酒,每批處理時間為4 h,考察其對黃酒中尿素降解的效果。處理后酒樣中尿素及主要理化指標的變化情況如表1所示。重復利用固定化中性脲酶,第1次處理黃酒,尿素降解率可達60%左右；第2次處理,尿素降解率降低至不足40%；第3次使用該固定化酶,基本無尿素降解,這主要是由于固定化中性脲酶長時間處于黃酒的酸性環(huán)境中,對酶活力有嚴重影響,降低了其催化效率。黃酒主要理化指標,除第1次處理由于固定化酶中殘留的緩沖體系對酒樣有一定的影響外,后續(xù)2批酒樣主要理化指標沒有明顯變化(基本在5%以內(nèi))。這些結果表明,固定化中性脲酶可用于黃酒中尿素的降解,但酶的使用效率受到了其穩(wěn)定性的影響。

通過進一步提高固定化酶的pH穩(wěn)定性,并結合填充柱連續(xù)處理黃酒,縮短處理時間,有可能在降低黃酒中尿素的工業(yè)應用中得到較好的效果,相關研究還需進一步開展。

3 結論

本研究主要考察了來源于植物的市售中性脲酶及其固定化酶應用于黃酒中降解尿素的可行性。研究結果表明,與酸性脲酶相比,游離中性脲酶的一些性質(zhì),如溫度和耐酒精特性都較為相似,但耐酸特性相對較差,限制了其在黃酒中的應用。將中性脲酶以殼聚糖為載體進行固定化后,脲酶的耐酸特性有了顯著改善,有應用于黃酒中的可能性。將此固定化中性脲酶處理黃酒,處理24 h后基本可降解95%以上的尿素。該固定化中性脲酶不僅安全有效,且處理黃酒易于和酒液分離,便于應用。重復利用固定化酶也有一定的效果,但酶的穩(wěn)定性仍需進一步提高。本研究結果為酶法降解黃酒中的尿素提供了一種現(xiàn)實可行的方法。