顧 婷，楊永壽，謝靜靜，肖培云

（大理大學藥學院，云南大理 671000）

由于早期對肝纖維化生物學和病理生理學的了解不夠深入，肝纖維化被認為是不可逆的嚴重肝臟疾病〔1〕，隨著醫(yī)學的發(fā)展進步，普遍認為肝纖維化的發(fā)展是一個損傷和修復的雙向過程，即可以被逆轉，從而達到治療的效果〔2-3〕。已有研究證實，美洲大蠊提取物具有較好的抗肝纖維化作用〔4-9〕。動物藥提取物多為蛋白、肽類大分子物質，由于胃和腸道中酶不同，因此降解產物氨基酸序列也不同。雖有研究表明美洲大蠊提取物對肝纖維化大鼠具有較好的治療作用，但還未有研究證實美洲大蠊提取物在胃中吸收或腸道吸收對其藥效是否有影響，而不同吸收途徑的選擇直接影響美洲大蠊抗肝纖維化制劑劑型的開發(fā)。因此本實驗通過四氯化碳致大鼠肝纖維化，灌胃給予不同劑型藥物，初步評價胃部吸收及腸道吸收對美洲大蠊活性提取物（PA-B）藥效的影響，為美洲大蠊抗肝纖維化相關制劑開發(fā)及劑型選擇提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠，雄性，體質量180~220 g，購自昆明醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（滇）K2015-0002。

1.2 藥品與試劑 PA-B腸溶微丸、胃溶微丸（本實驗室經泛丸法制備胃溶微丸，包衣鍋包腸溶衣制備腸溶微丸，經體內外實驗檢驗腸溶胃不溶，批號：20190905）；秋水仙堿片（云南植物藥業(yè)有限公司，批號：20181104）；四氯化碳（天津市福晨化工試劑廠，批號：201331120）；橄欖油（歐麗薇蘭，益海糧油工業(yè)有限公司，批號：20190322）；大鼠丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20191126和20191125）；大鼠透明質酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PC-Ⅲ）、Ⅳ型膠原蛋白（Col-Ⅳ）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號均為20191203）；羥脯氨酸（HYP）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20191203）。

1.3 儀器 ELX800連續(xù)波長酶標儀（Bio-Tek公司）；U570-86超低溫冰箱（Eppendorf公司）；LC-4012離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；AL204-IC分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 動物飼養(yǎng)及分組 SPF級雄性SD大鼠80只，自由采食，自由取水。飼養(yǎng)溫度控制在（20±2）℃，相對濕度45%~70%。分籠飼養(yǎng)，飲冷開水，喂食標準飼料，定期清潔消毒，實驗過程中遵守實驗動物使用及管理原則，所有實驗動物實驗前均適應性飼養(yǎng)1周。1周后將大鼠按體質量隨機分為8組，分別為對照組、模型組、腸溶輔料組、胃溶輔料組、陽性藥物組、原料藥組（PA-B）、腸溶藥物組、胃溶藥物組，每組10只。除對照組外，其余各組均被制成肝纖維化模型。

2.2 大鼠肝纖維化模型制備 對照組腹腔注射橄欖油，其余各組腹腔注射40%四氯化碳油劑。每3 d一次，首次注射2 mL∕kg，之后注射1 mL∕kg，每次注射前稱重，連續(xù)4周〔10-11〕。于第4周末，隨機抽取模型組和對照組2~3只取材，進行病理檢查，用于判定是否造模成功。

2.3 給藥方案 造模成功后，陽性藥物組給予0.2 mg∕kg秋水仙堿（0.02 mg∕mL），腸溶藥物組給予260 mg∕kg PA-B腸溶微丸（含60 mg∕kg PA-B）藥物，胃溶藥物組給予234 mg∕kg PA-B胃溶微丸（含60 mg∕kg PA-B），腸溶輔料組給予200 mg∕kg腸溶微丸，胃溶輔料組給予174 mg∕kg胃溶微丸，原料藥組給予60 mg∕kg PA-B（6 mg∕mL），對照組及模型組給予等體積0.9%氯化鈉溶液，每天灌胃1次，連續(xù)4周。

2.4 樣品采集及處理 各組末次給藥后禁食不禁水24 h，稱重，經1%戊巴比妥鈉（0.55 mL∕100 g）腹腔注射麻醉后，真空采血管行腹主動脈采血，離心（3 000 r∕min，15 min，4℃），分離血清，分裝，-80℃凍存。采血后處死大鼠，將大鼠肝臟完整剖取，0.9%氯化鈉溶液沖洗，濾紙拭干，取肝臟左葉同一部位用4%多聚甲醛溶液固定，剩余肝組織分裝標號，-80℃儲存，以備分析。

2.5 組織病理學觀察 將多聚甲醛固定后的大鼠肝組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色、Masson染色，觀察各組大鼠肝組織病理變化。

2.6 主要檢測指標

2.6.1 ALT和AST測定 根據試劑盒說明書操作，測定血清中ALT、AST含量。

2.6.2 HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ測定 根據試劑盒說明書，采用ELISA法測定血清肝纖維化4項指標：HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ。

2.6.3 肝組織中HYP測定 根據試劑盒說明書操作，測定肝組織中HYP含量。

2.7 數(shù)據處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據均以（xˉ±s）表示，采用單因素方差分析進行數(shù)據統(tǒng)計，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 組織病理學觀察

