◎ 田露露，蔣德意，韓 迪

（潤盈生物工程（上海）有限公司，上海 201700）

青春雙歧桿菌有免疫調節(jié)作用，可以緩解免疫衰老帶來的有害作用及衰老相關的病理作用，因而可以抵制與衰老相關的疾病。青春雙歧桿菌是主要產(chǎn) γ-氨基丁酸的菌，因而作用于腸-腦軸[1-3]。青春雙歧桿菌是嚴格厭氧菌，培養(yǎng)條件要求苛刻，而且培養(yǎng)基成分對其生長影響很大，因而體外培養(yǎng)很難達到較高的活菌數(shù)[4]。

雙歧桿菌培養(yǎng)基中的主要影響因素有碳源、氮源、還原劑、生長因子等，培養(yǎng)基中碳源一般由葡萄糖，乳糖等提供，氮源一般有胰蛋白胨、蛋白胨、酵母抽提物等[4]。L-半胱氨酸可以降低氧氣的抑制作用[4]。無機鹽類比如鐵、鎂、鋅、鈣、錳等元素的鹽都是其生長必不可少的[5-6]。主要生長因子還有低聚糖類，如低聚果糖，低聚半乳糖等；蛋白質水解產(chǎn)物及一些蛋白質類物質，如乳清蛋白、酪蛋白水解產(chǎn)物、酵母提取液、牛肉浸液、大豆胰蛋白酶水解產(chǎn)物、糖多肽等[4]。

提高雙歧桿菌活菌量的主要途徑有改進培養(yǎng)基成分；通過耐氧馴化，降低培養(yǎng)條件；改進保護劑等，目前已有青春雙歧桿菌培養(yǎng)工藝的優(yōu)化研究，多數(shù)集中在發(fā)酵培養(yǎng)基及凍干保護劑的研究，且活菌數(shù)低，僅為109cfu·mL-1[4-10]。本文從生產(chǎn)工藝的各個方面，如發(fā)酵、計數(shù)、凍干等方面確定最佳參數(shù)，從而提高凍干粉中青春雙歧桿菌的活菌數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

青春雙歧桿菌，潤盈生物工程（上海）有限公司提供；TPY培養(yǎng)基、BBL培養(yǎng)基，青島海博；蛋白胨、牛肉浸粉、酵母膏、酵母粉、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、吐溫-80、磷酸氫二鉀、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸鎂、硫酸錳、胰蛋白胨、乳糖、氯化鈉、瓊脂、番茄浸粉、肝浸粉、酵母浸粉、淀粉、L-半胱氨酸、水解酪蛋白、大豆胨、氯化鎂、硫酸鋅、氯化鈣、氯化鐵、海藻糖、甘露糖、脫脂奶粉、葡萄糖、乳糖、低聚果糖、麥芽糊精、吐溫-80、賴氨酸、谷氨酸鈉、甘油、明膠、谷氨酸、甘露醇，VC均來自國產(chǎn)；Solarbio細菌基因組DNA提取試劑盒。

1.2 儀器設備

GL-22M高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；UV-2102C紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱BPX-162，上海穎漢化工科技有限公司；SIM FD8-6冷凍干燥機；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；Olympus CX31生物顯微鏡；Mettler Toledo FiveEasy實驗室pH計；BioFlo/CelliGen 115玻璃通氣發(fā)酵罐；BIO-RAD S1000 Thermal Cycler PCR儀；BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)

1.3 方法

1.3.1 青春雙歧桿菌菌種鑒定

用培養(yǎng)基對菌種進行活化培養(yǎng)，鏡檢，確定是否為純培養(yǎng)物，同時排除明顯不是雙歧桿菌的菌株；取上述處于對數(shù)生長期的發(fā)酵液進行16s鑒定，包括提取DNA、PCR、電泳、送出測序及比對分析，選擇青春雙歧桿菌進行后續(xù)實驗。

1.3.2 青春雙歧桿菌活菌計數(shù)法

在確定計數(shù)用培養(yǎng)基的同時，確定培養(yǎng)方法。具體實驗過程如下。①選擇上述確定的菌種，用培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵。②配制4種計數(shù)用固體培養(yǎng)基，詳見表1。③取搖瓶發(fā)酵液，采用梯度稀釋方法和傾注法進行活菌計數(shù)，分別用4種不同固體培養(yǎng)基進行傾注培養(yǎng)。④采用厭氧盒法進行厭氧培養(yǎng)。⑤選擇平板上活菌數(shù)最高的作為計數(shù)用培養(yǎng)基，同時選擇重現(xiàn)性高的培養(yǎng)方式作為最佳培養(yǎng)方法。

