錢 杰，楊 堅，張 玥，張 蓉，張湘燕，郭曉奎，

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系，上海200025；2.上?？菩律锛夹g(shù)股份有限公司，上海201203；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院-國家熱帶病研究中心全球健康學(xué)院，衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學(xué)重點實驗室，上海200025

鉤端螺旋體病是一種由致病性鉤端螺旋體（簡稱鉤體）感染而引起的人獸共患病。該疾病在我國多省市均有流行，被列為法定報告?zhèn)魅静?。其好發(fā)于雨季及洪澇災(zāi)害地區(qū)，嚙齒類動物、犬、豬等為重要傳染源［1-2］，對人畜危害較大［3］。鉤體病的主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、寒戰(zhàn)、黃疸、出血、肝脾腫大、腎功能衰竭等，與流行性感冒、病毒性出血熱、腦膜炎、登革熱、瘧疾等傳染性疾病及腎盂腎炎、化學(xué)中毒和食物中毒等非傳染性疾病相類似。目前，實驗室鉤體培養(yǎng)法和基于活的鉤體標(biāo)準菌株的顯微鏡凝集試驗（microscopic agglutination test，MAT）仍是診斷和監(jiān)測鉤體病的金標(biāo)準［2］，且國內(nèi)尚無對鉤體感染者進行鉤體抗體檢測的成品試劑盒。

鉤體外膜具有抗原性，是抗體和補體的作用部位。鉤體外膜蛋白（outer membrane proteins，OMPs）參與鉤體與宿主黏附，在引起宿主免疫和致病過程中發(fā)揮著重要作用［4］。2003—2004 年中國問號鉤體賴型賴株與巴西鉤體哥本哈根型的全基因組測序完成，共報道了數(shù)百種可能與OMPs 相關(guān)的基因［5-6］，該項工作為遴選鉤體保守的OMPs及免疫檢測靶抗原提供了可能。

本研究選擇我國主要致病性鉤體流行株的高度保守的OMP 重組蛋白作為包被抗原，經(jīng)臨床樣本測試后建立敏感性與特異性較為理想的檢測方法，并研制鉤體特異性抗體間接酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒（下文簡稱“試劑盒”），用于鉤體病患者血清中的鉤體IgG抗體的檢測，從而為鉤體病的診斷、監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查提供有利工具。

1 材料與方法

1.1 血清樣本、主要儀器及試劑

本研究檢測的血清樣本來自本實驗室血清庫，包括40 例經(jīng)MAT 測定的鉤體病患者、50 例經(jīng)MAT 測定的其他感染類疾病患者和391例健康對照者的血清樣本。

Mastercycler personal PCR 儀（Eppendorf，德國），PowerPac Universal 電泳儀（Bio-Rad，美國），5800 MALDI-TOF/TOF 串聯(lián)質(zhì)譜儀（ABI，美國），MK3 酶標(biāo)儀（Thermo，美國），Savant 冷凍干燥離心濃縮儀（Thermo，美國），SPX-808SH-Ⅱ生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），96孔酶標(biāo)板（Greiner，德國），辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗人IgG 抗體（Sigma，美國）。其他酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑均由上?？菩律锛夹g(shù)股份有限公司制備。

1.2 主要材料制備

1.2.1 包被抗原的制備與鑒定

根據(jù)前期研究［7］，鉤體OMP 重組蛋白以問號鉤體黃疸出血群賴株的基因組為模板，表達載體為Pet28b，表達菌株為E. coil BL21。用1 mmol/L IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）于22 ℃誘導(dǎo)表達16 h 后收集菌體，超聲裂解該菌體后，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測OMP 重組蛋白的表達，并采用Ni-NTA 親和層析法進行純化，最終獲得的OMP 重組蛋白即為包被抗原。將包被抗原送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行基質(zhì)輔助激光解析離子化串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜鑒定。

