◎ 申艷琴，蘭 光，張 陽，張 璟，李欣穎，閆 靜，劉小菊

（甘肅省疾病預防控制中心，甘肅 蘭州 730000）

弧菌是一類菌體短小，桿狀或彎曲成弧狀的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于自然界，一般出現(xiàn)于水生動物和鹽濃度范圍較寬的水域中[1]?；【鄶?shù)為非致病菌，只有12種弧菌對人類有致病性，致病性弧菌與人類腸內、腸外感染有關，最常見的是副溶血性弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌和擬態(tài)弧菌[2]。致病性弧菌易引起人類急性胃腸炎、傷口、耳、眼感染和敗血癥等疾病，對人類健康構成嚴重的威脅[3]。其中副溶血性弧菌是我國沿海地區(qū)引起細菌性食物中毒的主要原因，近幾年，內陸城市中由副溶血弧菌引發(fā)的食物中毒事件也逐年增多，已經(jīng)成為我國食源性疾病的主要病原微生物[4]。根據(jù)近年的調查發(fā)現(xiàn)淡水產(chǎn)品及環(huán)境中致病性弧菌種類不斷增多，引起的食物中毒時有發(fā)生。蘭州市雖地處內陸，隨著經(jīng)濟的發(fā)展及人們生活水平的提高，市場水產(chǎn)品的數(shù)量及種類逐年增加，不斷有副溶血性弧菌引發(fā)食物中毒事件發(fā)生。螺肉富含蛋白質、維生素和人體必需的氨基酸和微量元素，是典型的高蛋白、低脂肪、高鈣質的天然動物性保健食品。螺類水產(chǎn)品成為各大飯店必不可少的食材。為了進一步了解蘭州市螺類水產(chǎn)品中重要致病性弧菌污染狀況，減少食源性疾病的危害性，對螺類水產(chǎn)品中霍亂弧菌、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌這4種致病性弧菌的污染狀況進行調查，并對其毒力基因進行檢測分析，為蘭州市螺類水產(chǎn)品中致病性弧菌的食品風險評估及衛(wèi)生監(jiān)督部門的管理提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

2019年隨機抽樣采集蘭州市城關區(qū)、七里河區(qū)、西固區(qū)的批發(fā)市場、農(nóng)貿(mào)市場和零售店的螺類水產(chǎn)品，共計175份，每份500 g。

1.1.2 儀器與試劑

全自動微生物鑒定系統(tǒng)BD Phonex50，熒光PCR儀BIOERReal-Time PCR Detection Systim；堿性蛋白胨水，北京陸橋公司；科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，鄭州博賽生物技術股份有限公司產(chǎn)品；副溶血性弧菌耐熱溶血素基因tdh、耐熱溶血素相關基因trh、不耐熱溶血素基因tlh熒光檢測試劑盒，均購自北京卓誠惠生科技有限公司；霍亂弧菌血清：日本生研。所有試劑均在有效期內使用。

1.2 方法

1.2.1 弧菌的分離與生化鑒定

參考《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》（GB 4789.7—2013）、國家食品安全評估中心發(fā)布的《年國家食品污染物和有害因素風險監(jiān)測手冊》，對樣品進行副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌和霍亂弧菌檢測。

1.2.2 副溶血性弧菌毒力基因檢測

應用實時熒光PCR儀對副溶血性弧菌進行毒力基因檢測，在一個PCR反應體系中同時檢測副溶血性弧菌（tlh）和致病性副溶血性弧菌（tdh、trh）。鑒于同一食品中副溶血性弧菌的多樣性，需要從每份樣品中取3～5個不同的副溶血性弧菌純菌落分別進行檢測。

1.2.3 霍亂弧菌血清學鑒定

自營養(yǎng)瓊脂斜面上挑取純培養(yǎng)物與O1群及O139群霍亂弧菌診斷血清做玻片凝集試驗。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，檢出率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 螺類水產(chǎn)品中4種致病性弧菌的檢出情況

在采集的175份螺類水產(chǎn)品中，共檢出致病性弧菌90株，檢出率為51.42%。其中溶藻弧菌檢出53株，檢出率為30.29%；副溶血性弧菌檢出22株，檢出率為12.57%；霍亂弧菌檢出9株，檢出率為5.14%；創(chuàng)傷弧菌檢出6株，檢出率為3.43%。具體檢測結果見表1。

表1 螺類水產(chǎn)品中4種致病性弧菌的檢出率表

2.2 不同季節(jié)螺類水產(chǎn)品中致病性弧菌的檢出情況

2019年4 個季度螺類水產(chǎn)品中的致病性弧菌陽性率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），秋季陽性率最高，為72.5%；夏季、冬季次之，陽性率分別為62.22%、46.67%；春季陽性率最低，為26.67%；具體檢測結果見表2。

