程方圓，路 凱，劉 捷,白 寧，徐瑞芬，霍 苗，陳 方*

0 引言

缺血性腦卒中是一種極具破壞性的腦血管疾病，有很高的致殘率和死亡率[1]?，F(xiàn)階段，缺血性腦卒中治療原則是恢復(fù)缺血區(qū)的血液流通，但某些情況下，恢復(fù)血流反而導(dǎo)致更嚴(yán)重的損傷[2]。研究顯示，腦缺血再灌注主要損傷血腦屏障的完整性，增加細(xì)胞旁路的滲透率，導(dǎo)致氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的發(fā)生，最終造成神經(jīng)元凋亡、腦水腫梗死、神經(jīng)功能損傷，因此，改善血腦屏障完整性是缺血性腦卒中治療的關(guān)注重點(diǎn)[3-4]。

亞甲基藍(lán)主要應(yīng)用于高鐵血紅蛋白血癥的治療，具有抗炎、抗氧化的特點(diǎn)[5]。近年來(lái)研究顯示，亞甲基藍(lán)對(duì)缺血性腦卒中具有保護(hù)作用，包括經(jīng)Nrf2/HO-1信號(hào)通路，降低腦中自由基ROS表達(dá)水平[6]；抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C,減少細(xì)胞凋亡，下調(diào)炎癥因子表達(dá)水平[7]，最終改善神經(jīng)功能，減少腦梗死體積和腦水腫[8]。然而，迄今為止，亞甲基藍(lán)對(duì)血腦屏障的保護(hù)作用與機(jī)制鮮有報(bào)道。因此，本研究觀察亞甲基藍(lán)對(duì)腦缺血再灌注后血腦屏障通透性的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 藥物與儀器 亞甲基藍(lán)(M9140)：美國(guó)SIGMA公司；occuldin、claudin-5蛋白抗體：美國(guó)Abcam公司(ab128906)；脂質(zhì)過(guò)氧化物(MDA)、抗氧化酶(SOD)、IL-6、IL-1β試劑盒：南京建成公司；伊文思藍(lán)(Evans Blue,EB)：美國(guó)SIGMA公司；頸動(dòng)脈栓塞線栓：廣州佳靈生物有限公司；Western blot儀器：美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像儀：南京天能公司。

1.2 動(dòng)物分組與給藥 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。SD大鼠按照隨機(jī)分配的原則分為5組，每組12只：假手術(shù)組，模型組，低劑量組(亞甲基藍(lán)1 mg/kg)，中劑量組(亞甲基藍(lán)2 mg/kg)，高劑量組(亞甲基藍(lán)4 mg/kg)。亞甲基藍(lán)組手術(shù)前1 d腹腔注射亞甲基藍(lán)，恢復(fù)灌注后再次腹腔注射亞甲基藍(lán)溶液，假手術(shù)組、模型組手術(shù)注射生理鹽水。

1.3 大鼠局灶腦缺血模型的建立 采用改良的Longa線栓法[9]建立大鼠缺血再灌注模型(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)，自頸外動(dòng)脈殘端插入線栓并前進(jìn)至頸內(nèi)動(dòng)脈中阻塞血液流通。缺血2 h后抽出線栓，縫合傷口，使血液流通再灌注24 h。假手術(shù)組打開(kāi)頸動(dòng)脈后立即縫合。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分法 大鼠造模結(jié)束24 h后進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無(wú)神經(jīng)缺損癥狀，可直線行走；1分為左前肢彎曲，無(wú)法伸直；2分為不能直行，單向旋轉(zhuǎn)大圈；3分為單側(cè)傾倒，單向旋轉(zhuǎn)小圈；4分為不能行走或癱瘓[10]。

1.5 梗死面積計(jì)算 取完整大腦，冷凍0.5 h，將大腦切成2 mm×5 mm切片，2% TTC溶液浸沒(méi)切片表面，37 ℃條件下避光孵育0.5 h，相機(jī)拍攝，Image J量化統(tǒng)計(jì)梗死面積，與腦片量化面積對(duì)比，記為梗死面積百分比。

1.6 血腦屏障通透性評(píng)估 參考文獻(xiàn)[11]，動(dòng)物處死前2 h腹腔注射2%EB溶液，劑量2 ml/kg。動(dòng)物斬首后，完整取出大腦并精確稱重，在2.5 ml PBS溶液中勻漿后，加入2.5 ml三氯乙酸(60%)，3 000 r/min離心30 min，使用分光光度計(jì)在610 nm處測(cè)定伊文思藍(lán)的吸光度，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出結(jié)果。

1.7 試劑盒檢測(cè) 取梗死側(cè)海馬組織，以w∶v=1∶9加入PBS溶液，研磨，靜置30 min后12 000 r/min離心30 min，吸取上清液。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)添加、孵育、棄去樣品與試液，使用酶標(biāo)儀在試劑盒指定波長(zhǎng)下掃描OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出含量。

