顧琦晟，張米粒，曹 燦，李繼坤

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院普外科，上海201620

胃癌是常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)2018 年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，胃癌新發(fā)病例超過100 萬例，估計死亡病例783 000 例；在所有癌癥類型中，胃癌的發(fā)病率（5.7%）和病死率（8.2%）分別居第五位和第三位［1］。雖然胃癌的早期診斷和整體治療水平不斷提高，但是進展期胃癌的療效仍不盡如人意。近年來，除了傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療，腫瘤免疫治療也展現(xiàn)出了無限潛力。以程序性死亡蛋白1（programmed death-1，PD-1）單抗為首的腫瘤免疫檢查點抑制劑對黑色素瘤、血液系統(tǒng)腫瘤等非實體腫瘤顯示出了極高的臨床治療活性［2-3］；但是，對進展期胃癌的治療效果較差，這與胃癌免疫逃避的潛在機制有著密切關(guān)系［4］。因此，研究胃癌的免疫逃避機制，找到增強胃癌免疫原性的方法，是現(xiàn)今進展期胃癌免疫治療方面亟待解決的一個問題。

可變剪接又稱為選擇性剪接，是一項精密、復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制，是基因的mRNA 前體轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的RNA 外顯子以多種方式通過RNA 剪切進行重連的過程；從而，單個mRNA 可產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)構(gòu)體，是增加mRNA 復(fù)雜性和蛋白質(zhì)多樣性的原因之一［5］。研究［6-7］發(fā)現(xiàn)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，伴隨著基因的可變剪接異常產(chǎn)生，其中不乏許多已經(jīng)證實的癌基因和抑癌基因的變化，并進一步推進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

目前，有關(guān)胃癌可變剪接和腫瘤免疫浸潤的關(guān)系尚待深入研究。本研究旨在利用生物信息學(xué)方法，探討胃癌中的可變剪接情況，及其與胃癌表型、臨床病理學(xué)因素以及腫瘤免疫浸潤的關(guān)系，為胃癌的免疫治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

在TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫中下載375 例胃癌患者及32 例配對癌旁正常組織的轉(zhuǎn)錄組、基因組數(shù)據(jù)和所有納入研究的胃癌患者的臨床信息。在SpliceSeq 數(shù)據(jù)庫中下載與TCGA 的胃癌樣本相對應(yīng)的樣本剪接百分比（percent-spliced in，PSI）矩陣，納入具有PSI 值的樣本占比<75%的剪接事件，共包含48 141 個剪接事件以及415 例胃癌組織和37 例配對癌旁正常組織樣本， 以 備 后 續(xù) 分 析［8］。 在GEO （Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫中下載包含192 例胃癌患者轉(zhuǎn)錄組芯片數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)集GSE15459［9］。

1.2 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計學(xué)處理

1.2.1 胃癌樣本可變剪接數(shù)據(jù)的主成分分析 利用missMDA 包，基 于EM-PCA （Expectation Maximization Algorithm for Principal Component Analysis）算法對參數(shù)求極大似然估計（Maximum Likelihood Estimate，MLE），對缺失數(shù)據(jù)進行插補［10］。利用FactoMineR 包對數(shù)據(jù)進行PCA 降維分析，利用ggbiplot 和factoextra 包對PCA 數(shù)據(jù)進行可視化［11］。

1.2.2 利用一致性聚類方法對胃癌樣本的可變剪接進行無監(jiān)督聚類 利用ConsensusClusterPlus包的一致性聚類方法對PSI矩陣進行k-中心點聚類（k-medoid），聚類值k取2～10，根據(jù)聚類效果選擇具有較高聚類穩(wěn)定性的k值［12］。

