李生軍，張海霞，王興隴，李倩，包曉婧，李向茸，馮若飛

1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730030；

2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030

腦心肌炎是由腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）引起的以腦炎、心肌炎、心肌周圍炎為主要臨床特征的急性傳染病，可感染豬等哺乳類動(dòng)物及靈長(zhǎng)類動(dòng)物［1-2］。1945年，首次分離獲得EMCV，1958年EMCV感染確定為豬的致死性病因之一［3-4］。EMCV感染宿主的范圍較廣，其中仔豬致病率和致死率較高，其暴發(fā)流行對(duì)人類公共衛(wèi)生及養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)均造成了較大影響［5］。EMCV為無包膜單股正義鏈RNA病毒，病毒粒子直徑約30 nm，呈球形，蛋白質(zhì)分子量約2 600 ku［6］。EMCV基因組包含4種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白均參與病毒抗原表位的形成，其中VP1是最重要的中和性抗原表位，還與病毒粒子表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、抗原性、受體吸附及脫殼密切相關(guān)；VP2上存在的2個(gè)B細(xì)胞線性表位也有一定的免疫活性［7］。

血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）屬于免疫球蛋白超家族，又稱為CD106［8］，廣泛表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等細(xì)胞表面［9］。研究表明，VCAM-1不僅參與機(jī)體的免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移等多種病理生理過程，也參與多種病毒感染機(jī)制，如巨細(xì)胞病毒、腸道病毒71型［10-14］。HUBER［15］研究證實(shí)，VCAM-1參與EMCV的感染過程，但未見VCAM-1對(duì)EMCV增殖調(diào)控作用的相關(guān)報(bào)道。本研究通過探討VCAM-1對(duì)EMCV體外增殖的影響及其作用機(jī)制，以期為EMCV感染相關(guān)疾病的治療及其相關(guān)疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、質(zhì)粒、細(xì)胞及基因EMCV GS-01株、感受態(tài)E.coliBL21（DE3）、載體pcDNA3.1、表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-VCAM-1、pET30a-VP1（含His標(biāo)簽）、pET30a-VP2（含His標(biāo)簽）、pET30a-VP3（含His標(biāo)簽）及pGEX-6P-1-VCAM-1（含GST標(biāo)簽）由西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；C2C12小鼠成肌細(xì)胞由甘肅省動(dòng)物技術(shù)創(chuàng)新中心提供；siNC（5′-UUCUCCGAA-CGUGUCACGU-3′）和siVCAM-1（5′-GGATAATCCT-GAAGAAGAA-3′）均由廣州瑞博生物科技有限公司設(shè)計(jì)及合成。

1.2 主要試劑 胎牛血清購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、RNAiso plus細(xì)胞／細(xì)菌總RNA提取試劑盒、高純質(zhì)粒小提試劑盒、TIANScript M-MLV及TaqDNA聚合酶均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；SYBR Select Master Mix試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI公司；LipofectamineTM2000 Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；ECL顯色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Perkin-Elmer公司；兔抗VCAM-1單克隆抗體及鼠抗β-actin單克隆購(gòu)自美國(guó)Abclonal公司；兔抗His單克隆抗體及鼠抗GST單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔及山羊抗鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Jackson公司；Easy Pure Quick Gel Extraction Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Pierce GST protein Interaction Pull-down Kit購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中登錄的鼠源VCAM-1基因序列（X67783.1），應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)qPCR檢測(cè)用引物（VCAM-1-qF／R）、內(nèi)參引物（mGAPDH-qF／R）、EMCV檢測(cè)用引物（EMCVLZD-F／R）及探針（EMCV Probe）［16］，見表1。引物及探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物及探針序列Tab.1 Sequences of primers and probes