1.2.2 試劑盒對照品及參考品的制備及用途

（1） 陽性對照品及陽性參考品的制備及用途 從鉤體病確診患者血清中選擇經(jīng)MAT 與ELISA 檢測為鉤體抗體強陽性的血清若干份，將其混合后制備成高效價混合陽性血清。用含1% 牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液（PBST）按一定比例稀釋該陽性血清，得到試劑盒陽性對照品。該陽性對照品為試劑盒的組成成分，用于試劑盒的質(zhì)量控制。從鉤體病確診患者的血清中選擇經(jīng)MAT與ELISA檢測為鉤體抗體陽性的血清（5份）作為試劑盒陽性參考品，為實驗室內(nèi)部參考品，用于試劑盒穩(wěn)定性評估中的真陽性率（即陽性參考品在當(dāng)次檢測中被判斷為陽性的例數(shù)與陽性參考品總例數(shù)的比值）的評估。

（2） 陰性對照品及陰性參考品的制備及用途 從健康對照者血清中選擇經(jīng)MAT 和ELISA 檢測為鉤體抗體陰性的血清，用PBST 按1∶100 對陰性血清進行稀釋即為試劑盒陰性對照品。該陰性對照品為試劑盒的組成成分，用于試劑盒的質(zhì)量控制。從健康對照者血清中選擇經(jīng)MAT 和ELISA 檢測為鉤體抗體陰性的血清（5 份）作為試劑盒陰性參考品，為實驗室內(nèi)部參考品，用于試劑盒穩(wěn)定性評估中的真陰性率（即陰性參考品在當(dāng)次檢測中被判斷為陰性的例數(shù)與陰性參考品總例數(shù)的比值）的評估。

（3） 弱陽性對照品（臨界參考品）及靈敏度參考品 的 制 備 及 用 途 用PBST 按1∶6 000、1∶6 100、1∶6 200、……、1∶8 900、1∶9 000 的比例將高效價混合陽性血清進行梯度稀釋，與391 例健康對照者血清行ELISA 同批檢測。將檢測獲得的健康對照者血清的D（450 nm/630 nm）的平均值加上3倍標(biāo)準差記為臨界值（99% CI），確定檢測值與該臨界值相當(dāng)?shù)母咝r混合陽性血清的稀釋比例，而后將高效價混合陽性血清按此比例進行稀釋，制備得到弱陽性對照品（即臨界參考品）。該弱陽性對照品為試劑盒的組成成分，其檢測D（450 nm/630 nm）相當(dāng)于在血清樣本中鉤體抗體濃度為25 RU/mL（RU 為relative unit，即相對單位）。將弱陽性對照品在每次實驗中測得的D（450 nm/630 nm）作為定性檢測的臨界值，以判斷待檢血清中的抗體濃度。用PBST對弱陽性對照品進行5倍稀釋得到靈敏度參考品，該參考品為實驗室內(nèi)部參考品，用于對試劑盒的檢測限進行評估。

（4） 精密度參考品的制備及用途 從鉤體病確診患者血清中選擇強陽性、弱陽性血清各1份，分別作為強陽性、弱陽性精密度參考品。該參考品為實驗室內(nèi)部參考品，用于對試劑盒的精密度評估。

1.3 包被抗原的抗原性檢測

將包被抗原用0.05 mol/L、pH 9.6 的碳酸鹽緩沖液分別稀釋成1、2、5、10 μg/mL包被酶標(biāo)板，用陽性參考品（包括強陽性、弱陽性）和陰性參考品對包被抗原酶標(biāo)板進行檢測。

1.4 試劑盒檢測體系的建立

試劑盒的主要工藝包括酶標(biāo)板的包被、封閉、干燥等，反應(yīng)體系包括包被抗原濃度和二抗最佳比例、樣本稀釋比例、二抗孵育時間、顯色時間、反應(yīng)溫度等，試劑配方包括樣本緩沖液、二抗稀釋液、顯色底物液、終止液等。通過對該試劑盒的檢測體系進行摸索、優(yōu)化及驗證，最終選擇出試劑盒的最佳制備工藝及反應(yīng)條件。

1.5 試劑盒的性能指標(biāo)評估

1.5.1 分析性能評估 主要性能指標(biāo)包括：精密度、敏感性和特異性。精密度包括批內(nèi)精密度、批間精密度。敏感性和特異性包括分析敏感性和分析特異性、臨床樣本檢測敏感性和臨床樣本檢測特異性。具體檢測步驟如下。

