耿 聰，李 巖,姚鑫潔

0 引言

幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染與慢性胃炎、胃潰瘍、胃癌、胃Malt淋巴瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-4]，故Hp的根除有重要的臨床意義。近年來(lái)，Hp的根除率逐年下降，這主要與其對(duì)相關(guān)抗生素的耐藥有關(guān)[4-6]，耐藥率最高的3種抗生素為克拉霉素(Clarithromycin,CLR)、左氧氟沙星(Levofloxacin,LEV)、甲硝唑(Metronidazole,MTZ)[7-8]。近年來(lái)，中西藥聯(lián)合應(yīng)用使Hp根除率有所提高[6]。一些研究已證實(shí)，三黃瀉心湯組方及其組成大黃、黃連、黃芩及三味中藥的有效成分：黃連(小檗堿/黃連素、黃連堿、巴馬汀)、大黃(大黃酸、大黃素)、黃芩(黃芩苷、黃芩素)有體外抑殺Hp的作用[9-13]，但有關(guān)三味中藥之間及三味中藥與抗生素聯(lián)合應(yīng)用的抑菌效果是否存在抗菌增敏的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本項(xiàng)研究對(duì)組成三黃瀉心湯的大黃、黃連、黃芩進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，探討三味中藥之間的聯(lián)合抑菌效果及三味中藥與CLR、LEV、MTZ的聯(lián)合抑菌效果，為臨床應(yīng)用三黃瀉心湯及三味中藥在根除Hp治療中的方案制定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 Hp菌株ATCC43504(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心贈(zèng)予)。ATCC43504菌株為美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)細(xì)菌藥敏實(shí)驗(yàn)執(zhí)行指南推薦的質(zhì)控菌株。菌株為CLR、LEV的敏感菌株，為MTZ的耐藥菌株。

1.1.2 主要藥物及試劑 中藥生藥黃連、大黃、黃芩(沈陽(yáng)市中醫(yī)院)，克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品(美侖，批號(hào)：MB1058-S、MB1076-S、MB2200-S)，Karmali固體培養(yǎng)基試劑(OXOID，貨號(hào):CM0935)，幽門(mén)螺桿菌選擇性添加劑(OXOID，貨號(hào):SR0147E)，PBS緩沖液(美侖，批號(hào)：MA0015)，DMSO(索萊寶，批號(hào)：D8370-100)，冰醋酸(大茂化學(xué)試劑廠)。

1.1.3 主要設(shè)備 真空冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司，型號(hào)：SCIENTZ-12N)，超凈工作臺(tái)(青島海爾公司，型號(hào)：HR40-IIA2)，恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏設(shè)備公司，型號(hào):DNP-9162)，電熱恒溫水浴鍋(上海森信儀器公司，型號(hào):DK-S24)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥液的制備 中藥：大黃、黃連、黃芩分別置于砂鍋中，8倍量(按質(zhì)量算)冷水浸泡1 h，武火煮沸后文火煎30 min，濾出藥液留存，所剩藥渣再加適量冷水重復(fù)以上煎煮及濾出過(guò)程，合并兩次濾液。所有濾液經(jīng)真空冷凍干燥機(jī)處理后形成粉劑，用雙蒸水按生藥質(zhì)量計(jì)算配成濃度為1 g/ml的藥液，作為實(shí)驗(yàn)藥液的母液，密封冷藏保存。

抗生素：根據(jù)CLSI細(xì)菌藥敏實(shí)驗(yàn)執(zhí)行指南，分別應(yīng)用DMSO溶解MTZ、冰醋酸溶解CLR及LEV，并分別用PBS緩沖液對(duì)CLR、雙蒸水對(duì)MTZ及LEV加以稀釋?zhuān)瑓⒄誄LSI指南規(guī)定的Hp菌株ATCC43504對(duì)抗生素的質(zhì)控范圍(表1)，將MTZ、LEV、CLR標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為MTZ 5 120 mg/L、LEV 5 mg/L、CLR 5 mg/L的溶液(藥液濃度至少為質(zhì)控范圍高值的10倍)，以此作為實(shí)驗(yàn)藥液的母液，密封冷藏保存。

