朱起杰，郎利娟，姜 北，沈 怡，王 影，肖朝江*

（1.大理大學(xué)藥物研究所，云南大理 671000；2.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000）

薔薇科（Rosaceae）山楂屬（Crataegus）植物，我國有18種，云南有7種，包括山楂（C.pinnatifida）、野山楂（C.cuneata）、華中山楂（C.wilsonii）、中甸山楂（C.chungtienensis）、滇西山楂（C.oresbia）、湖北山楂（C.hupehensis）和云南山楂（C.scabrifolia），其中云南山楂主要分布于云南、貴州、四川、廣西等地，生長于海拔800～2 400 m的山坡雜木林中或次生灌叢中或林緣〔1〕。山楂作為傳統(tǒng)中藥，其果肉、葉及核均可入藥。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)山楂的化學(xué)成分主要有黃酮類、三萜類、甾體類、有機酸類及有機胺類等，其中山楂總黃酮成分表現(xiàn)出顯著的調(diào)血脂作用〔2-3〕。云南山楂在云南等地作中藥山楂藥用，其有野生種和栽培種之分。周慶平等〔4〕發(fā)現(xiàn)云南山楂果實具有較強的體外清除超氧陰離子自由基作用和體內(nèi)降脂作用。目前，僅斯建勇等〔5-6〕對云南山楂的果實和葉進行了化學(xué)成分研究，報道了10個常見的黃酮類、三萜類化學(xué)成分。為充分利用云南山楂資源，本文對采自云南大理蒼山的野生云南山楂（野生種）果實的化學(xué)成分及其體外降脂活性進行了初步研究，結(jié)果從該植物果實95%乙醇提取物中分離得到6個化合物，分別鑒定為苯甲酸（1）、2-羥基丁二酸二甲酯（2）、2-羥基丁二酸-1-甲基酯（3）、β-谷甾醇（4）、胡蘿卜苷（5）、槲皮素（6），其中化合物2和3為首次從山楂屬植物中分離得到，化合物1為首次從該植物中分離得到。見圖1。

圖1 化合物1~6的結(jié)構(gòu)式

1 儀器與材料

AvanceⅢ-400核磁共振波譜儀（德國布魯克公司），四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標；SGW-3自動旋光儀（上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司）；Buchi R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琦公司）；柱層層析硅膠（青島海洋化工廠分廠）；薄層層析硅膠板GF254（青島海洋化工有限公司）；Sephadex LH-20（瑞典安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司）；D101大孔吸附樹脂（天津波鴻樹脂科技有限公司）；石油醚、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇均為工業(yè)純，經(jīng)重蒸后使用。

本實驗所用植物樣品于2018年10月采自云南大理蒼山，經(jīng)大理大學(xué)藥學(xué)院張德全教授鑒定為云南山楂［Crataegus scabrifolia（Franch.）Rehd.］野生種的果實，植物標本（編號20181009-2）保存于大理大學(xué)藥物研究所。

2 方法

2.1 植物提取 野生云南山楂果實6.4 kg，粉碎后，95%乙醇冷浸提取4次，冷浸液經(jīng)減壓濃縮后得到總浸膏2.7 kg，提取率為42.2%。

2.2 化合物分離 野生云南山楂果實總浸膏（2.7kg）以2.7 kg 80~100目硅膠吸附后經(jīng)200~300目硅膠柱層析，氯仿-丙酮（1：0→0：1）溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，最后用甲醇洗脫，薄層色譜法（TLC）檢測合并相同流分，得到8個組分（Fr.1~Fr.8）。Fr.2組分（25 g）經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚-乙酸乙酯60：1→2：1），得到11個組分（Fr.2-1~Fr.2-11）。Fr.2-6放置后有晶體析出，經(jīng)石油醚反復(fù)洗滌，得到化合物4（1.65 g）。Fr.3組分（80 g）經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚-丙酮15：1→0：1），得到11個組分（Fr.3-1～Fr.3-11）。Fr.3-5經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜（石油醚-丙酮15：1→0：1）和Sephadex LH-20凝膠柱色譜（氯仿-甲醇1：1），得到化合物1（30 mg）。Fr.3-8經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜（石油醚-丙酮15：1→0：1、氯仿-乙酸乙酯20：1→4：1）和Sephadex LH-20凝膠柱色譜（氯仿-甲醇1：1），依次得到化合物2（66 mg）和3（144 mg）。Fr.5組分（62 g）經(jīng)D101大孔吸附樹脂（甲醇-水0：1→1：0）反相梯度洗脫，得到5個組分（Fr.5-1～Fr.5-5）。Fr.5-2經(jīng)硅膠柱色譜（氯仿-丙酮30：1）和Sephadex LH-20凝膠柱色譜（氯仿-甲醇1：1），得到化合物6（8 mg）。Fr.5-4放置后有沉淀析出，以甲醇反復(fù)洗滌得到化合物5（3.13 g）。

