馬曉慧，王自豪，賈 鵬，雷初朝，廖玉英，黃光云*

(1.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西家畜遺傳改良重點實驗室，廣西南寧，530001；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌，712100)

水牛在動物學(xué)分類上屬于哺乳綱、偶蹄目、?？?、水牛屬。水牛屬包括非洲水牛亞屬和亞洲水牛亞屬[1]。現(xiàn)在世界上所有的家養(yǎng)水牛都是由亞洲水牛亞屬馴化而來。根據(jù)水牛的體型外貌、生活習(xí)性、細胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)等方面的不同，把家養(yǎng)水牛分為兩類，即江河型水牛(2n=50)和沼澤型水牛(2n=48)。中國水牛資源豐富，目前有24個沼澤型地方水牛品種，主要分布在中部和南部的18個省，特別在長江流域西南部和東南部的水稻種植區(qū)大量分布，在山東臨沂、陜西漢中、安康也有分布[2]。西林水牛和富鐘水牛是廣西壯族自治區(qū)重要的水牛品種，具有結(jié)構(gòu)勻稱、體格粗壯、四肢強健、性情溫馴、役用性能好、耐粗飼、善爬坡、適應(yīng)性和抗逆性強等特點[2]。

線粒體DNA遵循母系遺傳，進化速度快，變異主要來源于突變而非重組，可以真實地反映家畜的母系起源，在家畜的品種起源、遺傳分化和親緣關(guān)系等方面得到了廣泛應(yīng)用，是物種鑒定和祖先母系起源研究的最佳標(biāo)記之一[3]。Lei等[4]通過對中國6個水牛品種30個個體的mtDNA D-loop序列的研究，揭示中國沼澤型水牛由A和B 2個支系組成。Yue等[5]通過研究中國22個沼澤型水牛品種mtDNA D-loop序列的遺傳多樣性，提出支系A(chǔ)很可能在中國西南地區(qū)馴化而來。Zhang等[6]對中國、臺灣、越南、老撾、泰國、尼泊爾的沼澤型水牛的mtDNA D-loop序列進行分析，發(fā)現(xiàn)沼澤型水牛的遺傳多樣性高于江河型水牛，沼澤型水牛遺傳多樣性最高的地區(qū)是湄公河兩岸南部和印度支那北部，提出中國西南部與印度支那邊界地區(qū)是沼澤型水牛的馴化地。

本研究旨在通過分析西林水牛和富鐘水牛的mtDNA D-loop全序列，以確定西林水牛和富鐘水牛的遺傳多樣性及母系起源，為其遺傳資源保護、開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與數(shù)據(jù)來源

采集廣西的西林水牛和富鐘水牛各30個個體的耳組織樣品，用75%乙醇保存帶回實驗室，-80 ℃超低溫保存。同時，從NCBI數(shù)據(jù)庫下載25條已公布的西林水牛和富鐘水牛的mtDNA D-loop序列。

1.2 基因組DNA提取、PCR擴增與測序

采用酚-氯仿法提取基因組DNA，采用Kierstein[7]設(shè)計的引物擴增水牛mtDNA D-loop全序列。正鏈引物和反鏈引物分別為：F: 5'-TAGTGCTAATACCAACGGCC-3'; R: 5'-AGGCATTTTCAGTGCCTTGC-3'。PCR反應(yīng)體系總體積為12.5 μL，擴增程序為：95 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，65 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將PCR產(chǎn)物送西安生工生物工程有限公司進行純化與測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析方法

測序結(jié)果用Lasergene Seqman7.10軟件進行同源序列比對并進行人工校對，以確保其準(zhǔn)確性。用DNASP 5.10[8]軟件統(tǒng)計單倍型數(shù)量、單倍型多樣度、核苷酸多樣度、核苷酸多態(tài)位點等。用MEGA7.0[9]構(gòu)建水牛的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 西林水牛和富鐘水牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性

對50頭西林水牛和35頭富鐘水牛的mtDNA D-loop全序列進行分析，其mtDNA D-loop全序列由A、T、C、G四種堿基組成，其中A堿基含量最高，為31.0%，其次為T和C堿基，分別為27.7%和26.3%，G堿基含量最少(15.0%)，A+T平均含量為58.7%，G+C平均含量為41.3%，A+T平均含量明顯高于G+C平均含量，表現(xiàn)出堿基的偏好性。

50頭西林水牛的mtDNA D-loop序列的單倍型多樣度為0.909±0.028，核苷酸多樣度為0.019±0.004；35頭富鐘水牛的mtDNA D-loop單倍型多樣度為0.913±0.035，核苷酸多樣度為0.013±0.005，說明西林水牛和富鐘水牛具有豐富的遺傳多樣性。