1.8 Western blot檢測(cè) 取梗死側(cè)海馬組織，加入組織裂解液，冰塊上研磨，靜置后離心。取上清液測(cè)試BCA試劑盒，加入與上清液等量5×上樣緩沖液，沸水浴15 min變性蛋白。根據(jù)BCA試劑盒所測(cè)蛋白含量進(jìn)行等量上樣。開(kāi)始SDS凝膠電泳，結(jié)束后經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，4 ℃條件下孵育檢測(cè)蛋白抗體10 h。洗凈檢測(cè)蛋白抗體后室溫孵育對(duì)應(yīng)鼠/兔源二抗2 h，洗凈二抗后使用顯影儀成像，Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行量化分析。所有蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值比較后進(jìn)行歸一化處理。

1.9 數(shù)據(jù)處理 采用Graphpad prism 5軟件的單因素方差分析中one-way analysis of variance(ANOVA)和Tukey′s test 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 亞甲基藍(lán)對(duì)I/R大鼠腦中梗死面積的影響 大鼠腦缺血再灌注損傷24 h后進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分，如圖1A所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分顯著升高(P<0.05)，高劑量亞甲基藍(lán)顯著改善了大鼠神經(jīng)功能損傷(P<0.05)，而低、中劑量亞甲基藍(lán)并沒(méi)有顯著改善大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，提示亞甲基藍(lán)發(fā)揮療效存在劑量依賴性的現(xiàn)象。TTC染色用于顯示腦梗死面積，正常腦組織被染成紅色而梗死區(qū)域腦組織呈白色。如圖1B所示，大鼠I/R手術(shù)后24 h，缺血側(cè)大腦有顯著的梗死，與模型組相比，中、高劑量亞甲基藍(lán)治療顯著減少了大腦梗死面積，而低劑量亞甲基藍(lán)未能改善大鼠腦梗死面積。在神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分中，低劑量亞甲基藍(lán)治療效果低于高劑量亞甲基藍(lán)。提示I/R造模成功誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)與臨床缺血性腦卒中患者相似的神經(jīng)功能損傷的癥狀，大腦部分區(qū)域發(fā)生水腫梗死，而亞甲基藍(lán)給藥能夠緩解這一癥狀且存在劑量依賴性。

圖1 亞甲基藍(lán)對(duì)腦缺血再灌注的保護(hù)作用

2.2 亞甲基藍(lán)對(duì)I/R大鼠血腦屏障完整性的影響 MCAO能夠損傷血腦屏障結(jié)構(gòu)之間緊密性與完整性，導(dǎo)致血液循環(huán)中有害物質(zhì)進(jìn)入腦中造成神經(jīng)損傷。我們通過(guò)皮下注射伊文思藍(lán)，檢測(cè)腦中伊文思藍(lán)含量，確定血腦屏障的完整性。如圖2所示，右腦作為未灌注損傷側(cè)大腦，檢測(cè)出伊文思藍(lán)濃度較低，且各組間沒(méi)有顯著性差異，提示完整的血腦屏障能夠減少血液循環(huán)中有害物質(zhì)侵入。在灌注側(cè)大腦中，與假手術(shù)組相比，模型組中伊文思藍(lán)濃度顯著升高(P<0.05)，提示MACO損傷了大鼠血腦屏障的完整性。而亞甲基藍(lán)對(duì)血腦屏障有保護(hù)作用，與模型組相比，亞甲基藍(lán)中高劑量(2 mg/kg,4 mg/kg)治療顯著減少了缺血側(cè)大腦中伊文思藍(lán)含量(P<0.05)，且亞甲基藍(lán)低劑量(1 mg/kg)因未達(dá)到有效劑量無(wú)法保護(hù)血腦屏障完整性。

圖2 亞甲基藍(lán)對(duì)血腦屏障完整性的保護(hù)作用。

2.3 亞甲基藍(lán)對(duì)I/R大鼠腦中氧化應(yīng)激水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦中SOD活性顯著降低，而MDA含量顯著升高(P<0.05)，提示腦缺血再灌注手術(shù)可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)；與模型組比較，亞甲基藍(lán)治療大鼠腦中 SOD活性顯著提升，MDA含量顯著降低(P<0.05)，提示亞甲基藍(lán)高劑量(4 mg/kg)可一定程度上抑制腦缺血再灌注引起的大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)。見(jiàn)圖3。

圖3 亞甲基藍(lán)對(duì)腦中氧化應(yīng)激的影響

2.4 亞甲基藍(lán)對(duì)大鼠腦中炎癥反應(yīng)的影響 如圖4所示，與假手術(shù)組相比，I/R造模導(dǎo)致腦中炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，亞甲基藍(lán)高劑量組(4 mg/kg)大鼠腦中炎性細(xì)胞因子水平顯著降低(P<0.05)。提示I/R導(dǎo)致大鼠腦中產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，亞甲基藍(lán)能夠降低腦中炎癥反應(yīng)的發(fā)生，且存在劑量依賴性，僅亞甲基藍(lán)高劑量(4 mg/kg)能夠顯著降低腦中炎癥反應(yīng)發(fā)生。