3.1.1 HE染色病理學觀察 肝組織HE染色結果見圖1，對照組肝組織無纖維組織增生，未發(fā)現(xiàn)變性壞死，匯管周圍有呈放射狀的肝細胞索，肝小葉結構存在。模型組可見肝細胞結構變性，匯管周圍大量膠原纖維增生，不同匯管區(qū)膠原纖維相互連接成明顯的假小葉，肝細胞索排列紊亂無序。胃溶輔料組和腸溶輔料組匯管區(qū)纖維增生形成假小葉結構，與模型組相當。其余各治療組纖維組織增生減輕，未見明顯的假小葉結構，肝細胞索排列有恢復呈放射狀的趨勢，僅在匯管區(qū)周圍發(fā)現(xiàn)少量纖維增生。

圖1大鼠肝組織HE染色結果（×100）

3.1.2 Masson染色觀察 Masson染色是將膠原纖維染成藍色，這樣能更直觀地觀察膠原纖維化的形狀及分布。對照組肝組織未見明顯藍染，未見膠原沉積，肝小葉結構正常。模型組匯管區(qū)周圍可見大量藍色著色，膠原纖維明顯增多且較粗壯，膠原纖維相互連接，假小葉結構明顯。腸溶輔料組、胃溶輔料組藍色著色程度與模型組相當，假小葉結構明顯。陽性藥物組、原料藥組、腸溶藥物組、胃溶藥物組與模型組相比，藍色著色明顯減輕，僅在匯管區(qū)附近有少量纖維組織，纖維組織延伸情況減輕，未見假小葉結構，肝細胞索有聚攏趨勢。見圖2。

圖2 大鼠肝組織Masson染色結果（×100）

3.2 指標檢測結果

3.2.1 肝功能指標ALT、AST測定 與對照組比較，模型組血清中ALT及AST含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥物組、原料藥組、腸溶藥物組和胃溶藥物組血清中ALT含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與陽性藥物組比較，原料藥組、腸溶藥物組、胃溶藥物組血清中ALT和AST含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與原料藥組比較，腸溶藥物組、胃溶藥物組血清中ALT、AST含量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與腸溶藥物組比較，胃溶藥物組血清中ALT和AST含量降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 大鼠血清中ALT和AST含量測定結果（xˉ±s，U∕L）

3.2.2 大鼠血清肝纖維化4項指標測定 與對照組比較，模型組大鼠血清中HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥物組、原料藥組、腸溶藥物組、胃溶藥物組HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ水平均下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與陽性藥組比較，原料藥組、腸溶藥物組、胃溶藥物組HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與原料藥組比較，腸溶藥物組、胃溶藥物組4項指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與腸溶藥物組比較，胃溶藥物組4項指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

3.2.3 大鼠肝組織中HYP含量的測定 與對照組比較，模型組大鼠肝組織中HYP含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥物組、原料藥組、腸溶藥物組、胃溶藥物組HYP含量下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與陽性藥物組比較，原料藥組、腸溶藥物組、胃溶藥物組HYP含量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與原料藥組比較，腸溶藥物組、胃溶藥物組HYP含量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與腸溶藥物組比較，胃溶藥物組HYP含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表2 大鼠血清肝纖維化4項指標測定結果（xˉ±s，ng∕mL）

表3 大鼠肝組織中HYP含量測定結果（xˉ±s，μg∕mg）

4 討論

肝纖維化是肝臟纖維組織的異常增生，早期肝纖維化可被逆轉，不繼續(xù)發(fā)展為肝硬化。當前，肝纖維化的評判標準仍是肝組織活檢，同時檢測肝功能指標及影響肝纖維化的4項指標，可反映出肝纖維化的嚴重程度。血清中ALT和AST含量測定是國內外廣泛應用的反映肝細胞損傷指標，在肝纖維化肝功能受損時，血清中ALT、AST含量往往升高；血清HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ水平檢測，可以動態(tài)觀察病情演變情況以及判斷臨床治療效果，同時也有助于提高肝纖維化診斷的準確性和可靠性；HYP是一類存在于膠原纖維中的蛋白，其含量可直接反映出肝組織中膠原含量的高低，對肝組織中膠原含量的測定具有重要的作用。因此，本實驗檢測大鼠血清ALT和AST含量，肝纖維化4項指標，結合肝組織中HYP含量，可較好地反映出藥物對四氯化碳所致肝纖維化大鼠的改善程度。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組膠原纖維增多，假小葉明顯，血清中ALT、AST、HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ、HYP含量升高，表明肝功能受損，肝纖維化模型造模成功；與模型組比較，陽性藥物組、原料藥組、腸溶藥物組、胃溶藥物組大鼠膠原纖維、假小葉減少，血清中ALT、HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ、HYP含量明顯降低，表明實驗藥物對肝纖維化大鼠的肝臟具有一定的保護作用；與陽性藥物組比較，原料藥組、腸溶藥物組、胃溶藥物組各指標差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與腸溶藥物組比較，胃溶藥物組各指標差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。因美洲大蠊味道讓人難以接受，若直接口服原料藥，患者依從性不高，因此，可將美洲大蠊活性提取物制備成胃溶制劑，相較于腸溶制劑省去包衣步驟，該方法簡單，既能提高患者依從性，又能降低制劑生產成本，保證藥物的療效。