（1） 精密度檢測 選擇強陽性、弱陽性精密度參考品進行精密度檢測。①批內(nèi)精密度：在同一批試劑盒的同一次檢測中重復(fù)測定上述精密度參考品各10 次，分別計算測定結(jié)果的均值（x）及標(biāo)準差（s）；通過均值/標(biāo)準差計算批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variance，CV），以評估該試劑盒的批內(nèi)精密度（批內(nèi)重復(fù)性），CV<15%即為批內(nèi)精密度良好。②批間精密度：分別在3批試劑盒中重復(fù)測定上述精密度參考品各10 次，計算測定結(jié)果的均值（x）及標(biāo)準差（s）；通過均值/標(biāo)準差計算批間CV，以評估該試劑盒的批間精密度（批間重復(fù)性），CV<20%即為批間精密度良好。

（2） 敏感性和特異性檢測 采用試劑盒對40 份鉤體病患者血清、50 份其他感染類疾病患者血清和50 份健康對照者血清進行檢測，并與MAT 檢測的結(jié)果進行比對，分析試劑盒的檢測敏感性和特異性。公式如下：

臨床樣本檢測敏感性=（鉤體病患者樣本中檢測為陽性的樣本數(shù)/鉤體病患者的樣本總數(shù)）×100%；

臨床樣本檢測特異性=（其他感染類疾病患者和健康對照者中檢測為陰性的樣本數(shù)/其他感染類疾病患者和健康對照者的樣本總數(shù)）×100%；

分析敏感性=（鉤體病患者樣本中由MAT 與試劑盒共同檢測為陽性的樣本數(shù)/MAT 檢測為陽性的樣本數(shù)）×100%；

分析特異性=（其他感染類疾病患者和健康對照者中由MAT 與試劑盒共同檢測為陰性的樣本數(shù)/MAT 檢測為陰性的樣本數(shù)）×100%。

符合率=（共同檢測為陽性的樣本數(shù)+共同檢測為陰性的樣本數(shù)/總樣本數(shù)）×100%。

1.5.2 穩(wěn)定性評估 評估試劑盒在實際儲存條件下（2～8 ℃）和加速條件下［（37±1）℃］的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性），主要評估的技術(shù)指標(biāo)包括陰性、弱陽性、陽性對照品D（450 nm/630 nm），陰性、陽性參考品的真陰性率和真陽性率，靈敏度參考品D（450 nm/630 nm）及試劑盒的批內(nèi)精密度。試劑盒需同時滿足以下4項即被認定是穩(wěn)定的：①陽性對照品D 值/陰性對照品D 值≥4.0，弱陽性對照品D 值/陰性對照品D 值≥2.0。②陽性參考品的真陽性率和陰性參考品的真陰性率均達到100%。③靈敏度參考品D值≥0.100。④試劑盒批內(nèi)CV<15%。

對3批試劑盒行實際儲存條件下的穩(wěn)定性評估，即每批試劑盒在2～8 ℃條件下分別存放0、6、9、12、14、18個月后對上述各項技術(shù)指標(biāo)進行檢測。其中，批內(nèi)CV的測定方法為：選擇3份精密度參考品（即強陽性、陽性和弱陽性各1 份）作為測定樣本，用每1 批試劑盒對該3 份精密度參考品分別重復(fù)測定10 次。計算測定結(jié)果D（450 nm/630 nm）的均值及標(biāo)準差，求出CV。

對其中1批試劑盒進行加速條件下的穩(wěn)定性評估，即ELISA 試劑盒有效期（即穩(wěn)定性）的最低要求為2～8 ℃下穩(wěn)定12 個月。將試劑盒置于（37±1）℃條件下，設(shè)定在加速6 d 后對上述各項技術(shù)指標(biāo)進行測試，合格后繼續(xù)加速測試。比較分析加速實驗前（37 ℃）及加速6、7、8 d 后試劑盒的上述各項技術(shù)指標(biāo)，具體方法同試劑盒在實際儲存條件下的穩(wěn)定性評估。

