田嬋嬋，王宏志，馬欣悅

0 引言

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(Obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS)是世界上最普遍的慢性呼吸系統(tǒng)疾病[1]。OSAHS會導致短暫的呼吸停止(呼吸暫停)或睡眠期間流量明顯減少(呼吸不足)[2]，其中男性的發(fā)病率為22%(9%～37%)，女性的發(fā)病率為17%(4%～50%)[3]。慢性間歇性低氧(Chronic intermittent hypoxia,CIH)是OSAHS的主要病理特征，表現(xiàn)為睡眠中反復(fù)出現(xiàn)缺氧和復(fù)氧情況，是OSAHS導致心腦血管并發(fā)癥的主要因素[4]。OSAHS引起組織損傷，特別是在肺組織中，CIH可能引起肺部炎癥，導致肺纖維化[5]。

研究發(fā)現(xiàn)，Nrf-2是人體抵抗氧化應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)劑，可以預(yù)防多種氧化應(yīng)激疾病，例如癌癥、高血壓、肺纖維化、腎纖維化、阿爾茨海默病[6-7]。作為血紅素加氧酶家族的成員，HO-1在抗炎、抗氧化和凋亡抑制中起著至關(guān)重要的作用[8]。因此，Nrf2/HO-1信號通路已成為氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要信號途徑[9]。

人參皂苷Rg1(GRg1)是一種四環(huán)三萜類化合物，是從人參提取的生物活性成分之一。多項研究表明，GRg1具有抗氧化活性[10]，可有效減輕心臟、肝臟等的纖維化[11-12]，還可抑制IL-6和TNF-α的表達，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[13-14]。

本實驗通過建立CIH大鼠模型，研究人參皂苷Rg1對大鼠OSAHS引起的肺損傷及Nrf2/HO-1信號通路的影響，進一步探討其作用機制，為臨床治療OSAHS提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 60只SD大鼠(雄性，SPF級，6周，體重180～220 g)購自三峽大學實驗動物中心。實驗大鼠飼養(yǎng)于標準動物房中，正常飲食飲水，實驗動物設(shè)計經(jīng)過我院倫理委員會審查。大鼠適應(yīng)環(huán)境2周后進行實驗。

1.1.2 試劑 人參皂苷Rg1(HPLC≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司。大鼠MDA試劑盒、大鼠SOD試劑盒、大鼠GSH試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司。大鼠TNF-α試劑盒、大鼠IL-1β試劑盒、大鼠IL-6試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。HE試劑盒購自北京開瑞基生物科技有限公司。TRIzol試劑、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒和SYBR?Premix EX TaqTMII試劑盒購自日本TaKaRa公司。RIPA裂解液、BCA試劑盒購自美國Abcam公司。兔抗COX-2抗體，兔抗iNOS抗體，兔抗HO-1抗體、兔抗Nrf2抗體、兔抗GAPDH抗體和山羊抗兔IgG抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠CIH模型制備 造模：建立與OSAHS的病理生理特征相似的CIH動物模型。低氧艙內(nèi)先輸入壓縮空氣30 s，后輸入氮氣30 s，進行循環(huán)。實驗過程中注意檢測低氧艙內(nèi)的氧濃度，使艙內(nèi)氧濃度控制在8%～21%。實驗過程中艙內(nèi)產(chǎn)生的二氧化碳和水蒸氣被生石灰和硅膠吸取[15]。大鼠每天定時在低氧艙內(nèi)8 h，共4周。實驗結(jié)束后進行CIH模型鑒定。

1.2.2 分組及給藥 ①分組：60只SD大鼠分為4組：對照組(control組)、慢性間歇性缺氧組(CIH組)、人參皂苷Rg1低劑量組(CIH+GRg1-L組)和人參皂苷Rg1高劑量組(CIH+GRg1-H組)，每組15只，control組大鼠不予任何處理，CIH組、CIH+GRg1-L組和CIH+GRg1-H組按“1.2.1”進行模型制備。②給藥：給藥方式為灌胃，control組：無菌生理鹽水，4 ml/kg；CIH組：無菌生理鹽水，4 ml/kg；CIH+GRg1-L組：18 mg/kg的GRg1，給藥體積為4 ml/kg；CIH+GRg1-H組：36 mg/kg的GRg1，給藥體積為4 ml/kg[16]。于造模前經(jīng)灌胃相應(yīng)劑量的生理鹽水或GRg1。每天給藥1次，連續(xù)7 d。

1.2.3 肺功能測定 在末次給藥2 h后，采用動物肺功能分析系統(tǒng)測定各組大鼠的肺功能，計算IC、PEF、FEV0.3和VE。

1.2.4 MDA、SOD、GSH、TNF-α、IL-1β和IL-6的含量或活性測定 將各組大鼠肺組織放入到9倍體積的PBS中，用勻漿器分散到勻漿中，凍融3次，并在4 ℃以3 000 r/min 離心15 min，收集上清液。使用試劑盒分別檢測MDA、GSH、TNF-α、IL-1β、IL-6、TNF-α的含量及IL-1β、SOD的活性。