1.2.3 基因集通路富集分析 使用limma 包的競爭性基因集測試算法（Competitive Gene Set Test Accounting for Inter-gene Correlation，CAMERA），以分子特征數(shù)據(jù)庫（Molecular Signatures Database，MsigDB）的Hallmark 基因集為功能基因集，分析相關(guān)樣本集與其他樣本的差異，分析與該樣本集密切相關(guān)的通路［13-14］。錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。利用GSVA 包的基因集變異分析（Gene Set Variation Analysis，GSVA）方法，將基因在不同樣品間的表達水平矩陣轉(zhuǎn)化為基因集在樣品間的表達水平矩陣，從而分析該基因集表達水平在各個樣本間的差異［15］。

1.2.4 可變剪接相關(guān)基因的篩選 對404 個經(jīng)實驗確認(rèn)的剪接相關(guān)因子與胃癌可變剪接事件變化的關(guān)系進行研究［16］。根據(jù)基因的表達水平，以中位數(shù)為界，分為高表達組和低表達組，利用limma 包進行剪接事件的差異分析。以logFC>0.3 且BH 法修正后P 值<0.05 的差異可變剪接事件作為潛在受剪接因子表達水平影響的事件，篩選影響超過20%總剪接事件且相對mRNA 平均表達水平>4的基因，作為胃癌中潛在調(diào)控可變剪接的剪接因子。

1.2.5 與胃癌免疫微環(huán)境浸潤的關(guān)系分析 利用CIBERSORT 方法和LM22 免疫細(xì)胞特征矩陣，對胃癌免疫細(xì)胞浸潤豐度情況進行反卷積分析［17］。從美國國家腫瘤研究所基因數(shù)據(jù)庫（National Cancer Institute Genomic Data Commons）獲取TCGA 胃癌樣本的腫瘤免疫相關(guān)特征數(shù)據(jù)［18］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用R 3.6.2 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。定性資料的比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗；定量資料以±s 表示，采用ANOVA檢驗進行比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌可變剪接的整體情況

提取SpliceSeq 的初始矩陣，內(nèi)含48 141 個剪接事件和452 例樣本。制定嚴(yán)格的過濾標(biāo)準(zhǔn)，將有效值占比>90%且PSI 標(biāo)準(zhǔn)差>0.1 的事件納入后續(xù)研究，同時排除有效值占比<80%的樣本7 例（圖1A、1B）。經(jīng)過濾，獲得8 649 個剪接事件和445 例樣本，其中腫瘤樣本409 例，癌旁正常組織樣本36例。

通過觀察4 051 個基因和相關(guān)8 649 個剪接事件的大體分布情況，發(fā)現(xiàn)平均每個mRNA 具有超過2 種不同形式的剪接變化，其中外顯子跳躍（exon skipping，ES）、可變初始外顯子（alternate promoter，AP）和可變終末外顯子（alternate terminator，AT）是胃癌中最常見的剪接類型，5′端和3′端可變剪接、內(nèi)含子保留事件相對較少，互斥外顯子事件最少（圖1C、1D）。

圖1 TCGA中胃癌可變剪切概況Fig 1 Overview of alternative splicing of gastric cancer in TCGA

2.2 胃癌的可變剪接和主成分分析及聚類分析

使用EM-PCA 算法對剪接事件進行缺失值插補后，通過主成分分析降維。利用碎石圖展示剪接事件的主成分對剪接全景的貢獻度，其中PC1（主成分1）作為最重要的主成分，解釋了剪接全景10.7%的方差值（圖2A）。通過PCA 圖發(fā)現(xiàn)PC1 可以明顯區(qū)別腫瘤組織與癌旁正常組織（Wilcox test，P<0.01），提示腫瘤與癌旁正常組織中存在許多有顯著差異的剪接事件（圖2B、2C）。

利用ConsensusClusterPlus 包對剪接事件矩陣進行無監(jiān)督聚類（圖3A、3B）。基于一致性矩陣和Delta 區(qū)域結(jié)果，認(rèn)為k=4時穩(wěn)定性較佳，且能夠減少過擬合效應(yīng)。聚類簇C3、C1、C2+C4 在PC1 水平明顯區(qū)分，而C2 和C4在PC2 水平區(qū)分（圖3C）。C3 與癌旁正常組織的分布距離較大，提示該聚類簇包含的樣本具有較為顯著的腫瘤相關(guān)異常剪接發(fā)生。