同時，對3批試劑盒開封后的穩(wěn)定性進行研究，即于2～8 ℃條件下開封后6 個月，對其各項技術(shù)指標(biāo)進行分析，方法同試劑盒在實際儲存條件下的穩(wěn)定性評估。

2 結(jié)果

2.1 包被抗原的鑒定

經(jīng)SDS-PAGE 檢測，包被抗原相對分子質(zhì)量為31 000，符合預(yù)期。包被抗原經(jīng)質(zhì)譜鑒定顯示其為一種OMP（圖1）；將質(zhì)譜分析得到的氨基酸序列和NCBI 數(shù)據(jù)庫中的蛋白序列進行比對，結(jié)果顯示測得的氨基酸序列同目的蛋白序列一致，符合率為100%。

圖1 包被抗原的串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig 1 Tandem mass spectrum of coated antigen

2.2 臨界值的確定與臨界參考品的制備

對391例健康對照者的血清檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析，結(jié)果（圖2）顯示，檢測D（450 nm/630 nm）平均值為0.121、標(biāo)準差為0.040 3。經(jīng)計算其臨界值為0.241 9，與稀釋比例為1∶8 100的高效價混合陽性血清的檢測值相當(dāng)。因此，將高效價混合陽性血清按此比例稀釋，即得到臨界參考品。

圖2 ELISA檢測391例健康對照者血清的D（450 nm/630 nm)分布Fig 2 Distribution of D(450 nm/630 nm)detected with 391 healthy serum controls by ELISA

2.3 包被抗原的抗原性檢測分析

將純化后的重組OMP 作為包被抗原，陽性參考品和陰性參考品的檢測結(jié)果為弱陽性參考品檢測D（450 nm/630 nm） 值大于0.3、強陽性參考品檢測D （450 nm/630 nm） 值大于1.0、陰性參考品檢測D （450 nm/630 nm）值小于0.2，表明該蛋白作為包被抗原具有較強的抗原性（靈敏度）和較低的陰性參考品檢測值（特異性），且從4 種包被濃度的檢測結(jié)果來看1 μg/mL 的包被濃度已可明顯區(qū)分陽性參考品（包括強陽性、弱陽性）和陰性參考品（表1）。

表1 包被抗原的抗原性檢測Tab 1 Detection of antigenicity of the coating antigen

2.4 試劑盒檢測體系的建立

本研究經(jīng)過摸索、驗證及優(yōu)化，檢測體系建立如下：以0.05 mol/L、pH 9.6 的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，稀釋包被抗原為2μg/mL，并于2～8 ℃包被酶標(biāo)板18 h 以上。用PBST 作為封閉液，于37 ℃下封閉2 h。用含1%牛血清白蛋白、0.05%吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液將待檢血清按1∶101 稀釋后加入酶標(biāo)板中（100 μL/孔），37 ℃下溫育30 min，洗板3 遍后拍干；加100 μL 二抗，37 ℃下溫育30 min，洗板4 遍后拍干；加100μL 底物和50μL 顯色劑，37 ℃下溫育30 min，加50 μL 終止液。而后，分別于450 nm和630 nm波長下讀取D值。

表2 試劑盒的批內(nèi)精密度及批間精密度檢測結(jié)果Tab 2 Results of intra and inter batch precision test of the kit

2.5 試劑盒的批內(nèi)精密度和批間精密度的檢測分析

采用精密度參考品對試劑盒進行精密度分析，結(jié)果（表2）顯示，精密度參考品的批內(nèi)CV均小于15%，即試劑盒的批內(nèi)精密度較好；精密度參考品的批間CV 均小于20%，即試劑盒的批間精密度亦較好。

2.6 試劑盒的敏感性和特異性的檢測分析

采用試劑盒對40 份鉤體病患者血清、50 份其他感染類疾病患者血清、50 份健康對照者血清進行檢測，并于MAT 檢測的結(jié)果進行比對。結(jié)果顯示，試劑盒的臨床樣本檢測敏感性為95.0%、臨床樣本檢測特異性為95.0%；經(jīng)統(tǒng)計分析，試劑盒的分析敏感性為91.1%、分析特異性為97.9%、符合率為95.7%。具體數(shù)據(jù)見表3、4。