2.3 體外降脂活性測試 參照文獻〔7〕中的方法，并進行適當改良，具體如下：將HepG2細胞（1.5×104個∕孔）接種于96孔板上，置37℃和5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)至細胞豐度達90%以上時，以0.6 mmol∕L的油酸鈉和0.3 mmol∕L的棕櫚酸鈉誘導(dǎo)。24 h后，供試組每孔加入20μL供試化合物溶液，空白組和模型組每孔加入20μL相應(yīng)溶媒。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，小心移除孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入60μL 10%甲醛溶液固定30 min。隨后移除固定液，每孔加入60μL 0.4 mg∕mL油紅O工作液染色，60 min后用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗3遍，置倒置顯微鏡下觀察細胞內(nèi)脂滴染色情況。最后每孔加入200μL異丙醇，并用酶標儀測定波長510 nm下各組的OD值。降脂率按以下公式計算：降脂率=［1-（供試組OD值-空白組OD值）∕（模型組OD值-空白組OD值）］×100%。

3 結(jié)果

3.1 化學(xué)成分 化合物1：白色針晶（氯仿）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.15（2H，brd，J=7.6 Hz，H-2，6），7.63（1H，brt，J=7.6 Hz，H-4），7.49（2H，brt，J=7.6 Hz，H-3，5）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：172.7（s，-COOH），129.5（s，C-1），130.3（d，C-2，6），128.6（d，C-3，5），134.0（d，C-4）。以上數(shù)據(jù)與文獻〔8〕報道基本一致，故鑒定該化合物為苯甲酸。

化合物2：白色固體。[α]25D=0（c=0.10，MeOH）；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：4.51（1H，dd，J=6.6，4.8 Hz，H-2），3.75（3H，s，4-OCH3），3.68（3H，s，1-OCH3），2.81（1H，dd，J=16.1，4.8 Hz，H-3a），2.72（1H，dd，J=16.1，6.6 Hz，H-3b）；13C-NMR（100MHz，CD3OD）δ：173.6（s，C-1），67.0（d，C-2），38.5（t，C-3），171.2（s，C-4），52.1（q，4-OCH3），51.6（q，1-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻〔9〕報道基本一致，故鑒定該化合物為2-羥基丁二酸二甲酯。

化合物3：無色針晶（丙酮）。[α]25D=0（c=0.10，MeOH）；1H-NMR（400 MHz，CD3COCD3）δ：4.51（1H，dd，J=7.1，4.7 Hz，H-2），3.69（3H，s，-OCH3），2.79（1H，dd，J=16.2，4.7Hz，H-3b），2.66（1H，dd，J=16.2，7.1 Hz，H-3a）；13C-NMR（100 MHz，CD3COCD3）δ：174.2（s，C-1），68.2（d，C-2），39.3（t，C-3），172.1（s，C-4），52.3（q，-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻〔9〕報道基本一致，故鑒定該化合物為2-羥基丁二酸-1-甲基酯。

化合物4：無色針晶（氯仿）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3-CD3OD）δ：5.34（1H，brs，H-6），3.45（1H，m，H-3），1.02（3H，s，Me-19），0.94（3H，d，J=6.5 Hz，Me-21），0.86，0.84，0.82（each 3H，overlap，Me-26，27，29），0.70（3H，s，Me-18）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3-CD3OH）δ：36.9（t，C-1），30.7（t，C-2），70.8（d，C-3），41.4（t，C-4），140.5（s，C-5），121.1（d，C-6），31.5（t，C-7），31.5（d，C-8），49.9（d，C-9），36.1（s，C-10），20.7（t，C-11），39.4（t，C-12），41.9（s，C-13），55.7（d，C-14），23.9（t，C-15），27.8（t，C-16），56.4（d，C-17），11.3（q，C-18），18.8（q，C-19），35.8（d，C-20），18.2（q，C-21），33.5（t，C-22），25.6（t，C-23），45.5（d，C-24），28.7（d，C-25），19.2（q，C-26），18.4（q，C-27），22.6（t，C-28），11.3（q，C-29）。以上數(shù)據(jù)與文獻〔10〕報道基本一致，故鑒定該化合物為β-谷甾醇。

化合物5：白色粉末。在TLC上用多種溶劑系統(tǒng)展開后化合物5與已鑒定化合物胡蘿卜苷Rf值及斑點顏色均一致，故鑒定該化合物為胡蘿卜苷。

化合物6：黃色粉末。1H-NMR（400 MHz，CD3COCD3）δ：12.20（1H，s，5-OH），7.83（1H，d，J=2.1 Hz，H-2'），7.71（1H，dd，J=8.5，2.1 Hz，H-6'），7.01（1H，d，J=8.5 Hz，H-5'），6.54（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.27（1H，d，J=2.0 Hz，H-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻〔11〕報道基本一致，故鑒定該化合物為槲皮素。

3.2 體外降脂活性 體外高脂HepG2細胞模型降脂實驗結(jié)果表明，化合物2～5在200μmol∕L濃度下均未有明顯的降脂率，無體外降脂活性。

4 討論

本實驗從野生云南山楂果實95%乙醇提取物中分離鑒定了6個化合物，其中化合物2和3為首次從山楂屬植物中分離得到，對該屬植物的化學(xué)成分有了進一步認識，也為開發(fā)云南豐富的山楂屬植物資源奠定了一定的基礎(chǔ)。另外，化合物2和3經(jīng)SGW-3自動旋光儀測得的比旋光度均為0，推測化合物2和3應(yīng)該為等量的對映異構(gòu)體。

目前，黃酮類化合物被認為是山楂降脂的物質(zhì)基礎(chǔ)，然而本實驗從野生云南山楂果實中僅獲得一個含量非常低的黃酮類化合物——槲皮素，同時含量較高化合物均未顯示出體外降脂活性，提示野生云南山楂降脂活性物質(zhì)有待進一步深入研究。