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        米粉中金黃色葡萄球菌定量檢測盲樣 考核結(jié)果與分析

        2021-05-20 03:56:20譚艷妮曹明明李欣蔚
        現(xiàn)代食品 2021年5期
        關(guān)鍵詞:考核

        ◎ 譚艷妮,曹明明,李欣蔚,張 健,施 法

        (1.沈陽食品藥品檢驗所,遼寧 沈陽 110136;2.沈陽沈化院測試技術(shù)有限公司,遼寧 沈陽 110021;3.遼寧省糧食科學(xué)研究所,遼寧 沈陽 110032)

        金黃色葡萄球菌是引起食源性疾病的重要致病菌,分布較為廣泛,可污染食物、水源等,嚴重威脅著人類的身體健康[1-2]?!妒称钒踩珖覙藴?食品中致病菌限量》(GB 29921—2013)[3]中肉制品、水產(chǎn)制品、糧食制品、即食豆類制品、即食果蔬制品(包含醬腌菜)、飲料及即食調(diào)味品都對金黃色葡萄球菌進行了限量要求,可見金黃色葡萄球菌的檢測在食品安全檢驗中具有重要意義[4]。盲樣考核是為了保證各級食品安全承檢機構(gòu)檢測結(jié)果準確可靠,提高檢驗檢測水平,并以監(jiān)督和考核為目的的測評活動。2020年10月,沈陽市食品藥品檢驗所參加了由中國計量科學(xué)研究院組織實施總局本級食品安全承檢機構(gòu)盲樣考核測評活動,檢驗項目為“米粉中金黃色葡萄球菌的定量檢測”,最終結(jié)果為“滿意”。為提高實驗室工作質(zhì)量,總結(jié)經(jīng)驗,將實驗過程進行回顧分析。

        1 材料與方法

        1.1 樣品

        2個濃度水平的金黃色葡萄球菌樣品各1瓶,棕色西林瓶包裝,每瓶0.5 g,樣品編號為MDJP036和MDJP007;避光、-20 ℃儲存;樣品中菌數(shù)的參考范圍:1.0×103~1.0×106CFU·g-1。

        1.2 培養(yǎng)基及試劑

        Baird-Parker瓊脂平板,即用型培養(yǎng)基,編號:024040A,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供;腦-心浸出液肉湯(BHI),編號:GCM917B,北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供;血平板,即用型培養(yǎng)基,編號:024070,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供;凍干血漿環(huán),編號:029180,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供;營養(yǎng)瓊脂,編號:GCM107,北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供;磷酸鹽緩沖液(貯存液),編號:CM1022,北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供;革蘭氏染色液;營養(yǎng)肉湯,編號:CM106,北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供。。

        1.3 標準菌株

        表皮葡萄球菌,編號:CMCC(B)26069,購自中國醫(yī)學(xué)細菌菌種保藏管理中心;金黃色葡萄球菌,編號:ATCC 6538,購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

        1.4 儀器設(shè)備與耗材

        1300 series A2生 物 安 全 柜(Thermo Fisher)、IMH400-S電熱恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)、LBI-250生化培養(yǎng)箱(上海龍躍儀器設(shè)備有限公司)、SX-700 高壓滅菌器(Tomy Autoclave) )、微量移液器(Sartorius)、 移液器吸頭(Brand)、顯微鏡(Olympus)及一次性接種環(huán)(As One)。

        1.5 方法

        1.5.1 樣品前處理

        將裝有考核樣品MFJP036,MFJP007的西林瓶逐瓶從-20 ℃冰箱中取出,在室溫下放置5 min。在生物安全柜中進行無菌操作,打開西林瓶,向每瓶樣品直接加入4.5 mL磷酸鹽緩沖液復(fù)溶,充分混勻后得到1∶10稀釋度的樣品勻液。吸取1∶10樣品勻液1 mL,沿管壁緩慢注于盛有9 mL磷酸鹽緩沖液的無菌試管中,振搖試管使其混合均勻,制成1∶100的樣品勻液。按照上述操作,制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次,換用1次無菌吸頭。