表2 不同季節(jié)螺類水產(chǎn)品中致病性弧菌的檢出率表

2.3 副溶血性弧菌毒力基因檢測

采用實時熒光定量PCR，對22株副溶血性弧菌檢測副溶血性弧菌（tlh）和致病性副溶血性弧菌（tdh、trh）。結果顯示所有分離株不耐熱溶血素基因tlh均為陽性，而耐熱溶血素tdh、耐熱溶血素相關基因trh均為陰性，說明這些副溶血性弧菌分離株均不攜帶tdh、trh致病性相關基因。

2.4 霍亂弧菌血清學鑒定

霍亂弧菌是一種烈性腸道傳染病，該菌通過攝入受污染的水和食物經(jīng)口傳播。尤其是感染O1血清群或O139血清群后，易引起烈性腸道傳染病。近年來我國霍亂疫情以食源性暴發(fā)為主，特別是進食海（水）產(chǎn)品等[5]。因此，本文對此次檢出的9株霍亂弧菌進行了血清學分型。經(jīng)鑒定，9株霍亂弧菌均為非O1群和非O139群。

3 討論

本次調查研究蘭州市螺類水產(chǎn)品中共檢出4種常見致病性弧菌，且檢出程度略有差異，總檢出率為51.42%。其中溶藻弧菌檢出最多，檢出率為33.13%；溶藻弧菌（V.alginolyticus）與副溶血弧菌一樣，是沿海地區(qū)腹瀉病和食物中毒的常見致病菌，該菌可引起腸道炎、傷口、耳和眼的感染[6-7]，甚至敗血癥等腸外感染，引起的食物中毒事件頻繁報道[8-10]，通過此次調查發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌是蘭州市食源性疾病發(fā)生又一危險因素，應引起關注。副溶血性弧菌檢出率為13.75%，雖然未檢出tdh和trh基因，但根據(jù)相關文獻報道，仍有少量分離株表現(xiàn)出KP+現(xiàn)象，揭示了tdh-菌株仍具有一定的致病風險。霍亂弧菌檢出率較低，9株霍亂弧菌均為非O1/O139群，以往研究認為其不致病或僅引起散在輕度腹瀉，近年來有報道發(fā)現(xiàn)有些非O1/O139 群霍亂弧菌也可產(chǎn)生霍亂弧菌腸毒素，引起腹瀉、發(fā)熱等食物中毒。我國關于非O1/O139群霍亂弧菌引起的食物中毒事件屢見不鮮[11]，因此對水產(chǎn)品中霍亂弧菌監(jiān)測應列入監(jiān)管范圍。

此次調查結果顯示，蘭州市螺類水產(chǎn)品致病性弧菌污染狀況比沿海城市略低，與近年來甘肅省各地區(qū)致病性弧菌檢出率略高[12-13]，這與水產(chǎn)品在內陸城市的銷售大幅上漲相關，因此對蘭州市螺類水產(chǎn)品致病性弧菌污染狀況進行調查非常必要。螺類水產(chǎn)品大多是濾食性的攝食方式，通過水的吸入和吐出而濾取小型浮游生物，能將水環(huán)境中的致病性弧菌富集于體內，要加強對螺類水產(chǎn)品中致病性弧菌的監(jiān)測。

季節(jié)性分布顯示，一年中的5月～8月致病性弧菌總陽性率較高，可見蘭州市螺類水產(chǎn)品中致病性弧菌主要在夏秋季流行。嗜鹽性弧菌在不同季節(jié)檢出情況與文獻報道相似[3]。從對不同采樣地點類型監(jiān)測結果來看，零售店、網(wǎng)店檢出率顯著高于超市，分析原因可能是超市管理制度完善，各類食品分區(qū)域銷售，污染幾率降低。因此，衛(wèi)生監(jiān)督部門要加大對流通環(huán)節(jié)的衛(wèi)生監(jiān)督力度，加強從業(yè)人員衛(wèi)生知識的培訓工作，提高他們的衛(wèi)生素質，才能減少食物中毒發(fā)生。

綜上所述，蘭州市螺類水產(chǎn)品中4種致病性弧菌污染比較普遍，食品安全風險監(jiān)測部門應加大監(jiān)測監(jiān)控力度，與市場監(jiān)管部門和食品安全監(jiān)管部門加強監(jiān)測信息溝通，加強對螺類水產(chǎn)品銷售、餐飲環(huán)節(jié)的監(jiān)管力度，減少此類食品所引起的食源性疾病的發(fā)生。在此，也要提醒消費者養(yǎng)成良好的飲食習慣，注意個人衛(wèi)生，不生吃或半生吃、不吃未熟透的水產(chǎn)品等，以防止病從口入。