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        高效液相色譜測定D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力

        2021-05-21 02:18:28程嬌梅齊祥明郭曉華
        農(nóng)產(chǎn)品加工 2021年7期
        關(guān)鍵詞:物質(zhì)量果糖反應時間

        程嬌梅,齊祥明,郭曉華

        (1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266000;2.青島蔚藍生物股份有限公司,山東青島 266000;3.山東美佳集團有限公司,山東 日照 276826)

        D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶(D-psicose 3-epimerase,DPEase) 是一種酮糖3 - 差向異構(gòu)酶,可以將D- 果糖轉(zhuǎn)化為D- 阿洛酮糖[1]。D - 阿洛酮糖是一種自然界中存在含量極少的稀有糖,其甜度相當于蔗糖的70%,但能量沉積效率僅相當于蔗糖的0.3%(這一數(shù)值明顯低于目前流行的代糖產(chǎn)品,木糖醇),因此D - 阿洛酮糖具有降血糖[2]、影響脂肪代謝[3-4]等生理功能,是一種潛在的可用于控制肥胖和糖尿病[5-6]的新型低熱量甜味劑[7]。目前,如果能實現(xiàn)上述的D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶商業(yè)化生產(chǎn),則有望實現(xiàn)該糖的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

        酶活力是酶制劑生產(chǎn)、應用中的關(guān)鍵定量指標。然而,目前關(guān)于D - 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力測定的方法報道還非常有限。盡管該酶相關(guān)的研究文獻提到了一些酶活力的測定手段[8-10],但大多語焉不詳,且不夠嚴謹。

        因此,嘗試基于該酶產(chǎn)物D - 阿洛酮糖的高效液相色譜定量檢測法的建立,確定該酶活力的檢測方法。D - 阿洛酮糖和D - 果糖為C3 位差向異構(gòu)體,結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似。因此,在酶活力測定的關(guān)鍵在于通過高效液相色譜將底物D - 果糖和產(chǎn)物D -阿洛酮糖分離,實現(xiàn)對D - 阿洛酮糖含量的精確定量。在此基礎之上,還對該酶的酶促反應條件進行了系統(tǒng)的研究,進而建立了操作簡單、準確可靠的酶活力測定方法,為該酶制劑的生產(chǎn)技術(shù)開發(fā)提供酶活力檢測方法上的支持。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        D - 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶(液體),蔚藍生物集團有限公司提供。

        D- 果糖(≥99%)、D- 阿洛酮糖(≥98.0%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供;甲醇、EDTA 二鈉鈣,均為市售色譜純;十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、一水合檸檬酸,均為市售分析純;去離子水,為自制純凈水。

        1.2 儀器與設備

        E2695、2414 型高效液相色譜儀,美國沃特世公司產(chǎn)品;PHS-3E 型pH 計,上海儀電科學儀器股份有限公司產(chǎn)品;TG16-WS 型高速離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品;DK-98-IIA 型恒溫水浴鍋,天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品;QT-1 型漩渦混合器,上海琪特分析儀器有限公司產(chǎn)品。

        1.3 分析方法

        1.3.1 酶活力定義及酶促反應步驟

        D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力定義:在一定溫度、pH 值條件下,每分鐘生成1 μmol D- 阿洛酮糖的量定義為一個酶活力單位,用U 表示。

        酶促反應步驟:取4 mL 一定pH 值、一定質(zhì)量分數(shù)的D- 果糖溶液作為底物,加入1 mL 稀釋好的D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶溶液,一定溫度下水浴反應一定時間,沸水浴10 min 終止反應,冷卻后用高效液相色譜測定D- 阿洛酮糖含量。

        D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力計算公式:

        式中:U——D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力,U/mL;

        C——通過標準曲線算得的D - 阿洛酮糖質(zhì)量濃度,g/L;

        0.005 ——反應總體積,L;

        1 000 000——g 與μg 的轉(zhuǎn)換系數(shù);

        n——稀釋倍數(shù);