1.4 EMCV感染時(shí)間對(duì)C2C12細(xì)胞中VCAM-1表達(dá)水平影響的檢測(cè) 將C2C12細(xì)胞按1×106個(gè)／孔接種于6孔板，用含10% NBS的DMEM培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)18～24 h；待細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)，將EMCV按MOI=0.001感染，同時(shí)設(shè)未感染組，于37℃感染24和48 h，收取細(xì)胞。采用RNAiso plus試劑盒提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)。采用RIPA裂解細(xì)胞，經(jīng)15% SDS-PAGE分離蛋白后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入兔抗VCAM-1單克隆抗體（1∶3 000稀釋）及鼠抗β-actin單克隆抗體（1∶5 000稀釋），于室溫孵育2 h；TBST洗滌5次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔及山羊抗鼠IgG（1∶10 000稀釋），室溫孵育1 h；TBST洗滌5次，ECL法顯色。

1.5 過表達(dá)VCAM-1對(duì)EMCV體外增殖影響的檢測(cè)按1.4項(xiàng)方法培養(yǎng)C2C12細(xì)胞，待細(xì)胞密度約達(dá)80%時(shí)，在LipofectamineTM2000的介導(dǎo)下，將2μg pcDNA3.1和pcDNA3.1-VCAM-1分別轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，qPCR及Western blot法（同1.4項(xiàng)）檢測(cè)VCAM-1過表達(dá)情況。再將EMCV按MOI=0.001感染，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞及上清液，反復(fù)凍融3次，于4℃，943×g離心10 min，取上清液，參照文獻(xiàn)［16］的qPCR法和TCID50法分別檢測(cè)病毒拷貝數(shù)和病毒滴度。

1.6 抑制VCAM-1表達(dá)對(duì)EMCV體外增殖影響的檢測(cè) 按1.5項(xiàng)方法將150 nmol／L siNC和siVCAM-1分別轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，qPCR及Western blot法（同1.4項(xiàng)）檢測(cè)VCAM-1抑制表達(dá)情況。再按1.5項(xiàng)方法感染EMCV，并檢測(cè)病毒拷貝數(shù)及病毒滴度。

1.7 VCAM-1與EMCV結(jié)構(gòu)蛋白間相互作用的檢測(cè)將表達(dá)質(zhì)粒pET30a-VP1、pET30a-VP2、pET30a-VP3及pGEX-6P-1-VCAM-1轉(zhuǎn)染至感受態(tài)E.coliBL21（DE3），用LB培養(yǎng)基于37℃中培養(yǎng)12 h；按1∶100的比例轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至A600為0.6時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol／L的IPTG，于28℃誘導(dǎo)24 h，收獲表達(dá)產(chǎn)物。采用Pierce GST protein Interaction Pull-down Kit試劑盒將含有GST標(biāo)簽的VCAM-1融合蛋白固化在樹脂上，用預(yù)冷的PBS洗滌10次，加入2 mL蛋白結(jié)合緩沖液，冰浴30 min；分別加入含有His標(biāo)簽的VP1、VP2和VP3融合蛋白，用預(yù)冷的蛋白結(jié)合緩沖液（50 mmol／L Tris-HCl，pH 7.4，100 mmol／L NaCl）洗滌10次，加入1 mL洗脫液（50 mmol／L Tris-HCl，pH 7.4，10 mmol／L NaCl，10 mmol／L還原性谷胱甘肽），室溫振蕩30 min，收集產(chǎn)物。經(jīng)Western blot法檢測(cè)VCAM-1與病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3之間的相互作用，方法同1.4項(xiàng)，其中一抗為鼠抗GST單克隆抗體（1∶3 000稀釋）及兔抗His單克隆抗體（1∶5 000稀釋）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素ANOVAs或t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EMCV感染時(shí)間對(duì)C2C12細(xì)胞中VCAM-1表達(dá)水平的影響 與未感染組比較，EMCV感染C2C12細(xì)胞24 h時(shí)，感染組VCAM-1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平及VCAM-1蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.845，P>0.05）；感染48 h時(shí)，感染組VCAM-1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平及VCAM-1蛋白表達(dá)水平均明顯降低（t=10.61，P<0.001）。見圖1及表2。表明C2C12細(xì)胞內(nèi)VCAM-1蛋白的表達(dá)水平隨著EMCV感染時(shí)間的延長(zhǎng)明顯降低。