如表1所示，通過比較4個亞組之間患者年齡、TMN分期、病理分期、組織學(xué)分期、Lauren 分型、性別、種族等臨床特征，發(fā)現(xiàn)可變剪接的亞型與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期、性別無關(guān)，而與其他臨床特征有較大的關(guān)系。其中C3 型患者平均患病年齡偏大、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移可能更高、美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）分期相對較差；而C4 型患者患病年齡較小，腫瘤浸潤相對更深，多表現(xiàn)為彌漫性胃癌，組織學(xué)多表現(xiàn)為G3低分化。

圖2 通過PCA對可變剪接事件進行降維分析Fig 2 Dimensional reduction analysis of alternative splicing events by using PCA

圖3 根據(jù)可變剪接事件對胃癌樣本進行一致性聚類分析Fig 3 Consensus clustering of gastric cancer samples based on alternative splicing events

表1 基于可變剪接分類的4種亞型胃癌患者的臨床資料比較Tab1 Comparison of clinical information of patients among the 4 subtypes of gastric cancer based on alternative splicing classification

2.3 胃癌的可變剪接亞型與腫瘤標(biāo)志特征和免疫微環(huán)境的關(guān)系

對4種可變剪接亞型基于包含50個主要生物活動類型的MSigDB 的標(biāo)志基因集（Hallmark Gene Set）分別進行CAMERA分析，結(jié)果顯示C1型的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）通路顯著下調(diào)；C2型的EMT通路相對上調(diào)；C3型蛋白分泌通路相對上調(diào)；C4型的細(xì)胞周期相關(guān)E2F目標(biāo)基因顯著下調(diào)。該結(jié)果提示4種亞型的腫瘤生物學(xué)特性各不相同，C1型腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力相對較弱，而C4型腫瘤的增殖速度較其他類型更慢（圖4）。

如圖5所示，結(jié)合TCGA泛癌免疫全景研究結(jié)果，探索了可變剪接亞型和一些腫瘤特征的關(guān)系。結(jié)果顯示，C2 型與C4 型的基質(zhì)比率、淋巴細(xì)胞比率和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）應(yīng)答的特征較強；C1型的巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)水平較低；C3型的腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating leukocyte，TIL）區(qū)域比例較低；C4 型的增殖、創(chuàng)傷修復(fù)、突變水平較低，而淋巴細(xì)胞浸潤等相對較高。

圖4 標(biāo)志基因集在4個可變剪接亞型中的最顯著相關(guān)通路Fig.The most significantly related pathways of hallmark gene set in the 4 subtypes based on splicing events

基于22 種免疫細(xì)胞的簽名矩陣，利用CIBERSORT對TCGA 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行反卷積，得到胃癌組織各免疫細(xì)胞組分的比例，并通過歸一化去除腫瘤純度帶來的影響，比較各個亞型間免疫細(xì)胞組分的差異。如圖6 所示，可變剪接亞型間的腫瘤微環(huán)境組分差異明顯。C1 型的M2 型巨噬細(xì)胞豐度較低；C3 型的自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞幾乎完全處于靜息狀態(tài)，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞豐度極低，T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）香農(nóng)指數(shù)較低，而有相對高水平的活化記憶性T 細(xì)胞和M2 型巨噬細(xì)胞；C4 型活化NK 細(xì)胞、肥大細(xì)胞豐度較高，TCR 香農(nóng)指數(shù)相對最高。

2.4 胃癌的可變剪接情況與剪接因子表達水平的關(guān)聯(lián)