        180.16 ——D- 阿洛酮糖摩爾系數(shù),g/mol;

        t——反應時間,min;

        m——樣品的量,mL。

        1.3.2 D - 阿洛酮糖含量測定

        色譜條件:色譜柱為Waters Sugar-Pak I 型色譜柱,流動相50 mg/L EDTA 鈣溶液,流速0.3 mL/min,柱溫90 ℃,進樣溫度25 ℃,檢測器為示差檢測器,檢測器溫度35 ℃,進樣量10 μL,運行時間40 min。

        在該色譜條件下測定D - 阿洛酮糖含量,對該方法的線性范圍、檢測限、定量限、重復性、加標收回率進行試驗。

        1.3.3 酶活力測定過程中最適條件探索

        (1) 底物質(zhì)量分數(shù)的確定。分別用pH 值6.5 的緩沖液配制質(zhì)量分數(shù)為4%,8%,15%,30%,40%的D- 果糖溶液,取4 mL 底物溶液,加入1 mL 酶液(此時的實際底物質(zhì)量分數(shù)為3.2%,6.4%,12.0%,24.0%,32.0%),在45 ℃下進行酶促反應30 min,測定反應液中的D - 阿洛酮糖產(chǎn)量,以確定底物質(zhì)量分數(shù)是否過量。

        (2) 最適反應溫度的確定。用pH 值6.5 的緩沖液配制質(zhì)量分數(shù)為30%的D- 果糖溶液,分別在30,35,40,45,50,55,60,65,70 ℃條件下進行酶促反應30 min,計算每個溫度下的酶活力,做溫度-酶活力曲線。

        (3) 最適反應pH 值的確定。分別用pH 值4.0,5.0,6.0,7.0,8.0 的緩沖液配制質(zhì)量分數(shù)為30%的D- 果糖溶液,在45 ℃下進行酶促反應30 min,計算每個pH 值下的酶活力,做pH 值- 酶活力曲線。

        (4) 反應時間的確定。用pH 值7.0 的緩沖液配制質(zhì)量分數(shù)為30%的D- 果糖溶液,在45 ℃下,分別進行5,10,15,20,25,30,60 min 的酶促反應,計算不同反應時間下的酶活力,做反應時間-酶活力曲線。

        1.3.4 D - 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力測定方法驗證

        選取10 個不同酶活力的樣品,用pH 值7.0 的緩沖液配制質(zhì)量分數(shù)為30%的D- 果糖溶液,在45 ℃下進行酶促反應,計算每個樣品的酶活力,重復測定5 次,計算其RSD。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 D- 阿洛酮糖HPLC 含量測定

        通過前期試驗確定較優(yōu)的色譜條件為Waters Sugar-Pak I 型色譜柱,流動相50 mg/L EDTA 鈣溶液,流速0.3 mL/min,柱溫90 ℃,進樣溫度25 ℃,檢測器為示差檢測器,檢測器溫度35 ℃,進樣量10 μL,運行時間40 min。

        果糖與D- 阿洛酮糖色譜圖見圖1。

        圖1 果糖與D - 阿洛酮糖色譜圖

        由圖1 可知,在此條件下,D- 阿洛酮糖在25~28 min 出峰,和反應底物D- 果糖(出峰時間在17.5~21.5 min) 可以實現(xiàn)有效分離。進一步探索可知,D-阿洛酮糖的檢測限為4.12 mg/L;信噪比(S/N)=10 的含量為定量限為10.3 mg/L;在測酶活擬采用的產(chǎn)物質(zhì)量濃度范圍0.5~5.0 g/L 內(nèi),線性度良好,R2=1。驗證試驗結(jié)果表明,此處建立的該糖檢測方法重復性(RSD) 小于1.0%;加標回收率為98.92%。

