魏建行，梁 荃，黃仕瓊，李利華

（大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科，云南大理 671000）

血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）是動脈血管膜的主要細胞成分，通過收縮和舒張血管調(diào)節(jié)血管張力和直徑從而調(diào)節(jié)血壓〔1〕。VSMC的增殖及遷移能力增加，氧化應(yīng)激水平增加等均在動脈硬化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。VSMC具有很強的可塑性，能夠?qū)?yīng)激信號進行應(yīng)答及表型調(diào)節(jié)。VSMC的表型調(diào)節(jié)通常是由炎癥和損傷觸發(fā)，如細胞因子和生長因子可以誘導(dǎo)VSMC增殖和遷移，這些因子包括血小板源生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子和腫瘤壞死因子等〔2〕。高血壓、動脈粥樣硬化及血管成形術(shù)后再狹窄等都與血管平滑肌細胞表型調(diào)節(jié)有關(guān)，主要表現(xiàn)為從收縮型到分泌型的轉(zhuǎn)變以及增殖和遷移能力增加等〔3〕。

Klotho是重要的抗衰老蛋白，隨著年齡增加表達減少，從而可能在動脈硬化以及高血壓、冠心病等發(fā)病中起重要作用〔4〕。已有研究表明，Klotho通過抑制胰島素∕類胰島素生長因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（trans?forming growth factor-β1，TGF-β1）信號通路參與氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化的調(diào)節(jié)〔5〕。然而，國內(nèi)外對于Klotho表達減少參與動脈硬化的具體機制尚不清楚。本研究用慢病毒干擾Klotho在人主動脈血管平滑肌細胞（human aortic vascular smooth muscle cell，HA-VSMC）中的表達，旨在探討Klotho低表達對HA-VSMC的增殖、遷移以及氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HA-VSMC（北納生物，批號：BNCC338715）；慢病毒（上海吉瑪基因）；PCR引物（上海生工生物工程）；Klotho抗體（Abcam公司，批號：EPR6856）；CCK-8試劑盒（美侖生物，批號：MA0218-500T）；Transwell嵌套小室（Corning公司，批號：3422）；超氧化物歧化酶（SOD，南京建成生物工程研究所，批號：A001-3-2）；丙二醛（MDA，北京索萊寶科技有限公司，批號：A003-2）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)及慢病毒轉(zhuǎn)染 用含有15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HA-VSMC。用慢病毒shRNA干擾Klotho的表達。Klotho-2073 shR?NA（shKlotho-2073）靶點序列為5'-GAGCCGTATA?CAAGGAATATG-3'；Klotho-1021 shRNA（shKlotho-1021）靶點序列為5'-CCGAGAGCATGAAGAATA?ACC-3'；Klotho-1207 shRNA（shKlotho-1207）靶 點序列為5'-GGATTGACCTTGAATTTAACC-3'；陰性對照shRNA-NC（shNC）靶點序列為5'-TTCTCC?GAACGTGTCACGT-3'。以3×105個∕孔的細胞密度鋪板，慢病毒同時加入1μg∕mL的聚凝胺（polybrene）72 h后，篩選出當MOI=20時干擾效率最強，棄毒液用于實驗。

1.2.2 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）提取RNA，測定濃度并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進行熒光定量PCR擴增，并檢測Klotho、NOX1、NOX2、NOX3、NOX5以及DUOX2 mRNA的相對表達量，以2-ΔΔCt值表示?；蛞镄蛄幸姳?。

表1 基因引物信息

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測Klotho蛋白的表達 使用慢病毒轉(zhuǎn)染HA-VSMC 72 h后，提取并測定總蛋白濃度，進行凝膠電泳分離，采用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，在5%脫脂牛奶封閉液中室溫搖床上封閉1 h后，加入抗Tubulin（1：500）、Klotho（1：1 000）一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次（15 min∕次）后，加入相應(yīng)二抗（1：10 000），搖床室溫孵育2 h。TBST再洗膜3次（15 min∕次），加入Pro-light HRP化學(xué)發(fā)光檢測試劑，使用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)顯影，使用Image-pro plus灰度值分析。以Tubulin為內(nèi)參計算Klotho蛋白水平的相對表達量。

1.2.4 CCK-8檢測細胞增殖 將HA-VSMC以4×103個∕孔的細胞密度接種于96孔板，每個樣本設(shè)5個復(fù)孔，另設(shè)空白對照孔；分別于0 d（第2天細胞貼壁后）、1、2、3、4、5 d對HA-VSMC進行CCK-8檢測。檢測前在每孔中加入10μL CCK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，于酶標儀上測定吸光度（波長為450 nm）。