在50頭西林水牛和35頭富鐘水牛的mtDNA D-loop全序列中，共檢測到60個多態(tài)位點，包括57個轉(zhuǎn)換和3個顛換，其中C/T轉(zhuǎn)換有32個，A/G轉(zhuǎn)換有25個。這60個多態(tài)位點共定義38種單倍型(圖1)，其單倍型多樣度為0.917±0.022，核苷酸多樣度為0.017±0.004。

2.2 西林水牛和富鐘水牛的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

以一條黃牛(登錄號：AB177796)和一條江河型水牛(登錄號：EU268883)的mtDNA D-loop序列作為外群，用MEGA7.0軟件構(gòu)建西林水牛與富鐘水牛38個mtDNA D-loop單倍型的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。從NJ系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類可以看出，這85頭水牛都為沼澤型水牛，且38個mtDNA D-loop單倍型明顯分為A、B兩大支系，A支系包括25個單倍型，代表61頭水牛，占71.76%(61/85)，B支系包括13個單倍型，代表24頭水牛，占28.24%(24/85)，說明西林水牛和富鐘水牛有A和B支系2個母系起源，但B支系的單倍型變異程度(54.17%，13/24)比A支系(40.98%，25/61)高。

圖1 富鐘與西林水牛38個mtDNA D-loop單倍型的多態(tài)位點

圖2 富鐘與西林水牛38個mtDNA D-loop單倍型的NJ樹

3 討 論

通過分析85頭富鐘與西林水牛mtDNA D-loop序列，發(fā)現(xiàn)其四種堿基A、T、G、C的含量分別為31.0%、27.7%、15.0%、26.3%，表現(xiàn)出堿基的偏好性，這是多細胞動物mtDNA D-loop序列的顯著特征[10]。A+T的平均含量為58.8%，G+C的平均含量為41.3%，顯然A+T的平均含量高于G+C的平均含量，而在山羊[11]、綿羊[12]、牦牛[13]、豬[14]、雞等[15]動物mtDNA D-loop區(qū)的研究結(jié)果也表明，mtDNA D-loop區(qū)的A+T的平均含量高于G+C的平均含量，說明動物mtDNA D-loop區(qū)的核苷酸含量在物種間有一定的相似性。本研究共檢測到60個變異位點，轉(zhuǎn)換有57個(占95%)，其中包含32個C/T 轉(zhuǎn)換，25個A/G 轉(zhuǎn)換；顛換有3個(占5%)，這一結(jié)果也符合哺乳動物 mtDNA 進化的特點[10]。單倍型多樣度和核苷酸多樣度是衡量群體遺傳變異的一個重要指標(biāo)，單倍型多樣度和核苷酸多樣度的值越大，說明群體的遺傳多樣性越豐富，反之，則說明群體的遺傳多樣性越低。前人已經(jīng)有了大量關(guān)于水牛遺傳多樣性的研究，齊國強等[16]報道中國10個沼澤水牛群體的mtDNA D-loop序列的平均單倍型多樣度為0.8952±0.0240，平均核苷酸多樣度為0.0200±0.0056，表明了中國水牛的遺傳多態(tài)性豐富。謝文美等[17]計算出中國21個水牛群體mtDNA D-loop序列的平均單倍型多樣度和核苷酸多樣度分別為0.8460±0.0240和0.01403±0.00178，張自芳等[18]通過對滇東南水牛的研究得到其單倍型多樣度為0. 815±0. 066，核苷酸多樣度為0.01134±0.00306。本研究中，50頭西林水牛的單倍型多樣度為0.909±0.028，核苷酸多樣度為0.019±0.004，35頭富鐘水牛的mtDNA D-loop區(qū)單倍型多樣度為0.913±0.035，核苷酸多樣度為0.013±0.005。與前人研究相比，西林水牛和富鐘水牛的遺傳變異均高于中國水牛的平均水平，說明西林水牛和富鐘水牛具有豐富的遺傳多樣性。本研究的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹顯示西林水牛和富鐘水牛聚為A支系和B支系，說明這兩個水牛品種有A支系和B支系兩個母系起源，與Lei等[19-20]所發(fā)現(xiàn)的中國水牛有兩個母系起源的觀點一致。西林水牛和富鐘水牛的A支系占71.76%，為主要支系，B支系占28.24%，為次要支系，但B支系的單倍型變異程度(54.17%)比A支系(40.98%)高，這與謝文美等[21]及Zhang等[6]分別對涪陵水牛和中國水牛mtDNA的研究結(jié)果一致，說明A支系水牛群體中的基因交流較B支系更頻繁。從mtDNA D-loop序列的研究結(jié)果來看，西林水牛與富鐘水牛的遺傳多樣性豐富，也沒有受到江河型水牛，如摩拉水牛和尼里拉菲水牛雜交改良的影響，且這2個品種的遺傳結(jié)構(gòu)類似，建議廣西壯族自治區(qū)畜牧相關(guān)部門選擇其中1個水牛品種進行遺傳資源保護，另1個品種可以開發(fā)利用。