◎ 田露露，蔣德意，韓 迪

（潤(rùn)盈生物工程（上海）有限公司，上海 201700）

青春雙歧桿菌有免疫調(diào)節(jié)作用，可以緩解免疫衰老帶來(lái)的有害作用及衰老相關(guān)的病理作用，因而可以抵制與衰老相關(guān)的疾病。青春雙歧桿菌是主要產(chǎn) γ-氨基丁酸的菌，因而作用于腸-腦軸[1-3]。青春雙歧桿菌是嚴(yán)格厭氧菌，培養(yǎng)條件要求苛刻，而且培養(yǎng)基成分對(duì)其生長(zhǎng)影響很大，因而體外培養(yǎng)很難達(dá)到較高的活菌數(shù)[4]。

雙歧桿菌培養(yǎng)基中的主要影響因素有碳源、氮源、還原劑、生長(zhǎng)因子等，培養(yǎng)基中碳源一般由葡萄糖，乳糖等提供，氮源一般有胰蛋白胨、蛋白胨、酵母抽提物等[4]。L-半胱氨酸可以降低氧氣的抑制作用[4]。無(wú)機(jī)鹽類(lèi)比如鐵、鎂、鋅、鈣、錳等元素的鹽都是其生長(zhǎng)必不可少的[5-6]。主要生長(zhǎng)因子還有低聚糖類(lèi)，如低聚果糖，低聚半乳糖等；蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物及一些蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)，如乳清蛋白、酪蛋白水解產(chǎn)物、酵母提取液、牛肉浸液、大豆胰蛋白酶水解產(chǎn)物、糖多肽等[4]。

提高雙歧桿菌活菌量的主要途徑有改進(jìn)培養(yǎng)基成分；通過(guò)耐氧馴化，降低培養(yǎng)條件；改進(jìn)保護(hù)劑等，目前已有青春雙歧桿菌培養(yǎng)工藝的優(yōu)化研究，多數(shù)集中在發(fā)酵培養(yǎng)基及凍干保護(hù)劑的研究，且活菌數(shù)低，僅為109cfu·mL-1[4-10]。本文從生產(chǎn)工藝的各個(gè)方面，如發(fā)酵、計(jì)數(shù)、凍干等方面確定最佳參數(shù)，從而提高凍干粉中青春雙歧桿菌的活菌數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

青春雙歧桿菌，潤(rùn)盈生物工程（上海）有限公司提供；TPY培養(yǎng)基、BBL培養(yǎng)基，青島海博；蛋白胨、牛肉浸粉、酵母膏、酵母粉、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、吐溫-80、磷酸氫二鉀、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸鎂、硫酸錳、胰蛋白胨、乳糖、氯化鈉、瓊脂、番茄浸粉、肝浸粉、酵母浸粉、淀粉、L-半胱氨酸、水解酪蛋白、大豆胨、氯化鎂、硫酸鋅、氯化鈣、氯化鐵、海藻糖、甘露糖、脫脂奶粉、葡萄糖、乳糖、低聚果糖、麥芽糊精、吐溫-80、賴(lài)氨酸、谷氨酸鈉、甘油、明膠、谷氨酸、甘露醇，VC均來(lái)自國(guó)產(chǎn)；Solarbio細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。

1.2 儀器設(shè)備

GL-22M高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-2102C紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱BPX-162，上海穎漢化工科技有限公司；SIM FD8-6冷凍干燥機(jī)；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；Olympus CX31生物顯微鏡；Mettler Toledo FiveEasy實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)；BioFlo/CelliGen 115玻璃通氣發(fā)酵罐；BIO-RAD S1000 Thermal Cycler PCR儀；BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)

1.3 方法

1.3.1 青春雙歧桿菌菌種鑒定

用培養(yǎng)基對(duì)菌種進(jìn)行活化培養(yǎng)，鏡檢，確定是否為純培養(yǎng)物，同時(shí)排除明顯不是雙歧桿菌的菌株；取上述處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的發(fā)酵液進(jìn)行16s鑒定，包括提取DNA、PCR、電泳、送出測(cè)序及比對(duì)分析，選擇青春雙歧桿菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 青春雙歧桿菌活菌計(jì)數(shù)法

在確定計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基的同時(shí)，確定培養(yǎng)方法。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下。①選擇上述確定的菌種，用培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。②配制4種計(jì)數(shù)用固體培養(yǎng)基，詳見(jiàn)表1。③取搖瓶發(fā)酵液，采用梯度稀釋方法和傾注法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，分別用4種不同固體培養(yǎng)基進(jìn)行傾注培養(yǎng)。④采用厭氧盒法進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。⑤選擇平板上活菌數(shù)最高的作為計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基，同時(shí)選擇重現(xiàn)性高的培養(yǎng)方式作為最佳培養(yǎng)方法。