1.2.5 Transwell檢測細胞遷移 常規(guī)細胞消化離心，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗1次，無胎牛血清DMEM培養(yǎng)基重懸，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度，取200μL細胞懸液（2×105個）加入Transwell上室，在Transwell下室加入500μL含15%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；分別于培養(yǎng)2、3、4 d后，固定、染色、干燥后顯微鏡下隨機選取10個不同視野，計算穿膜細胞數(shù)并進行統(tǒng)計分析。

1.2.6 SOD以及MDA含量檢測 采用細胞裂解液進行檢測，具體方法詳見說明書。

1.3 統(tǒng)計分析 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行作圖及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 RNA干擾抑制HA-VSMC Klotho表達 用慢病毒轉(zhuǎn)染HA-VSMC 72 h后，熒光顯微鏡和熒光定量PCR證明shKlotho-2073顯著抑制Klotho的表達，抑制率為86.4%。因此，選擇shKlotho-2073（shKlotho）作為干擾載體。通過Western blot進一步證實Klotho蛋白被顯著抑制。見圖1。

圖1 比較評估不同shRNA對HA-VSMCKlotho的干擾效率

2.2 RNA干擾對HA-VSMC的增殖及遷移影響shKlotho干擾HA-VSMC使細胞增殖能力較空白對照孔shNC明顯增強，并且隨著實驗時間的延長差異更加明顯，從1 d開始各時間點的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。見圖2。通過4 d的遷移實驗，shKlotho轉(zhuǎn)染的HA-VSMC遷移能力明顯增加；Transwell實驗結(jié)果顯示shKlotho組相較于shNC組，穿膜細胞數(shù)明顯增多，且在3 d以后具有更高的跨膜細胞量（P＜0.01）。見圖3。

圖2 shKlotho對HA-VSMC的增殖和遷移的影響

圖3 熒光顯微鏡下shKlotho對HA-VSMC遷移影響

2.3 RNA干擾對HA-VSMC氧化應(yīng)激的影響Klotho RNA干擾后，與shNC組相比，HA-VSMC細胞裂解物中MDA水平顯著增加，SOD水平顯著降低。與shNC相比，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotin?amide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶（NOX1，NOX2，NOX3，NOX5和DUOX2）mRNA的相對表達量顯著增加。見圖4。因此Klotho表達降低可能促進HA-VSMC的氧化應(yīng)激。

圖4 shKlotho對HA-VSMC氧化應(yīng)激水平的影響

3 討論

本研究的主要發(fā)現(xiàn)是RNA干擾Klotho基因表達減少可促進HA-VSMC增殖及遷移，促進氧化應(yīng)激水平的增高。本研究結(jié)果對于深入了解衰老或疾病狀態(tài)導(dǎo)致Klotho表達減少進而參與動脈硬化發(fā)生、發(fā)展提供了重要的理論依據(jù)。

既往研究表明抗衰老蛋白Klotho在血管內(nèi)皮功能障礙、VSMC增殖和遷移、單核細胞趨化和血管組織炎癥中起著重要作用〔6〕，且Klotho通過不同的機制參與血管保護（如抑制氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)炎癥和減少血管鈣化）〔7〕。本研究結(jié)果和既往的研究結(jié)果一致。在大鼠VSMC中，重組外源性Klotho通過NF-κB p65通路調(diào)節(jié)BAG3表達，并抑制血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）誘導(dǎo)的VSMC增殖和遷移〔8〕。Yu等〔8〕發(fā)現(xiàn)AngⅡ可促進VSMC的增殖和遷移，降低SM22α，促進PCNA的表達，提示AngⅡ?qū)SMC的表型調(diào)節(jié)有調(diào)節(jié)作用；而Klotho共處理可以通過抑制NF-kB p65、Akt和ERK通路，使VSMC中收縮蛋白表達增加，增殖蛋白表達減少，細胞骨架發(fā)生變化。因此，Klotho能有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖、遷移和表型調(diào)節(jié)。而本研究中，我們在HA-VSMC中證實了Klotho低表達可以促進HAVSMC的增殖和遷移，從而可能參與動脈硬化的發(fā)生、發(fā)展過程。