如圖7A 所示，對胃癌的剪接因子mRNA 表達數(shù)據(jù)進行了PCA 降維，發(fā)現(xiàn)胃癌的4 個亞型聚集效果良好，提示剪接因子的表達水平變化是影響可變剪接事件發(fā)生的主要因素。如圖7B 所示，絕大多數(shù)剪接因子的高表達與PC1水平的降低相關(guān)，而CELF2、QKI、RBMS1等基因的表達模式和其他剪接因子相反，一定程度上起到拮抗異?？勺兗艚邮录l(fā)生的作用。

圖5 可變剪接亞型與腫瘤特征的關(guān)系Fig.Association of subtypes based on splicing events and tumor characteristics

圖6 可變剪接亞型與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系Fig.Association of subtypes based on splicing events and tumor microenvironment

圖7 通過PCA分析可變剪接亞型與剪接因子的關(guān)系Fig 7 Association of subtypes based on splicing events and splicing factors using PCA

通過差異基因分析對剪接因子進行研究，篩選log2FC>1 且FDR<0.05 的差異表達剪接因子。結(jié)果顯示C1 型與RBM25、SREK1 的上調(diào)關(guān)系密切，且受到眾多剪接因子的共同影響；C2 型與RAVER1、RBM42、ALYREF等基因上調(diào)相關(guān)；C3 型與TIA1、DDX39B、PAXBP1 等基因高表達相關(guān)；C4 型與QKI、CELF2、RBMS1 等基因的高表達相關(guān)（圖8）。

2.5 胃癌的剪接因子表達水平與腫瘤抗原提呈水平的關(guān)系

選擇圖8中陳列的所有剪接因子基因作為樣本的剪接因子簽名。此外，PSMB5、PSMB6、PSMB7、PSMB8、PSMB9、 PSMB10、 TAP1、 TAP2、 ERAP1、 ERAP2、CANX、CALR、PDIA3、TAPBP、B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C 共18 個基因是明確的抗原提呈細(xì)胞相關(guān)基因，采用其作為基因集分析胃癌樣本的抗原提呈水平［19］。

圖8 可變剪接亞型與主要剪接因子中位值表達水平的歸一化后熱圖Fig 8 Median normalized expression level of splicing factors in the 4 subtypes based on splicing events

利用上述剪接因子基因集和抗原提呈相關(guān)基因集，采用GSVA 分別對樣本進行評分，隨后進行相關(guān)性分析，以Pearson 相關(guān)系數(shù)表示其相關(guān)性。結(jié)果顯示（圖9）：剪接因子基因集和抗原提呈相關(guān)基因具有明顯的相關(guān)性（Pearson R=0.44，P = 0.000）。利用GEO 數(shù)據(jù)庫中包含192 例胃癌轉(zhuǎn)錄組芯片數(shù)據(jù)的隊列GSE15459 進行驗證，結(jié)果與TCGA 胃癌數(shù)據(jù)一致，提示剪接因子家族的表達對腫瘤的抗原提呈過程有重要的潛在作用。

圖9 胃癌剪接因子基因表達特征與抗原提呈基因表達特征的關(guān)系Fig 9 Scatter plots of gene expression signatures between antigen presentation and splicing factors

3 討論

可變剪接過程在正常機體中受到嚴(yán)密的調(diào)控，剪接網(wǎng)絡(luò)在機體中有可靠的魯棒性。而在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中，隨著腫瘤的基因組不穩(wěn)定等內(nèi)在環(huán)境壓力和免疫微環(huán)境等改變帶來的外在環(huán)境壓力的產(chǎn)生，腫瘤細(xì)胞利用可變剪接這一重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)水平變化調(diào)整自身的活性和功能，從而起到增強自身增殖信號、促進侵襲轉(zhuǎn)移、逃避免疫監(jiān)視等作用［20］。然而，目前有關(guān)可變剪接與胃癌腫瘤免疫相關(guān)的研究較為有限，值得進一步深入研究。