采用二倍稀釋法將實(shí)驗(yàn)藥液母液稀釋成如下的濃度：參照文獻(xiàn)[9]將大黃、黃連、黃芩用雙蒸水分別稀釋成1∶10(100 mg/ml)、1∶20(50 mg/ml)、1∶40(25 mg/ml)、1∶80(12.5 mg/ml)、1∶160(6.25 mg/ml)、1∶320(3.12 mg/ml)、1∶640(1.56 mg/ml)7種不同濃度的藥液；參照ATCC43504對(duì)抗生素的質(zhì)控范圍，將抗生素制成如下濃度藥液：CLR：2.5、1.25、0.625、0.31、0.16、0.08 mg/L；LEV：5、2.5、1.25、0.625、0.31、0.16、0.08 mg/L；MTZ：5 120、2 560、1 280、640、320 mg/L。將以上6種藥物的共計(jì)39種濃度的藥液密封冷藏保存，備用于后續(xù)單藥藥敏實(shí)驗(yàn)及聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)中含藥培養(yǎng)基的制備。

1.2.2 Hp培養(yǎng)基的制備 普通培養(yǎng)基：Karmali固體培養(yǎng)基試劑21.5 g+雙蒸水475 ml，121 ℃高壓滅菌15 min，待溫度降至50 ℃左右，加入脫纖維羊血25 ml、Hp選擇性添加劑1瓶，混合均勻后吸取20 ml加入無(wú)菌平皿，待瓊脂冷卻，將培養(yǎng)皿倒置，冷藏保存。

含藥培養(yǎng)基：Karmali固體培養(yǎng)基試劑21.5 g+雙蒸水425 ml，121 ℃高壓滅菌15 min，待溫度降至50 ℃左右，加入脫纖維羊血25 ml、Hp選擇性添加劑1瓶，混合均勻后吸取18 ml加入無(wú)菌平皿，另加入不同成分、不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥液2 ml，混勻，待凝固后倒置冷藏保存。

1.2.3 Hp培養(yǎng)、鑒定、傳代 將保存的Hp菌株ATCC43504接種到普通培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿倒置，于37 ℃、微需氧環(huán)境培養(yǎng)3 d，經(jīng)尿素酶試驗(yàn)、過(guò)氧化物酶試驗(yàn)鑒定證實(shí)為Hp。菌株傳代擴(kuò)增菌量，備用于后續(xù)藥敏實(shí)驗(yàn)。Hp菌液的制備：Hp菌株于上述條件下培養(yǎng)3 d，用無(wú)菌接種環(huán)刮取適量菌落，置于生理鹽水中，用移液器吹打均勻，制成麥?zhǔn)蠞岫葹?的菌液，立即用于藥敏實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 藥敏實(shí)驗(yàn) 單藥藥敏實(shí)驗(yàn)。(1)藥敏紙片法。①制作中藥藥敏紙片：直徑6 mm的空白藥敏紙片分別滴入25 μl的1 g/ml的大黃、黃連、黃芩藥液，空白藥敏紙片滴加25 μl無(wú)菌雙蒸水做對(duì)照，放置于超凈工作臺(tái)中待紙片干燥。②接種Hp：90 μl麥?zhǔn)蠞岫葹?的菌液滴入上述普通培養(yǎng)基，棉簽均勻涂開(kāi)。③置入藥敏紙片、觀察抑菌環(huán)：使用無(wú)菌鑷子將不同藥敏紙片分別放置于接種Hp后的普通培養(yǎng)基表面的中心位置，培養(yǎng)3 d，后觀察有無(wú)抑菌環(huán)形成，并測(cè)量抑菌環(huán)直徑。抑菌環(huán)大小反映中藥大黃、黃連、黃芩對(duì)Hp的抑制能力。(2)瓊脂稀釋法：90 μl麥?zhǔn)蠞岫葹?的菌液分別滴入上述含藥培養(yǎng)基中，用棉簽將菌液均勻涂開(kāi)。另用實(shí)驗(yàn)菌株(質(zhì)控菌株)設(shè)對(duì)照組：90 μl麥?zhǔn)蠞岫葹?的菌液滴入普通培養(yǎng)基。培養(yǎng)3 d后，觀察Hp生長(zhǎng)狀況，記錄能完全抑制Hp生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中藥物的最低濃度，即最小抑菌濃度(MIC)。

聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)。采用瓊脂棋盤(pán)稀釋法，設(shè)計(jì)中藥大黃、黃連、黃芩不同組合及中藥大黃、黃連、黃芩分別與抗生素CLR、LEV、MTZ聯(lián)合，共12種聯(lián)合方案的藥敏實(shí)驗(yàn)。

聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基的制備：根據(jù)單藥藥敏實(shí)驗(yàn)得到的藥物的MIC，分別制備5種濃度的實(shí)驗(yàn)藥液備用，使最終含藥培養(yǎng)皿中藥物的濃度為2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC。Karmali固體培養(yǎng)基試劑21.5 g+雙蒸水425 ml，121 ℃高壓滅菌15 min，待溫度降至50 ℃左右，加入脫纖維羊血25 ml、Hp選擇性添加劑1瓶，混合均勻后吸取18 ml加入無(wú)菌平皿，另加2種上述實(shí)驗(yàn)藥物的藥液各1 ml并混勻。待凝固后倒置冷藏保存。每種聯(lián)合方案共計(jì)制備25種培養(yǎng)基用于聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)。

聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)：90 μl麥?zhǔn)蠞岫葹?的菌液分別滴入含有聯(lián)合實(shí)驗(yàn)藥物的培養(yǎng)基上，用棉簽將菌液均勻涂開(kāi)。另設(shè)對(duì)照組：90 μl麥?zhǔn)蠞岫葹?的菌液滴入普通培養(yǎng)基。培養(yǎng)3 d后，觀察每種聯(lián)合方案的培養(yǎng)基中Hp生長(zhǎng)狀況，記錄兩種藥物聯(lián)合時(shí)各自的MIC并計(jì)算聯(lián)合抑菌指數(shù)(Fractional inhibitory concentration index,FICI)。FICI=聯(lián)合用藥時(shí)甲藥MIC/單獨(dú)用藥時(shí)甲藥MIC+ 聯(lián)合用藥時(shí)乙藥MIC/單獨(dú)用藥時(shí)乙藥MIC。FICI≤0.5時(shí)甲乙兩藥為協(xié)同作用；0.52時(shí)兩藥為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 三味中藥對(duì)ATCC43504菌株的抑菌能力 藥敏紙片法抑菌環(huán)直徑及抑菌能力：黃連(22 mm)>大黃(18 mm)>黃芩(10 mm)，對(duì)照組培養(yǎng)皿中布滿Hp，未見(jiàn)雜菌及抑菌環(huán)。瓊脂稀釋法MIC及抑菌能力：黃連(0.625 mg/ml)>大黃(1.25 mg/ml)>黃芩(5 mg/ml)，對(duì)照組培養(yǎng)皿中布滿Hp，未見(jiàn)雜菌。

2.2 瓊脂稀釋法檢測(cè)抗生素對(duì)ATCC菌株的MIC 見(jiàn)表1。

表1 ATCC43504菌株的質(zhì)控范圍、耐藥折點(diǎn)及MIC(mg/L)

2.3 聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各中藥間、中藥與抗生素聯(lián)合的抑菌效果 聯(lián)合用藥時(shí)，大黃、黃連、黃芩及抗生素CLR、LEV、MTZ的MIC皆較單用時(shí)下降(表2，表3)。

三黃瀉心湯的組成大黃、黃連、黃芩兩兩聯(lián)合用藥，有相加作用或協(xié)同作用，未見(jiàn)拮抗作用。黃連與黃芩聯(lián)合，藥物敏感性提升較大，藥物聯(lián)合有協(xié)同作用(表2)。

大黃、黃連、黃芩分別與抗生素CLR、LEV、MTZ聯(lián)合用藥，有相加作用或協(xié)同作用，未見(jiàn)拮抗作用。黃連與CLR、黃連與MTZ、黃芩與MTZ聯(lián)合，實(shí)驗(yàn)藥物敏感性提升較大，藥物聯(lián)合有協(xié)同作用。菌株ATCC43504為抗生素MTZ的耐藥菌株，抗生素MTZ與黃連、黃芩聯(lián)合用藥時(shí)，敏感性提升較大，但聯(lián)合用藥時(shí)抗生素MTZ的MIC大于耐藥折點(diǎn)8 mg/L，菌株依然對(duì)抗生素MTZ耐藥(表3)。

表2 三味中藥間聯(lián)合用藥的MIC及聯(lián)合抑菌效果

3 討論

隨著對(duì)Hp根除的普及，Hp對(duì)抗生素(尤其是CLR、MTZ及喹諾酮類(lèi))的耐藥率在世界范圍逐年升高[14]。體外或動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，某些中藥、中藥提取物以及含中藥的黏膜保護(hù)劑有抑制Hp的作用[9,15-17]，全國(guó)多中心隨機(jī)平行對(duì)照的臨床研究顯示，三聯(lián)或四聯(lián)療法聯(lián)合中藥可以提高Hp根除率，減少三聯(lián)或四聯(lián)療法藥物不良反應(yīng)，對(duì)Hp根除失敗的患者亦能取得較好的療效[6,18-21]。有研究表明，中藥提取物威迫耐藥Hp菌株能提高其對(duì)抗生素的敏感性，甚至逆轉(zhuǎn)耐藥性使其變?yōu)槊舾芯闧22]。因此，將傳統(tǒng)中藥或者中藥組方與抗生素聯(lián)合應(yīng)用于根除Hp在提升抗生素對(duì)菌株敏感度、減輕抗生素帶來(lái)的不良反應(yīng)方向的研究成為新的熱點(diǎn)。