氧化應(yīng)激會隨著年齡的增長而增加，使血管內(nèi)皮功能下降，進而導(dǎo)致動脈順應(yīng)性降低〔9〕。已經(jīng)有研究表明，線粒體氧化應(yīng)激的增加是與年齡相關(guān)的動脈硬化的一個促進因素，而主動脈僵硬是高血壓的先兆〔10〕。Rakugi等〔11〕發(fā)現(xiàn)，Klotho過表達可抑制AngⅡ的表達，減少人臍靜脈血管平滑肌細胞中錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和一氧化氮（NO）的產(chǎn)生。Klotho還通過激活PI3K∕Akt∕eNOS通路并抑制LOX-1表達，上調(diào)氧化清除劑（SOD和NO），從而減輕ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激〔12〕。Klotho不僅下調(diào)小鼠主動脈血管平滑肌細胞NOX2蛋白表達和細胞內(nèi)超氧化物生成，而且還能減輕AngⅡ誘導(dǎo)的超氧化物生成、氧化損傷和細胞凋亡，且Klotho誘導(dǎo)的NOX2蛋白表達抑制可能是通過cAMP-PKA途徑介導(dǎo)的〔13〕。Wang等〔14〕給自 發(fā) 性高 血壓 大 鼠 補 充Klotho，不僅降低了NOX2和SOD，還阻止了高血壓的發(fā)展?？扇苄訩lotho（1 nm，24 h）可顯著誘導(dǎo)HA-VSMC中Nrf2、抗氧化酶HO-1、過氧化物酶1（peroxiredoxin-1，Prx-1）和谷胱甘肽水平的升高。Nrf2的沉默減弱了可溶性Klotho對HO-1和Prx-1表達的誘導(dǎo)〔15〕。因此，我們推測分子Nrf2介導(dǎo)的機制可能是可溶性Klotho在HA-VSMC中發(fā)揮保護作用的基礎(chǔ)。

細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）主要是由線粒體和NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）產(chǎn) 生〔16〕。ROS的 增 加 可 能 一 部 分 是 由NADPH氧化酶的表達和活性隨年齡增長而增加。NOX家族包括NOX1~5和DUOX1~2同種型，NOX1，NOX2，NOX4和NOX5在血管組織中表達〔17〕。除NOX5外，所有NOX亞基均與另一種跨膜蛋白p22phox相互作用，形成膜結(jié)合的催化核心〔18〕。我們的研究發(fā)現(xiàn)，Klotho的低表達可以增加MDA水平以及NADPH氧化酶（NOX1、NOX2、NOX3、NOX5、DUOX2）的表達，同時降低SOD。其他研究也提示NOX4介導(dǎo)的氧化應(yīng)激與VSMC的凋亡有關(guān)，NOX2和NOX5活性增加能誘導(dǎo)VSMC增殖〔19〕，NOX1介導(dǎo)的ROS生成可以降低腦動脈瘤收縮蛋白的表達〔20〕。因此，Klotho表達減少可促進HA-VSMC氧化應(yīng)激水平增加。

氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和衰老與心血管疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)，通過在血管平滑肌細胞中產(chǎn)生ROS作為細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)物質(zhì)，可控制細胞增殖和凋亡〔21〕。最近有研究表明，ROS的產(chǎn)生與VSMCs的增殖、遷移之間存在相互作用〔22〕。Wnt∕βcatenin信號通路與ROS密切相關(guān)，且主要通過核氧化還原蛋白（nucleoredoxin）與Dishevelled間的相互作用而發(fā)揮作用〔23〕。Chen等〔24〕用Wnt∕β-catenin信號通路抑制劑XAV939對C57BL∕6小鼠進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)XAV939可抑制內(nèi)膜形成，表現(xiàn)為內(nèi)膜面積減少和內(nèi)膜∕中膜比的降低。研究證實XAV939通過抑制Wnt信號通路，從而抑制VSMC的增殖和遷移及ROS的生成，促使細胞周期停滯，最終抑制了新生內(nèi)膜的形成。Li等〔25〕亦發(fā)現(xiàn)XAV939可以通過抑制肺動脈血管平滑肌細胞增殖進而減輕肺動脈壓和右心室肥厚。因此，我們推測Klotho表達減少促進VSMC增殖、遷移以及氧化應(yīng)激可能與Wnt∕βcatenin信號通路密切相關(guān)。同時，Klotho表達減少也可能通過促進氧化應(yīng)激從而增加血管平滑肌細胞的增殖和遷移能力。

總之，通過RNA干擾Klotho可促進HA-VSMC增殖、遷移以及氧化應(yīng)激水平增加，可能在動脈硬化發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。抗衰老因子Klotho可作為防治動脈硬化的一個新的干預(yù)靶點。