表3 試劑盒檢測鉤體病患者、其他感染類疾病患者及健康對照者的血清樣本的結(jié)果Tab 3 Results of serum samples from patients with leptospirosis，patients with other infectious diseases and healthy controls detected by the kit

表4 試劑盒檢測結(jié)果與MAT檢測結(jié)果的比較（N=140）Tab 4 Comparison of kit test results and MAT test results（N=140）

2.7 實際儲存條件下試劑盒的穩(wěn)定性評估

基于穩(wěn)定性評估中各個檢測時間點的數(shù)據(jù)較多，且ELISA試劑盒有效期的一般要求為2～8 ℃下穩(wěn)定12個月，因此本研究僅針對2～8 ℃條件下存放12個月后的試劑盒穩(wěn)定性數(shù)據(jù)進行展示。對每批試劑盒的多個技術(shù)指標(biāo)進行評估，結(jié)果顯示，3批試劑盒的陰、陽性對照品D（450 nm/630 nm）（表5）、陽性參考品的真陽性率、陰性參考品的真陰性率（表6）及靈敏度參考品D（450 nm/630 nm）（分別為0.121、0.123和0.110）、批內(nèi)CV（表7）均符合要求；繼而表明，在上述條件下該試劑盒的穩(wěn)定性良好。

表5 2～8 ℃條件下存放12個月后3批試劑盒檢測陽性、陰性對照品的結(jié)果Tab 5 Results of positive and negative internal control detected by three batches of the kit after storage for 12 months at 2-8 ℃

在2～8 ℃條件下對存放14 個月后的試劑盒穩(wěn)定性進行檢測，結(jié)果顯示其各項技術(shù)指標(biāo)仍較好（數(shù)據(jù)略）；而存放18 個月后，3 批試劑盒對弱陽性精密度參考品檢測的批內(nèi)CV 均超過15%（分別為15.2%、18.1%和17.9%），即批內(nèi)精密度不符合要求（數(shù)據(jù)略）。

2.8 加速穩(wěn)定條件下試劑盒的穩(wěn)定性評估

加速條件下對試劑盒的穩(wěn)定性進行測評，結(jié)果（表8）顯示加速6 d后試劑盒的陽性對照品D（450 nm/630 nm）/陰性對照品D（450 nm/630 nm）=10.42、弱陽性對照品D（450 nm/630 nm）/陰性對照品D（450 nm/630 nm）=3.15，陽性參考品的真陽性率和陰性參考品的真陰性率均為100%，靈敏度參考品D（450 nm/630 nm）不小于0.1，均符合試劑盒穩(wěn)定性要求。

37 ℃加速6、7 d 后，采用3 份精密度參考品（強陽性、陽性和弱陽性）檢測試劑盒的精密度，顯示試劑盒的批內(nèi)CV 均低于15%；而加速8 d 后試劑盒對弱陽性精密度參考品的批內(nèi)CV為18.7%，即為不合格（表9）。

表6 2～8 ℃下存放12個月后3批試劑盒檢測陰性、陽性參考品的結(jié)果及判斷Tab 6 Results and evaluation of the coincidence rate of negative and positive reference for internal control detected by three batches of the kits after storage for 12 months at 2-8 ℃

Kit batch Precision reference for internal control of the kit Intra batch precision Average D（450 nm/630 nm）SD CV/%The first batch The second batch The third batch Weak positive precision reference Positive precision reference Strong positive precision reference Weak positive precision reference Positive precision reference Strong positive precision reference Weak positive precision reference Positive precision reference Strong positive precision reference 0.255 0.731 1.317 0.238 0.695 1.183 0.265 0.753 1.366 0.025 0.047 0.050 0.026 0.050 0.065 0.027 0.058 0.088 9.79 6.47 3.77 11.08 7.18 5.47 10.08 7.74 6.46