表1 計數(shù)方法研究中培養(yǎng)基配方組成表

1.3.3 凍干過程優(yōu)化

凍干粉活菌數(shù)不高的關鍵原因是凍干，在凍干過程中菌體大量死亡，所以將凍干過程優(yōu)化作為主要問題來解決。實驗過程如下。①上罐發(fā)酵，制備青春雙歧桿菌菌泥。②選擇12種不同的保護劑，詳見表2，離心乳化，用實驗室SIM凍干機凍干。③各凍干粉活菌計數(shù)。④分析實驗結果，找出在凍干過程中可能對青春雙歧桿菌起有效保護的物質和保護劑配方。⑤將有效物質和活菌數(shù)最高的保護劑配方中物質組合，通過單因素和正交實驗確定保護劑中各成分最佳用量。⑥反復驗證篩選出的幾種保護劑，選擇保護效果較好的保護劑。⑦對乳化液中各保護劑與菌泥的添加比例進行優(yōu)化，分別設置保護劑與菌泥幾種不同比例，進行凍干計數(shù)，確定保護劑的最佳添加比例。⑧選擇最優(yōu)的一種保護劑及其與菌泥的最佳添加比例，算出乳化液中固形物濃度及保護劑中固形物濃度，設計不同乳化液中固形物濃度，進行實驗，確定不同固形物濃度對凍干粉中活菌數(shù)的影響。⑨重復實驗，選擇實驗中最優(yōu)保護劑，及此保護劑的最佳添加量，進行后續(xù)實驗。

表2 凍干保護劑配方組成表

1.3.4 發(fā)酵過程優(yōu)化

按照發(fā)酵培養(yǎng)基設置的基本原理，調整碳氮源比例配制8種培養(yǎng)基，詳見表3，盡可能提高發(fā)酵液OD值，同時保持菌體形態(tài)不出現(xiàn)異常；發(fā)酵終點判斷，發(fā)酵液不同生長時間段放罐，離心凍干及活菌計數(shù)。選擇發(fā)酵液OD值高，生長速度快，且菌體形態(tài)無異常，最終凍干粉活菌數(shù)高的培養(yǎng)基，作為最優(yōu)培養(yǎng)基。同時選擇凍干粉中活菌數(shù)高，全過程收率最高時作為發(fā)酵終點。

表3 發(fā)酵培養(yǎng)基配方表

2 結果與分析

2.1 菌種鑒定

選用公司菌種編號分別為003、184、446、1021、1203、0422和1020共7株疑似青春雙歧桿菌的菌種中，利用16SrDNA鑒定技術，經(jīng)過4次反復鑒定，最終確認0422為青春雙歧桿菌，其正反向序列如圖1。在NCBI Blast項目上進行比對，其結果如圖2。

圖1 青春雙歧桿菌正反向序列圖

圖2 序列比對結果圖

2.2 計數(shù)方法研究

計數(shù)方法中培養(yǎng)基配方見表1。計數(shù)研究中不同培養(yǎng)基計數(shù)結果見表4，培養(yǎng)基2（MRSB培養(yǎng)基）中活菌數(shù)最高，菌落較大，且大小均一，選其作為青春雙歧桿菌計數(shù)用培養(yǎng)基。

表4 計數(shù)研究中不同培養(yǎng)基計數(shù)結果表

2.3 凍干過程優(yōu)化

本文比較了12種不同配方的保護劑，凍干保護劑配方見表2。實驗顯示，用配方2作保護劑時，凍干粉中活菌數(shù)最高，結果見表5。因此將它作為基礎配方，對其進行正交實驗，進一步優(yōu)化，正交實驗設計及結果見表6。

表5 不同保護劑對凍干粉活菌數(shù)的影響表

表6 凍干優(yōu)化正交實驗結果表

根據(jù)正交實驗結果，可得出如下結論。①各因素對凍干粉活菌影響作用大小的順序為：谷氨酸鈉＞脫脂奶粉＞麥芽糊精＞葡萄糖＞淀粉＞賴氨酸＞海藻糖。②最佳保護劑配方為：海藻糖2%，脫脂奶粉1%，葡萄糖1%，麥芽糊精1%，淀粉7%，賴氨酸2%，谷氨酸鈉3.5%，水82.5%。