        1.5.2 樣品接種

        根據(jù)樣品參考范圍1.0×103CFU·g-1到1.0×106CFU·g-1, 選擇10-2~10-8稀釋度的樣品勻液,進行檢測,每個稀釋度分別吸取樣品勻液0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種量分別加入3塊Baird-Parker平板,用無菌涂布棒涂布整個平板。

        1.5.3 培養(yǎng)

        涂布后,將平板正置于培養(yǎng)箱36 ℃培養(yǎng)1 h,待樣品勻液吸收后,翻轉(zhuǎn)平板,倒置培養(yǎng)至48 h。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 典型菌落計數(shù)

        本次盲樣考核共有樣品2份,每個樣品進行3次平行測定,每個稀釋梯度接種3塊Baird-Parker平板,根據(jù)作業(yè)指導(dǎo)書中給出的菌落范圍進行梯度稀釋,結(jié)果每份樣品均只有10-1、10-2、10-3稀釋度檢出,平板上典型菌落數(shù)見表1。

        金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圓形,表面光滑、凸起、濕潤,菌落直徑為2~3 mm,顏色呈灰黑色至黑色,有光澤,邊緣淺色,周圍繞以不透明圈,其外有一清晰帶。當用接種針觸及菌落時具有黃油樣黏稠感[5]。對于典型菌落必須進行革蘭氏染色,血平板劃線以及血漿凝固酶等試驗才能最終進行判斷,沃氏葡萄球菌和人葡萄球菌在Baird-Parker平板上的菌落特征與金黃色葡萄球菌相當接近,肉眼無法區(qū)分,會導(dǎo)致最終假陽性判斷。

        表1 金黃色葡萄球菌定量檢測平板計數(shù)結(jié)果表

        2.2 染色鏡檢

        樣品MDJP036和MDJP007典型菌落革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為G+球菌,排列呈葡萄球狀,無芽胞,無莢膜,直徑約為0.5~1.0 μm,如圖1所示。

        圖1 樣品典型菌落革蘭氏染色鏡檢結(jié)果圖

        2.3 血漿凝固酶試驗

        每只凍干血漿西林瓶加入0.5 mL滅菌生理鹽水至完全溶解,再加入BHI肉湯培養(yǎng)物0.3 mL,充分混勻,蓋好西林瓶塞,置于36 ℃培養(yǎng)箱內(nèi),每半小時觀察一次,觀察6 h,考核樣品MFJP036、MFJP007于培養(yǎng)3 h 后凝固,判定為陽性結(jié)果。同時陽性對照也于培養(yǎng)3 h后凝固,陰性對照和空白對照培養(yǎng)6 h后仍未凝固[6]。

        3 結(jié)論與討論

        本次盲樣考核結(jié)果中的兩份樣品,米粉中金黃色葡萄球菌定量檢測的Baird-Parker平板計數(shù)結(jié)果Z值均小于2,為滿意結(jié)果。

        本次考核樣品基質(zhì)為米粉,在試驗前應(yīng)考慮到基質(zhì)可能會存在不易溶解的特質(zhì),因此在稀釋過程中應(yīng)注意混勻,防止其對計數(shù)結(jié)果產(chǎn)生影響;所有即用型Baird-Parker平板培養(yǎng)基在使用前,應(yīng)放在36 ℃培養(yǎng)箱里干燥至表面水珠消失,防止涂布時因有水珠導(dǎo)致結(jié)果不準確;本次試驗嚴格按照GB 4789.10—2016中規(guī)定的培養(yǎng)基及試劑進行培養(yǎng)和測定,為確保結(jié)果準確,今后可加用金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基來降低干擾菌的影響,防止對典型菌落的錯判和漏判[7]。

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