表1 計(jì)數(shù)方法研究中培養(yǎng)基配方組成表

1.3.3 凍干過(guò)程優(yōu)化

凍干粉活菌數(shù)不高的關(guān)鍵原因是凍干，在凍干過(guò)程中菌體大量死亡，所以將凍干過(guò)程優(yōu)化作為主要問(wèn)題來(lái)解決。實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下。①上罐發(fā)酵，制備青春雙歧桿菌菌泥。②選擇12種不同的保護(hù)劑，詳見(jiàn)表2，離心乳化，用實(shí)驗(yàn)室SIM凍干機(jī)凍干。③各凍干粉活菌計(jì)數(shù)。④分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，找出在凍干過(guò)程中可能對(duì)青春雙歧桿菌起有效保護(hù)的物質(zhì)和保護(hù)劑配方。⑤將有效物質(zhì)和活菌數(shù)最高的保護(hù)劑配方中物質(zhì)組合，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)確定保護(hù)劑中各成分最佳用量。⑥反復(fù)驗(yàn)證篩選出的幾種保護(hù)劑，選擇保護(hù)效果較好的保護(hù)劑。⑦對(duì)乳化液中各保護(hù)劑與菌泥的添加比例進(jìn)行優(yōu)化，分別設(shè)置保護(hù)劑與菌泥幾種不同比例，進(jìn)行凍干計(jì)數(shù)，確定保護(hù)劑的最佳添加比例。⑧選擇最優(yōu)的一種保護(hù)劑及其與菌泥的最佳添加比例，算出乳化液中固形物濃度及保護(hù)劑中固形物濃度，設(shè)計(jì)不同乳化液中固形物濃度，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定不同固形物濃度對(duì)凍干粉中活菌數(shù)的影響。⑨重復(fù)實(shí)驗(yàn)，選擇實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)保護(hù)劑，及此保護(hù)劑的最佳添加量，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 凍干保護(hù)劑配方組成表

1.3.4 發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化

按照發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)置的基本原理，調(diào)整碳氮源比例配制8種培養(yǎng)基，詳見(jiàn)表3，盡可能提高發(fā)酵液OD值，同時(shí)保持菌體形態(tài)不出現(xiàn)異常；發(fā)酵終點(diǎn)判斷，發(fā)酵液不同生長(zhǎng)時(shí)間段放罐，離心凍干及活菌計(jì)數(shù)。選擇發(fā)酵液OD值高，生長(zhǎng)速度快，且菌體形態(tài)無(wú)異常，最終凍干粉活菌數(shù)高的培養(yǎng)基，作為最優(yōu)培養(yǎng)基。同時(shí)選擇凍干粉中活菌數(shù)高，全過(guò)程收率最高時(shí)作為發(fā)酵終點(diǎn)。

表3 發(fā)酵培養(yǎng)基配方表

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種鑒定

選用公司菌種編號(hào)分別為003、184、446、1021、1203、0422和1020共7株疑似青春雙歧桿菌的菌種中，利用16SrDNA鑒定技術(shù)，經(jīng)過(guò)4次反復(fù)鑒定，最終確認(rèn)0422為青春雙歧桿菌，其正反向序列如圖1。在NCBI Blast項(xiàng)目上進(jìn)行比對(duì)，其結(jié)果如圖2。

圖1 青春雙歧桿菌正反向序列圖

圖2 序列比對(duì)結(jié)果圖

2.2 計(jì)數(shù)方法研究

計(jì)數(shù)方法中培養(yǎng)基配方見(jiàn)表1。計(jì)數(shù)研究中不同培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表4，培養(yǎng)基2（MRSB培養(yǎng)基）中活菌數(shù)最高，菌落較大，且大小均一，選其作為青春雙歧桿菌計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基。

表4 計(jì)數(shù)研究中不同培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果表

2.3 凍干過(guò)程優(yōu)化

本文比較了12種不同配方的保護(hù)劑，凍干保護(hù)劑配方見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)顯示，用配方2作保護(hù)劑時(shí)，凍干粉中活菌數(shù)最高，結(jié)果見(jiàn)表5。因此將它作為基礎(chǔ)配方，對(duì)其進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 不同保護(hù)劑對(duì)凍干粉活菌數(shù)的影響表

表6 凍干優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可得出如下結(jié)論。①各因素對(duì)凍干粉活菌影響作用大小的順序?yàn)椋汗劝彼徕c＞脫脂奶粉＞麥芽糊精＞葡萄糖＞淀粉＞賴(lài)氨酸＞海藻糖。②最佳保護(hù)劑配方為：海藻糖2%，脫脂奶粉1%，葡萄糖1%，麥芽糊精1%，淀粉7%，賴(lài)氨酸2%，谷氨酸鈉3.5%，水82.5%。