表3 中藥與抗生素聯(lián)合用藥的MIC及聯(lián)合抑菌效果

有研究對(duì)臨床根除Hp的核心中藥進(jìn)行歸經(jīng)分析，得出結(jié)果：治療Hp的中藥歸脾胃二經(jīng)，以清熱解毒、健脾益氣為主，清熱解毒藥類(lèi)黃連使用較多，健脾益氣多使用黃芪[23]。三黃瀉心湯出自張仲景的《金匱要略》，由大黃、黃連、黃芩3種中藥組成，主要功效為瀉火解毒，燥濕泄熱除痞。近年體外研究已證實(shí)其有抑殺Hp的作用[13]?，F(xiàn)代藥理研究證明，三味中藥有抗炎、體外殺滅Hp作用[24-26]，但關(guān)于三味中藥間聯(lián)合對(duì)Hp抑制是否存在增敏作用未見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期在三黃瀉心湯組方及其組成成分大黃、黃連、黃芩抑制Hp的臨床研究中，證明了三黃瀉心湯及其中的三味中藥與抗生素聯(lián)合用于臨床，能提高Hp根除率、改善胃不適癥狀、減輕根除Hp過(guò)程中抗生素引起的不良反應(yīng)[27-28]，但有關(guān)三味中藥與抗生素聯(lián)合應(yīng)用的抑菌效果及是否存在抗菌增敏的體外實(shí)驗(yàn)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)選用CLSI推薦的ATCC43504質(zhì)控菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中抗生素的MIC皆在允許質(zhì)控范圍內(nèi)，保證了結(jié)果的可靠性。通過(guò)藥敏紙片法及瓊脂稀釋法皆證實(shí)大黃、黃連、黃芩三味中藥有抑制Hp作用，抑菌能力從強(qiáng)到弱依次為黃連、大黃、黃芩，在此基礎(chǔ)上，采用瓊脂稀釋棋盤(pán)法判斷聯(lián)合抑菌效果。瓊脂稀釋棋盤(pán)法較肉湯稀釋棋盤(pán)法工作量大、過(guò)程繁瑣、耗材多[29]，但對(duì)于中藥的藥敏實(shí)驗(yàn)不僅能避免中藥藥液顏色對(duì)結(jié)果的干擾，而且可以更直觀地判斷藥敏結(jié)果。聯(lián)合用藥時(shí)，大黃、黃連、黃芩及抗生素CLR、LEV、MTZ的MIC皆較單用時(shí)下降。黃連與黃芩、黃連與CLR、黃連與MTZ、黃芩與MTZ聯(lián)合有協(xié)同作用，即兩藥的聯(lián)合作用大于單獨(dú)作用的總和。其余藥物組合均為相加作用，即兩藥的聯(lián)合作用等于單獨(dú)作用的總和。Hp菌株ATCC43504為抗生素CLR、LEV的敏感菌株，為抗生素MTZ的耐藥菌株，結(jié)果表明，中藥對(duì)菌株ATCC43504有抑制作用，聯(lián)合用藥時(shí)，菌株對(duì)CLR、LEV、MTZ的敏感性皆有所提升。因此，中藥與抗生素CLR、LEV、MTZ聯(lián)合，可以一定程度上提高抗生素的敏感性；中藥聯(lián)合較單藥有更強(qiáng)的抑制Hp能力，而三黃瀉心湯組方對(duì)Hp的抑制作用可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于三味中藥分別單用。

綜上所述，三黃瀉心湯的組成大黃、黃連、黃芩對(duì)Hp有抑制作用，三味中藥的聯(lián)合應(yīng)用較單藥對(duì)Hp有更強(qiáng)的抑制作用，中藥與抗生素的聯(lián)合可以進(jìn)一步提高抗生素抑制Hp的作用。本研究為臨床上中藥三黃瀉心湯輔助抗生素提高Hp的根除率提供了一定的理論依據(jù)，為中藥輔助根除Hp的研究提供了新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。