圖1 Western blot法檢測(cè)C2C12細(xì)胞感染EMCV后VCAM-1蛋白的表達(dá)情況Fig.1 Western blotting of expression of VCAM-1 in C2C12 cells infected with EMCV

表2 C2C12細(xì)胞感染EMCV后VCAM-1基因mRNA轉(zhuǎn)錄及VCAM-1蛋白表達(dá)水平Tab.2 The mRNA transcription and VCAM-1 protein expression levels of VCAM-1 gene in C2C12 cells after EMCV infection

2.2 過表達(dá)VCAM-1對(duì)EMCV體外增殖的影響pcDNA3.1-VCAM-1轉(zhuǎn)染組及pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組C2C12細(xì)胞中VCAM-1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別為9.97和1.05，VCAM-1蛋白表達(dá)水平分別為1.84和0.90，見圖2。pcDNA3.1-VCAM-1轉(zhuǎn)染組C2C12細(xì)胞中VCAM-1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平及VCAM-1蛋白表達(dá)水平明顯高于pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組（t=14.35，P<0.01）。感染EMCV后，pcDNA3.1-VCAM-1轉(zhuǎn)染組及pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組C2C12細(xì)胞EMCV病毒拷貝數(shù)分別為3.45×108和3.02×109，病毒滴度分別為10-3.37和10-4.96TCID50／mL。與pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組比較，pcDNA3.1-VCAM-1轉(zhuǎn)染組EMCV病毒拷貝數(shù)及病毒滴度均顯著降低（t分別為13.59和12.55，P<0.001）。表明過表達(dá)VCAM-1可抑制EMCV增殖。

圖2 Western blot法檢測(cè)C2C12細(xì)胞中VCAM-1蛋白的過表達(dá)情況Fig.2 Western blotting of overexpression of VCAM-1 in C2C12 cells

2.3 抑制VCAM-1表達(dá)對(duì)EMCV體外增殖的影響siNC轉(zhuǎn)染組和siVCAM-1轉(zhuǎn)染組C2C12細(xì)胞中VCAM-1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別為1.10和0.18，VCAM-1蛋白表達(dá)水平分別為2.20和1.11，見圖3。siVCAM-1轉(zhuǎn)染組C2C12細(xì)胞中VCAM-1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平及VCAM-1蛋白表達(dá)水平明顯低于siNC轉(zhuǎn)染組（t=51.08，P<0.001）。感染EMCV后，siVCAM-1轉(zhuǎn)染組及siNC轉(zhuǎn)染組C2C12細(xì)胞EMCV病毒拷貝數(shù)分別為6.72×107和5.57×106，病毒滴度分別為10-5.3和10-3.8TCID50／mL。與siNC轉(zhuǎn)染組比較，siVCAM-1轉(zhuǎn)染組EMCV病毒拷貝數(shù)及病毒滴度均顯著升高（t分別為13.23和12.99，P<0.001）。表明抑制表達(dá)VCAM-1可促進(jìn)EMCV增殖。

圖3 Western blot法檢測(cè)C2C12細(xì)胞中VCAM-1蛋白的抑制表達(dá)情況Fig.3 Western blotting of inhibition of VCAM-1 in C2C12 cells

2.4 VCAM-1與EMCV結(jié)構(gòu)蛋白間的相互作用加入融合蛋白GST-VCAM-1的Pull-down收獲液及Input收獲液均可與鼠抗GST單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，表明GST-VCAM-1成功固化在樹脂上。加入融合蛋白His-VP1、His-VP2或His-VP3的Input收獲液均可與兔抗His單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，加入His-VP1、His-VP2的Pull-down收獲液可與兔抗His單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，加入His-VP3的Pull-down收獲液未見該結(jié)合條帶，見圖4。表明VCAM-1與病毒蛋白VP1和VP2有明顯的直接相互作用，與VP3無相互作用。