再次對(duì)保護(hù)劑配方進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證后得出：正交實(shí)驗(yàn)2配方活菌數(shù)為3.8×1010cfu·g-1,正交實(shí)驗(yàn)7配方活菌數(shù)為4.2×1010cfu·g-1，正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后配方活菌數(shù)為2.6×1010cfu·g-1。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，優(yōu)化后，保護(hù)劑Ⅰ（正交實(shí)驗(yàn)2）凍干粉活菌數(shù)是優(yōu)化前（2.2×1010cfu·g-1）1.7倍，保護(hù)劑Ⅱ（正交實(shí)驗(yàn)7）凍干粉活菌是優(yōu)化前1.9倍，保護(hù)劑Ⅲ（正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后配方）凍干粉活菌數(shù)是優(yōu)化前1.2倍。繼續(xù)選擇這 3種保護(hù)劑進(jìn)行乳化液中保護(hù)劑與菌泥比例優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，比較驗(yàn)證這3種保護(hù)劑的效果，結(jié)果見(jiàn)表7。表7中實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在凍干過(guò)程中，用保護(hù)劑Ⅲ（正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后配方）作青春雙歧桿菌保護(hù)劑，當(dāng)乳化液中保護(hù)劑：菌泥比例為2∶1時(shí)，保護(hù)效果最好，凍干粉中活菌數(shù)最高，保護(hù)劑Ⅰ和Ⅱ的保護(hù)效果略差，因此，選擇保護(hù)劑3進(jìn)行乳化液固形物含量實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表8。從表8可以看出，青春雙歧桿菌在凍干過(guò)程中，用表7中保護(hù)劑Ⅲ作保護(hù)劑時(shí)，乳化液中固形物濃度為33.5%，凍干粉中活菌數(shù)最高，因此選擇乳化液中固形物濃度為33.5%，即乳化液：菌泥=2∶1時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，反復(fù)驗(yàn)證。

表7 乳化液中保護(hù)劑與菌泥比例優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表8 乳化液固形物含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

實(shí)驗(yàn)選擇保護(hù)劑Ⅲ作為保護(hù)劑，乳化液中保護(hù)劑∶菌泥=2∶1，其余條件不變，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為凍干粉活菌數(shù)9.3×1010cfu·g-1，與之前實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較，波動(dòng)不大，因此可得出如下結(jié)論：青春雙歧桿菌最優(yōu)凍干保護(hù)劑為：海藻糖2.0%，脫脂奶粉1.0%，葡萄糖1.0%，麥芽糊精1.0%，淀粉7.0%，賴(lài)氨酸2.0%，谷氨酸鈉3.5%，水82.5%；乳化液中保護(hù)劑：菌泥固形物=2∶1。

2.4 發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化

表3列舉了8種不同的培養(yǎng)基配方，表9為這8種培養(yǎng)基配方對(duì)發(fā)酵活菌數(shù)及pH的影響，綜合考慮青春雙歧桿菌生長(zhǎng)速度、菌體形態(tài)、生物量及凍干粉活菌數(shù)等各方面因素，最終選擇培養(yǎng)基7作為最佳配方。

以表9中培養(yǎng)基7為發(fā)酵培養(yǎng)基，選用優(yōu)化后的青春雙歧桿菌保護(hù)劑作為實(shí)驗(yàn)用保護(hù)劑，分別在發(fā)酵7.0 h 和8.5 h時(shí)，放罐并凍干計(jì)數(shù)，結(jié)果表明，發(fā)酵7 h 時(shí)，活菌數(shù)為2.6×1010cfu·g-1，發(fā)酵8.5 h時(shí)，活菌數(shù)為1.6×1010cfu·g-1。在發(fā)酵7 h時(shí)，即發(fā)酵液OD600值剛達(dá)到最大，發(fā)酵液中菌體剛進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)放罐，凍干粉中活菌數(shù)最高。延期放罐，總活菌數(shù)會(huì)損失30%，因此，青春雙歧桿菌發(fā)酵時(shí)，最佳的發(fā)酵終點(diǎn)是發(fā)酵液中OD值增速放緩，即將達(dá)到最大值時(shí)對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，此時(shí)菌體剛進(jìn)入穩(wěn)定期。

表9 各培養(yǎng)基培養(yǎng)后pH及活菌數(shù)差異表

3 結(jié)論

青春雙歧桿菌菌株經(jīng)過(guò)16srDNA鑒定后，經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)，發(fā)酵，保護(hù)劑工藝優(yōu)化后，實(shí)驗(yàn)室中發(fā)酵液OD值，凍干粉活菌數(shù)都有明顯提高，并且確定了最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間7 h。優(yōu)化前凍干粉活菌數(shù)為109CFU·g-1，優(yōu)化后最高為9.3×1010CFU·g-1。優(yōu)化前OD600值為5.96，優(yōu)化后為16.25。