表7 2～8 ℃下存放12個月后3批試劑盒的批內(nèi)精密度檢測結(jié)果Tab 7 Intra batch precision results of three batches of the kits after storage for 12 months at 2-8 ℃

表8 加速實驗前、后試劑盒檢測陰性、陽性參考品的結(jié)果及判斷Tab 8 Results and evaluation of negative and positive reference for internal control detected by kit before and after accelerated experiment

表9 加速6～8 d后試劑盒的批內(nèi)精密度檢測結(jié)果Tab 9 Intra batch precision results of the kit 6-8 d after accelerated experiment

2.9 試劑盒開封后的穩(wěn)定性檢測

將試劑盒開封后于2～8 ℃條件下存放6個月，并對其穩(wěn)定性進行檢測。結(jié)果顯示，試劑盒的陽性對照品D（450 nm/630 nm）/陰性對照品D（450 nm/630 nm）、弱陽性對照品D（450 nm/630 nm）/陰性對照品D（450 nm/630 nm）、陽性參考品的真陽性率、陰性參考品的真陰性率、靈敏度參考品D（450 nm/630 nm）、批內(nèi)精密度均符合要求合格，即在開封后6個月試劑盒依然有效。具體數(shù)據(jù)略。

3 討論

目前，國外已有將鉤體保守的OMPs用于鉤體感染患者行血清抗體檢測［8］、將提純的鉤體抗原用于感染犬的血清學(xué)抗體檢測［9］等的相關(guān)研究，但上述研究并未在臨床上廣泛應(yīng)用；而在國內(nèi)，類似上述研究仍處于起步階段［10-11］。研究［12-13］顯示，針對血清樣本中的鉤體特異性核酸常采用PCR 進行檢測，但該方法對儀器設(shè)備、樣本預(yù)處理的要求較高，且檢測時間較長。截至目前，鉤體培養(yǎng)法和MAT仍是診斷和監(jiān)測鉤體病的金標(biāo)準［3，14］。其中，鉤體培養(yǎng)法需在生物安全實驗室中，對鉤體活菌培養(yǎng)2 周以上［1］；MAT 則需將活的鉤體標(biāo)準株與感染者血清進行孵育培養(yǎng)，且需在暗視野顯微鏡下長時間觀察［15］。因此，該2 種方法均無法對人群行大規(guī)模的快速篩查，亦無法對鉤體病行早期診斷。

近期，本研究對國家藥品監(jiān)督管理局的醫(yī)療器械數(shù)據(jù)庫進行檢索后發(fā)現(xiàn)，目前國內(nèi)尚無已獲得醫(yī)療器械注冊許可證的鉤體感染診斷試劑應(yīng)用于醫(yī)療機構(gòu)的鉤體感染檢測。在國外，鉤體感染商品化檢測試劑盒主要有Lepto-LAT、Lepto Rapid Test、Lepto Dri Dot Test，而上述試劑盒均未在國內(nèi)上市。

目前，國外實驗室較常采用ELISA 對鉤體患者血清的特異性抗體進行檢測，但由于檢測使用的鉤體抗原存在地區(qū)流行差異，國外ELISA 試劑盒對我國的鉤體感染檢測效果并不理想。在本研究中，我們選擇國內(nèi)鉤體流行株中高度保守的OMPs［7］的重組蛋白作為包被抗原，并采用間接ELISA 檢測鉤體感染者血清樣本中的IgG 抗體。結(jié)果顯示，我們研制的鉤體特異性抗體間接ELISA檢測試劑盒的物理性狀、陰性符合率、陽性符合率、靈敏度、精密性、穩(wěn)定性等的技術(shù)指標(biāo)表現(xiàn)良好，符合定性檢測試劑盒的技術(shù)要求；穩(wěn)定性測試結(jié)果表明，3批試劑盒的穩(wěn)定性均達到12 個月以上。同時，該試劑盒的檢測結(jié)果準確、可靠，能夠在2～3 h 內(nèi)完成對上百份樣本的檢測，操作快速、簡便，因此其可適用于國內(nèi)臨床檢驗科室、臨床實驗室及疾控中心等的鉤體病輔助診斷、鉤體病防控哨點監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查。

參·考·文·獻

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