        2.2 酶活力測定過程中最適條件探索

        底物質(zhì)量分數(shù)- 酶活力測量值關(guān)系見圖2。

        圖2 底物質(zhì)量分數(shù)- 酶活力測量值關(guān)系

        由圖2 可知,酶反應體系中底物質(zhì)量分數(shù)為3.2%~24.0%時,產(chǎn)物D - 阿洛酮糖測量值隨著底物質(zhì)量分數(shù)的增大而增加,這說明此時的底物質(zhì)量分數(shù)沒有達到過量的程度。當?shù)孜顳 - 果糖質(zhì)量分數(shù)超過24.0%時,產(chǎn)物D - 阿洛酮糖測量值不再隨著底物質(zhì)量分數(shù)增加而變化,說明當反應體系質(zhì)量分數(shù)超過24.0%時,底物質(zhì)量分數(shù)達到了過量水平。因此,從經(jīng)濟性和酶反應的可操作性角度,最終確定反應體系內(nèi)底物質(zhì)量分數(shù)為24.0%。底物質(zhì)量分數(shù)再高時,反應液黏度大幅度增加,不利于酶反應充分進行。酶液酶活過高時,則進行適度的稀釋后再進行測定。

        溫度- 酶活力關(guān)系見圖3。

        圖3 溫度- 酶活力關(guān)系

        由圖3 可知,溫度為30~45 ℃時,酶活力隨溫度增加而增加;45 ℃時,酶活力達到最大值;45~70 ℃時,酶活力隨著溫度增加逐步下降;當溫度為55 ℃時,酶活力只有最高酶活力的40%左右。綜上所述,45 ℃是該酶最適溫度,也是酶活力測定過程中所選用的溫度。

        pH 值- 酶活力關(guān)系見圖4。

        圖4 pH 值- 酶活力關(guān)系

        由圖4 可知,pH 值為4.0~7.0 時,酶活力隨著pH 值的增加而增加;而pH 值為5.5~7.0 時,酶活力增加較快;pH 值7.0 時酶活力測量值達到最大。綜上所述,pH 值7.0 是該酶最適pH 值,也是酶活力測定過程中所選用的pH 值。

        反應時間- 酶活力測定值關(guān)系見圖5。

        圖5 反應時間- 酶活力測定值關(guān)系

        由圖5 可知,反應時間在5~20 min 時,酶活力測定值和反應時間呈線性正相關(guān)關(guān)系;反應時間為20 min 時,酶活力測定值達到最大;相應地,D- 阿洛酮糖質(zhì)量濃度和反應時間之間的關(guān)系也近似為線性正相關(guān)。反應時間超過20 min 后,體系中D - 阿洛酮糖質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定,此時根據(jù)酶活力計算公式測得的酶活力測定值隨著反應時間增加而降低。這表明,在試驗的酶反應體系中,當反應時間超過20 min 時,酶反應達到平衡,此后時間延長將無法正確測得酶活力實際值。因此,為使操作過程時間充足,最終確定D - 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力測定的反應時間為20 min。

        2.3 D- 阿洛酮3- 差向異構(gòu)酶酶活力測定方法驗證

        在上述確定的酶反應條件下,試驗對10 個D -阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶樣品進行了酶活力測定試驗,結(jié)果表明,RSD 值均少于5.0%(見表1),符合酶制劑檢測方法建立的要求,證明了高效液相色譜法測定D - 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力的方法準確可靠。

        D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力檢測方法驗證見表1。

        表1 D - 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力檢測方法驗證

        3 結(jié)論

        采用Waters 高效液相色譜儀(E2695,2414)Waters Sugar-Pak I 型色譜柱測定D- 阿洛酮糖含量,該方法的檢測限為4.12 mg/L,定量限為10.3 mg/L,在測酶活擬選產(chǎn)物質(zhì)量濃度0.5~5.0 g/L 范圍內(nèi)線性度良好(R2=1),重復性(RSD) 小于1.0%,加標收回率為98.92%。

        在高效液相色譜法測定D - 阿洛酮糖含量的基礎上,建立了D - 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力測定方法,從底物質(zhì)量分數(shù)、溫度、pH 值、反應時間等方面考查了這些因素對D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力測定的影響,確定了底物質(zhì)量分數(shù)為24%D- 果糖溶液,最適溫度為45 ℃,最適反應pH 值為7.0,反應時間為20 min。在該條件下,對D- 阿洛酮糖3- 差向異構(gòu)酶酶活力測定方法進行驗證,10 個樣品的RSD 均少于5.0%,說明高效液相色譜法測定D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力準確可靠。

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