1.2.5 HE染色 各組大鼠的肺組織在室溫下用4%多聚甲醛固定過夜，用水洗滌6 h，然后在梯度濃度的乙醇中脫水(70%，2 h；80%，過夜；90%，2 h；100%，1 h)。將組織浸入二甲苯中直至透明，然后在60 ℃的石蠟中包埋2 h。將組織塊切成5 μm薄片，在水中攤開并轉(zhuǎn)移到載玻片上，于60 ℃干燥24 h。將切片在二甲苯中脫蠟，以梯度濃度的乙醇(100%，5 min；95%，2 min；85%，2 min；75%，2 min)中脫水。然后將切片用蘇木精染色5 min，沖洗后再用伊紅染色3 min，在梯度濃度的乙醇中脫水(每次2 min，分別以75%、85%、95%的比例脫水；每次5 min，以100%的比例脫水)，在二甲苯中透明2次，每次10 min。之后使用中性樹膠封片，使用光學顯微鏡觀察切片并拍照。

1.2.6 qRT-PCR檢測 TRIzol試劑提取肺組織中的總RNA。使用紫外分光光度計檢測總RNA的含量，并將每個配對的樣品調(diào)節(jié)至相同濃度。使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR Premix EX TaqTMII試劑盒進行qRT-PCR。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s(1循環(huán))95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s(40循環(huán))。

使用StepOnePlus儀器完成實驗后，采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。引物見表1。

1.2.7 Western blot檢測 使用全細胞裂解分析試劑盒從組織中提取總蛋白，并使用Nucleus Protein Extraction Kit從細胞核中提取蛋白。使用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度后，通過SDS-PAGE分離總蛋白質(zhì)和細胞核蛋白質(zhì)；用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h后，將PVDF膜與以下抗體在4 ℃孵育過夜：兔抗COX-2(1∶400)、兔抗iNOS(1∶400)、兔抗Nrf2(1∶400)、兔抗HO-1(1∶400)和兔抗GAPDH(1∶1 000)。隨后，將PVDF膜用TBST洗滌3次，持續(xù)5 min，并與山羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)孵育1 h，用TBST洗滌3次，持續(xù)5 min。最后顯影曝光，用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶的灰度值進行分析。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 CIH模型的鑒定 大鼠在低氧艙內(nèi)的最后1 d，分別在低氧艙內(nèi)氧最低濃度和低氧艙內(nèi)氧最高濃度時，隨機對大鼠進行血氧飽和度和動脈血氣分析檢測，其血氧飽和度為70%～92%，動脈氧分壓為60.7～80.1 mmHg，接近OSAHS病理生理特點，因此CIH動物模型建立成功。

2.2 各組大鼠肺功能的比較 與control組比較，CIH組大鼠IC、PEF、FEV0.3及VE均明顯降低(P<0.01)；與CIH組比較，CIH+GRg1-L組和CIH+GRg1-H組大鼠IC、PEF、FEV0.3及VE均升高(P<0.01)。結(jié)果見表2。

2.3 各組大鼠肺組織中MDA、SOD和GSH的表達變化 與control組比較，CIH組大鼠肺組織中MDA的含量明顯增加(P<0.01)，SOD的活性和GSH的含量均明顯降低(P<0.001，P<0.01)；與CIH組比較，CIH+GRg1-L組和CIH+GRg1-H組大鼠肺組織中MDA的含量均降低(P<0.05)，SOD的活性和GSH的含量均升高(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表2 各組大鼠的IC、PEF、FEV0.3、VE比較

表3 各組大鼠肺組織中MDA、GSH含量以及SOD活性比較

2.4 各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達變化 與control組比較，CIH組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均顯著增加(P<0.01)；與CIH組比較，CIH+GRg1-L組和CIH+GRg1-H組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均降低(P<0.05)。結(jié)果見表4。

2.5 各組大鼠肺組織的病理變化 control組大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)正常，沒有炎性細胞浸潤；CIH組大鼠肺組織嚴重受損，肺泡結(jié)構(gòu)變形，上皮細胞變性，壞死脫落，并出現(xiàn)間質(zhì)水腫，肺泡中可見炎性細胞浸潤，大量液體滲出；CIH+GRg1-L組和CIH+GRg1-H組大鼠肺組織受損減輕，炎性細胞浸潤減少，肺部水腫也減輕。結(jié)果見圖1。

表4 各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達比較

2.6 各組大鼠肺組織中COX-2和iNOS的表達變化 與control組比較，CIH組大鼠肺組織中COX-2 mRNA和iNOS mRNA表達水平均顯著上調(diào)(P<0.001)；與CIH組比較，CIH+GRg1-L組和CIH+GRg1-H組大鼠肺組織中COX-2 mRNA和iNOS mRNA表達水平均下調(diào)(P<0.05)；由圖2B可知，與control組比較，CIH組大鼠肺組織中COX-2 蛋白和iNOS 蛋白表達水平均顯著上調(diào)(P<0.001)；與CIH組比較，CIH+GRg1-L組和CIH+GRg1-H組大鼠肺組織中COX-2蛋白和iNOS蛋白表達水平均下調(diào)(P<0.05)。見圖2。