圖4 亞甲基藍(lán)對(duì)腦中炎性相關(guān)因子的影響

2.5 亞甲基藍(lán)抑制內(nèi)皮細(xì)胞緊密連結(jié)蛋白的降解 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦中occludin與claudin-5表達(dá)顯著降低(P<0.05)。高劑量亞甲基藍(lán)干預(yù)治療后，與模型組相比，蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 亞甲基藍(lán)對(duì)occludin與claudin-5蛋白表達(dá)的影響

3 討論

血腦屏障是維持腦內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定、保證大腦正常功能的特殊屏障，是由微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形細(xì)胞端足、周細(xì)胞和基板組成的一個(gè)緊密結(jié)構(gòu)[12]。腦缺血再灌注會(huì)導(dǎo)致其緊密結(jié)構(gòu)損傷，直接導(dǎo)致神經(jīng)元所處生理環(huán)境改變，伴隨嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激，最終會(huì)引起突觸和神經(jīng)元功能紊亂。因此，保護(hù)血腦屏障的緊密結(jié)構(gòu)是腦缺血治療的重點(diǎn)[13]。

本研究利用I/R模型造成大鼠行為和認(rèn)知功能損傷，研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腦中存在嚴(yán)重的梗死現(xiàn)象，伴有行為學(xué)和神經(jīng)功能損傷。亞甲基藍(lán)治療能夠顯著減少大鼠腦中梗死面積，改善大鼠的神經(jīng)功能損傷。在血腦屏障完整性檢測(cè)中，相比于空白組與未缺血側(cè)大腦，缺血側(cè)腦中伊文思藍(lán)含量顯著升高，而亞甲基藍(lán)給藥組中，缺血側(cè)腦中伊文思藍(lán)含量顯著降低。這些結(jié)果表明，亞甲基藍(lán)可能作為一種治療策略，通過(guò)保護(hù)血腦屏障完整性來(lái)減輕缺血性卒中患者的腦損傷。

腦缺血再灌注過(guò)程中，活性氧自由基的過(guò)量產(chǎn)生，超過(guò)了腦組織和血管內(nèi)皮緊密連接的內(nèi)源性抗氧化能力，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。研究顯示，活性氧自由基能氧化細(xì)胞膜和基底膜上的不飽和脂肪酸，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜損傷，從而破壞血腦屏障完整性[14]。SOD是人體重要的氧自由基清除劑，當(dāng)氧自由基顯著增加時(shí)，其含量和活性顯著降低，而MDA 是主要脂質(zhì)過(guò)氧化物，能使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生破壞[15]。本研究中，急性缺血再灌注損傷后，亞甲基藍(lán)治療顯著提高了SOD活性，并降低了MDA升高。

神經(jīng)系統(tǒng)中，炎癥介導(dǎo)了多種神經(jīng)性疾病的發(fā)生和發(fā)展[16]。已有研究揭示，腦缺血再灌注可誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體在神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中的活化，激活其下游IL-6、IL-1β等其他炎癥因子的表達(dá)，增加炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重神經(jīng)元的凋亡與腦水腫的程度，進(jìn)而破壞血腦屏障完整性并導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷進(jìn)一步加重[17]。本研究中，腦缺血再灌注損傷后，大鼠腦中炎性細(xì)胞因子急劇增加，而亞甲基藍(lán)治療后，腦中炎癥因子IL-6與IL-1β的表達(dá)水平顯著降低。

血腦屏障是由內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接形成的代謝和物理屏障，血腦屏障的通透性很大程度上取決于內(nèi)皮細(xì)胞之間的膜輔助蛋白，包括occludin及claudin-5蛋白的相互作用。有報(bào)道，頸動(dòng)脈栓塞會(huì)引起內(nèi)皮細(xì)胞中occuldin及claudin-5蛋白表達(dá)降低[18]。在本研究中，occludin和claudin-5在亞甲基藍(lán)治療組中顯著上調(diào)，這意味著亞甲基藍(lán)能夠通過(guò)上調(diào)緊密連接蛋白表達(dá)來(lái)保護(hù)血腦屏障免受缺血和灌注誘導(dǎo)的破壞。

綜上所述，亞甲基藍(lán)能夠通過(guò)緩解腦中氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，發(fā)揮血腦屏障的保護(hù)作用，維持完整性，改善腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能損傷與大腦局部梗死，其機(jī)制可能與上調(diào)血腦屏障中緊密連接蛋白o(hù)ccludin與claudin-5表達(dá)相關(guān)。