1：VP1；2：VP2；3：VP3。

3 討論

多年來，已在多個(gè)國(guó)家相繼報(bào)道了EMCV感染的暴發(fā)和流行，主要引起孕豬流產(chǎn)、死胎、弱胎及仔豬的急性、致死性腦炎、心肌炎等疾病，嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展［17-18］。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是病毒性腦炎發(fā)病的一個(gè)主要機(jī)制，正常情況下非活化內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM-1呈不表達(dá)或低表達(dá)，當(dāng)受到外源因子刺激或誘導(dǎo)后，組織、器官會(huì)產(chǎn)生各種病變，一般是從黏附分子的過量表達(dá)開始［19-20］。作為主要的兩種黏附分子，細(xì)胞間黏附分子（intercellular cell adhesion molecule，ICAM-1）和VCAM-1可使細(xì)胞之間或與基質(zhì)之間發(fā)生黏附，主要參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及與疾病相關(guān)的炎性反應(yīng)［21-22］。研究表明，高表達(dá)VCAM-1可與整合素家族的極晚期抗原-4（very late antigen-4，VLA-4）相互作用，發(fā)揮炎癥性損傷作用［23］。VCAM-1還與血栓形成、心功能衰退等疾病相關(guān)［24］。研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘發(fā)的心肌炎性反應(yīng)中，ICAM-1和VCAM-1表達(dá)顯著上升，該反應(yīng)主要通過I-κB的磷酸化和降解，從而釋放、活化NF-κB p65，過量表達(dá)的ICAM-1和VCAM-1可加重炎性反應(yīng)［22］。目前針對(duì)VCAM-1的研究基本上均與疾病的發(fā)展進(jìn)程相關(guān)，如VCAM-1參與免疫細(xì)胞的黏附和遷移，VCAM-1與配體結(jié)合后具有加強(qiáng)黏附的作用，可促進(jìn)炎性細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移等，表明VCAM-1在炎癥、腫瘤轉(zhuǎn)移等病理過程中發(fā)揮重要作用［25-26］。

本研究通過檢測(cè)EMCV感染后C2C12細(xì)胞內(nèi)VCAM-1的表達(dá)情況，結(jié)果表明，C2C12細(xì)胞內(nèi)VCAM-1基因轉(zhuǎn)錄及VCAM-1蛋白的表達(dá)水平隨著EMCV感染時(shí)間的延長(zhǎng)明顯降低（P<0.001），驗(yàn)證了EMCV感染可抑制VCAM-1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)過表達(dá)及抑制表達(dá)細(xì)胞內(nèi)VCAM-1對(duì)EMCV增殖的影響，結(jié)果顯示，過表達(dá)VCAM-1可明顯抑制EMCV增殖（P<0.001），抑制VCAM-1表達(dá)可促進(jìn)EMCV增殖（P<0.001）。為驗(yàn)證VCAM-1與EMCV結(jié)構(gòu)蛋白之間的相互作用，選取病毒蛋白VP1、VP2及VP3進(jìn)行原核表達(dá)，利用帶GST標(biāo)簽的VCAM-1作為誘餌蛋白，進(jìn)行Pull-down驗(yàn)證，分別捕獲含有His標(biāo)簽的VP1、VP2、VP3蛋白，結(jié)果顯示，VCAM-1與VP1、VP2存在明顯的相互作用，與VP3無相互作用。綜上所述，VCAM-1對(duì)EMCV體外增殖發(fā)揮抑制作用，可能是通過VCAM-1與EMCV結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2的相互作用實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)為EMCV感染相關(guān)疾病的治療及其相關(guān)疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。