再次對保護劑配方進行驗證，驗證后得出：正交實驗2配方活菌數(shù)為3.8×1010cfu·g-1,正交實驗7配方活菌數(shù)為4.2×1010cfu·g-1，正交實驗優(yōu)化后配方活菌數(shù)為2.6×1010cfu·g-1。從實驗結果看出，優(yōu)化后，保護劑Ⅰ（正交實驗2）凍干粉活菌數(shù)是優(yōu)化前（2.2×1010cfu·g-1）1.7倍，保護劑Ⅱ（正交實驗7）凍干粉活菌是優(yōu)化前1.9倍，保護劑Ⅲ（正交實驗優(yōu)化后配方）凍干粉活菌數(shù)是優(yōu)化前1.2倍。繼續(xù)選擇這 3種保護劑進行乳化液中保護劑與菌泥比例優(yōu)化實驗，比較驗證這3種保護劑的效果，結果見表7。表7中實驗結果可知，在凍干過程中，用保護劑Ⅲ（正交實驗優(yōu)化后配方）作青春雙歧桿菌保護劑，當乳化液中保護劑：菌泥比例為2∶1時，保護效果最好，凍干粉中活菌數(shù)最高，保護劑Ⅰ和Ⅱ的保護效果略差，因此，選擇保護劑3進行乳化液固形物含量實驗，結果見表8。從表8可以看出，青春雙歧桿菌在凍干過程中，用表7中保護劑Ⅲ作保護劑時，乳化液中固形物濃度為33.5%，凍干粉中活菌數(shù)最高，因此選擇乳化液中固形物濃度為33.5%，即乳化液：菌泥=2∶1時，進行后續(xù)實驗，反復驗證。

表7 乳化液中保護劑與菌泥比例優(yōu)化實驗結果表

表8 乳化液固形物含量實驗結果表

實驗選擇保護劑Ⅲ作為保護劑，乳化液中保護劑∶菌泥=2∶1，其余條件不變，重復實驗，結果為凍干粉活菌數(shù)9.3×1010cfu·g-1，與之前實驗數(shù)據(jù)比較，波動不大，因此可得出如下結論：青春雙歧桿菌最優(yōu)凍干保護劑為：海藻糖2.0%，脫脂奶粉1.0%，葡萄糖1.0%，麥芽糊精1.0%，淀粉7.0%，賴氨酸2.0%，谷氨酸鈉3.5%，水82.5%；乳化液中保護劑：菌泥固形物=2∶1。

2.4 發(fā)酵過程優(yōu)化

表3列舉了8種不同的培養(yǎng)基配方，表9為這8種培養(yǎng)基配方對發(fā)酵活菌數(shù)及pH的影響，綜合考慮青春雙歧桿菌生長速度、菌體形態(tài)、生物量及凍干粉活菌數(shù)等各方面因素，最終選擇培養(yǎng)基7作為最佳配方。

以表9中培養(yǎng)基7為發(fā)酵培養(yǎng)基，選用優(yōu)化后的青春雙歧桿菌保護劑作為實驗用保護劑，分別在發(fā)酵7.0 h 和8.5 h時，放罐并凍干計數(shù)，結果表明，發(fā)酵7 h 時，活菌數(shù)為2.6×1010cfu·g-1，發(fā)酵8.5 h時，活菌數(shù)為1.6×1010cfu·g-1。在發(fā)酵7 h時，即發(fā)酵液OD600值剛達到最大，發(fā)酵液中菌體剛進入穩(wěn)定期時放罐，凍干粉中活菌數(shù)最高。延期放罐，總活菌數(shù)會損失30%，因此，青春雙歧桿菌發(fā)酵時，最佳的發(fā)酵終點是發(fā)酵液中OD值增速放緩，即將達到最大值時對應的時間點，此時菌體剛進入穩(wěn)定期。

表9 各培養(yǎng)基培養(yǎng)后pH及活菌數(shù)差異表

3 結論

青春雙歧桿菌菌株經(jīng)過16srDNA鑒定后，經(jīng)過計數(shù)，發(fā)酵，保護劑工藝優(yōu)化后，實驗室中發(fā)酵液OD值，凍干粉活菌數(shù)都有明顯提高，并且確定了最優(yōu)發(fā)酵時間7 h。優(yōu)化前凍干粉活菌數(shù)為109CFU·g-1，優(yōu)化后最高為9.3×1010CFU·g-1。優(yōu)化前OD600值為5.96，優(yōu)化后為16.25。