圖1 各組大鼠肺組織的病理變化

圖2 各組大鼠肺組織中COX-2和iNOS的表達變化

2.7 各組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1的表達變化 與control組比較，CIH組大鼠肺組織中Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達水平均顯著上調(diào)(P<0.001)；與CIH組比較，CIH+GRg1-L組和CIH+GRg1-H組大鼠肺組織中Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達水平均下調(diào)(P<0.05)；由圖3B可知，與control組比較，CIH組大鼠肺組織中Nrf2蛋白和HO-1蛋白表達水平均顯著上調(diào)(P<0.001)；與CIH組比較，CIH+GRg1-L組和CIH+GRg1-H組大鼠肺組織中Nrf2蛋白和HO-1蛋白表達水平均下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1的表達變化

3 討論

OSAHS是睡眠呼吸障礙的一種常見情況，其患病率在中老年人中為5%～14%[17]。OSAHS的病理生理學包括睡眠期間反復(fù)出現(xiàn)的部分或完全的上呼吸道阻塞，導致通氣不足、呼吸暫停、間歇性缺氧和高碳酸血癥[18]。OSAHS導致呼吸作用增加，交感興奮性增加，睡眠結(jié)構(gòu)改變和缺氧，這可能導致肺、心血管和腦血管事件，并引起代謝紊亂、神經(jīng)認知功能障礙和其他疾病[19-20]。本研究采用低氧艙建立CIH模型大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠的肺功能明顯下降。

研究發(fā)現(xiàn)，ROS可以損傷細胞膜，被認為是氧化應(yīng)激的標志[21]。MDA是由ROS催化的脂質(zhì)氧化的最終產(chǎn)物，可攻擊細胞膜和電子傳輸鏈[22]。因此，本研究將MDA的水平作為氧化應(yīng)激反應(yīng)的生物標志物進行了檢測。SOD是一種重要的抗氧化酶，與催化酶和過氧化物酶一起可消除ROS[23]。GSH是一種三肽，在由谷胱甘肽過氧化物酶催化的反應(yīng)中，被ROS氧化為谷胱甘肽二硫化物。然后，谷胱甘肽還原酶將谷胱甘肽二硫化物還原為GSH，以消除ROS[24]。本研究證明，CIH能引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，使MDA含量升高，SOD活性和GSH含量降低。在本研究中，肺組織中的TNF-α、IL-1β和IL-6表達增加。TNF-α、IL-1β和IL-6均由白細胞產(chǎn)生，并在炎癥反應(yīng)中起重要作用[25-26]。這些結(jié)果的增加表明肺組織中存在炎癥。

此外，CIH激活了缺氧誘導因子α，該因子刺激各種基因的轉(zhuǎn)錄，包括COX-2和iNOS[27]。在氧化應(yīng)激過程中，iNOS的表達迅速增加。iNOS表達受多種細胞因子誘導，包括干擾素γ、IL-1、IL-6和TNF-α[28]。COX是前列腺素合成中的關(guān)鍵酶，而COX-2是可誘導的異構(gòu)體，具有抗炎和抗氧化的特性[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，CIH組大鼠肺組織中COX-2和iNOS蛋白明顯增加，與上述文獻報道一致。

Nrf2是抗氧化的最重要調(diào)節(jié)劑。在常氧條件下，Nrf2通常在細胞質(zhì)中，但在氧化應(yīng)激的條件下，Nrf2轉(zhuǎn)移到細胞核中，激活抗氧化反應(yīng)元件，并促進下游基因的轉(zhuǎn)錄，包括GPx、SOD和HO-1[9]。HO-1是一種可誘導的酶，可被多種壓力誘導。Nfr 2/HO-1信號通路是氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要信號途徑，參與抗炎、抗氧化等[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，CIH組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1蛋白表達上調(diào)。

人參是一種傳統(tǒng)中藥，可能會影響許多生物過程，包括炎癥反應(yīng)，細胞增殖和凋亡。GRg1是人參中含量最豐富的成分，是人參藥理作用的關(guān)鍵成分。有報道，GRg1對活性氧應(yīng)激、衰老、血管生成和神經(jīng)元分化具有調(diào)節(jié)作用[31]。本研究中，GRg1提高了大鼠的肺功能，大鼠肺組織中MDA的含量降低，SOD的活性和GSH的含量升高，TNF-α、IL-1β和IL-6的含量也降低；同時，大鼠肺組織受損減輕，炎性細胞浸潤減少，大鼠肺組織中COX-2、iNOS、Nrf2和HO-1蛋白表達水平下調(diào)。因此，GRg1對OSAHS有一定的治療作用。

綜上所述，GRg1減弱了COX-2和iNOS的表達并抑制Nrf2的核易位，從而抑制了下游HO-1基因的轉(zhuǎn)錄并減弱了氧化應(yīng)激反應(yīng)，為臨床治療OSAHS提供了新的理論依據(jù)。