本研究利用剪接事件矩陣對TCGA 數(shù)據(jù)庫的胃癌可變剪接事件全景進行了分析。結(jié)果顯示，腫瘤與癌旁正常組織有顯著的剪接差異。利用ConsensusClusterPlus 包對剪接事件矩陣進行無監(jiān)督聚類，將所有樣本分為4個亞型，可以認(rèn)為C3 型在剪接事件水平上的異型性最強，C1型次之，C2型和C4型與癌旁正常組織最為相近。通過分析4 個亞型的臨床特征，發(fā)現(xiàn)C3 型和C4 型的特征最明顯：C3 型的病理分期較差，相對容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；C4型組織學(xué)表現(xiàn)為低分化，多為彌漫性胃癌。

基于Dunn 等的免疫編輯（immunoediting）學(xué)說，本研究中的腫瘤組織多處于免疫平衡（immune equilibrium）或免疫逃避（immune escape）階段［21］。胃癌的發(fā)生、發(fā)展與慢性炎癥密切相關(guān)，腫瘤多已能夠免疫耐受。本研究發(fā)現(xiàn)4 個亞型的免疫逃避機制較為不同，C1 型與C2 型的抗原提呈水平較高，但C1 型的髓系細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤程度都較低，而C2 型中M2 型巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞等免疫抑制細(xì)胞的高豐度可能誘導(dǎo)了T 細(xì)胞無能，使得高豐度的CD8+T 細(xì)胞無法完成腫瘤殺傷的功能。C3 型和C4 型的抗原提呈水平較低，在C3 型中與較低的TCR多樣性相關(guān)，而C4 型與基因組穩(wěn)定、體細(xì)胞突變較少有關(guān)?？傮w上，4 個亞型潛在的免疫逃避機制分別為：C1型與低免疫浸潤水平相關(guān)；C2型與高免疫抑制環(huán)境相關(guān)；C3 型表現(xiàn)為低抗原提呈水平；C4 型的腫瘤免疫原性較低。

此外，剪接因子對于可變剪接的分型起到了主導(dǎo)作用。C2 型和C3 型腫瘤的主要剪接因子簇的表達明顯互斥。Mayeda等［22］證明了C3型剪接因子SRSF2和C2型剪接因子hnRNPA1 的拮抗關(guān)系，與本研究的結(jié)論相符。C1型的上述2 個剪接因子簇表達較為均衡，而C4 型主要以QKI、MBNL1、CELF2、RBFOX2 等 基 因 為 主。有 研究［23］發(fā)現(xiàn)MBNL1 和RBFOX2 的下調(diào)影響了體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞過程中的剪接變化。另有研究［24］表明CELF2 通過在T 細(xì)胞激活過程中減少內(nèi)含子保留事件，促進T 細(xì)胞分化和細(xì)胞因子產(chǎn)生。QKI 是重要的調(diào)控circRNA 生成的剪接因子［25］。有研究［26］顯示，QKI因子的下調(diào)與胃癌的預(yù)后有顯著關(guān)聯(lián)。根據(jù)剪接因子表達和抗原提呈的關(guān)系，我們推測C2 主導(dǎo)型剪接因子簇更容易引起異常剪接體的產(chǎn)生，而C3和C4主導(dǎo)型剪接因子簇通過無義介導(dǎo)的mRNA 降解等方式起到抑制異常剪接體通過翻譯發(fā)揮蛋白功能的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)可變剪接事件的全局變化與胃癌的腫瘤生物學(xué)特性密切相關(guān)，且與腫瘤微環(huán)境的變化有潛在關(guān)聯(lián)。主要剪接因子的表達模式?jīng)Q定了可變剪接事件全局模式，且對于腫瘤的抗原提呈過程有著潛在的重要作用，對患者免疫治療的適用性起到了提示作用。同時，剪接因子網(wǎng)絡(luò)在胃癌中通過可變剪接調(diào)控適應(yīng)和影響腫瘤免疫微環(huán)境的具體機制尚不明確，有待進一步研究。

參·考·文·獻

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