石磊泰，李加，張月蘭，王輝，雷繼軍，郭中平，李玉華

1.中國食品藥品檢定研究院，北京102629；2.北京生物制品研究所有限責任公司，北京100176；3.武漢生物制品研究所有限責任公司，湖北 武漢430070；4.國家藥典委員會，北京100061

從1965年武漢生物制品研究所和蘭州生物制品研究所聯(lián)合中國藥品生物制品檢定所用北京株狂犬病病毒固定毒株，在原代地鼠腎細胞適應傳代，研制成功原代地鼠腎細胞培養(yǎng)的人用狂犬病滅活疫苗，至今為止，在我國已有50多年的使用歷史［1-3］。目前該類疫苗仍在市場流通，為我國狂犬病的預防做出了卓越的貢獻?？袢∈侵滤佬约膊?，全世界每年因其死亡約59 000人［4］，我國近年的狂犬病疫情雖有所緩解，但情況仍不容樂觀。我國人用狂犬病疫苗市場需求量較大，2015—2019年連續(xù)5年人用狂犬病疫苗（地鼠腎細胞）的批簽發(fā)量就分別達到了80萬、80萬、100萬、120萬和63萬人份［5］。狂犬病疫苗接種無禁忌癥，受種群體廣泛，因此其有效性和安全性就顯得尤為重要，而就安全性而言，疫苗中的雜質控制值得關注。

宿主蛋白作為來源于細胞基質的一類異源成分，可能誘導機體產(chǎn)生未知的免疫應答而影響疫苗的功效，也可能引起超敏反應或其他不良反應，有必要進行有效控制。雖然WHO的技術指導原則中未對宿主蛋白殘留量作出含量限定［6-7］，但我國藥品監(jiān)管機構早在《中國藥典》三部（2010版）中就明確了地鼠腎細胞蛋白質殘留量的限量標準［8］，并建立了有效的檢測方法［9-10］，在人用狂犬病疫苗（地鼠腎細胞）的質量控制中發(fā)揮了技術支撐和監(jiān)管的作用。

在不改變現(xiàn)有檢測方法的前提下，我們優(yōu)化了檢測體系，研制出原代地鼠腎細胞蛋白質國家標準品［11］，替換試劑盒自帶標準品，確保了檢定結果的科學性和準確性。為了配合原代地鼠腎細胞蛋白質國家標準品的合理、有效使用，有必要建立原代地鼠腎細胞蛋白質國家對照品，以保證檢驗檢測體系的準確、可靠。本研究采用ELISA法，用原代地鼠腎細胞蛋白質標準品（量值為4.0μg／mL）對原代地鼠腎細胞蛋白質對照品進行協(xié)作標定賦值，并進行均勻性和穩(wěn)定性分析。

1 材料與方法

1.1 協(xié)作標定樣品 原代地鼠腎細胞蛋白質標準品，批號為：250024-201901，經(jīng)中國食品藥品檢定研究院標準化委員會批準使用，量值為4.0μg／mL，凍干劑型，95%可信限為：（4.0±0.5）μg／mL，6支／實驗室；待標定原代地鼠腎細胞蛋白質對照品，凍干劑型，6支／實驗室。

1.2 協(xié)作標定方案 由中國食品藥品檢定研究院設計協(xié)作標定方案并發(fā)放協(xié)作標定作業(yè)指導書，各實驗室使用統(tǒng)一的標準操作規(guī)范和統(tǒng)一的實驗記錄，采用原代地鼠腎細胞蛋白質殘留量ELISA檢測試劑盒［由北京生物制品研究所有限責任公司（原天壇生物）提供，批號為：20190414和20190415］，用原代地鼠腎細胞蛋白質標準品繪制標準曲線（6.25～200 ng／mL），計算原代地鼠腎細胞蛋白質對照品含量。

1.3 數(shù)據(jù)匯總及結果分析 邀請4家實驗室進行協(xié)作標定，各參與單位每次實驗獨立檢測6次，涉及2個批次試劑盒，每批3個數(shù)據(jù)，中國食品藥品檢定研究院匯總各協(xié)作單位檢測結果，經(jīng)統(tǒng)計學軟件SPSS 20.0分析，計算原代地鼠腎細胞蛋白質對照品的量值。

1.4 對照品均勻性和穩(wěn)定性分析

1.4.1 均勻性 對于均勻性好的樣品，當總體單元數(shù)大于500時，抽取單元數(shù)不小于15個的要求，該標準品物理檢查合格數(shù)為2 000支，均勻性檢驗抽取的數(shù)目為16支，采用pH值考察均勻性指標。

1.4.2 穩(wěn)定性 將樣品分別在4、25和37℃放置不同時間（1、2、3和4周），不同時間點取3支，于-20℃保存。待所有樣本放置結束后，采用統(tǒng)一的ELISA方法，將樣本用0.5 mL滅菌注射用水復溶，進行抗原含量檢測。

2 結果

2.1 原代地鼠腎細胞蛋白質對照品協(xié)作標定結果數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果顯示，最終原代地鼠腎細胞蛋白質對照品量值為34.7 ng／mL；95%參考范圍按95%可信限公式（x±1.96S）計算，其中x=34.7 ng／mL，S=5.2，得出95%參考范圍為：（34.7±10.1）ng／mL。見表1。

表1 ELISA法對原代地鼠腎細胞蛋白質對照品進行協(xié)作標定的結果（ng／mL）Tab.1 Collaborative calibration of primary hamster kidney cell protein control by ELISA（ng／mL）

2.2 原代地鼠腎細胞蛋白質對照品均勻性 檢測結果經(jīng)統(tǒng)計學中的方差分析，根據(jù)自由度（15，32）及給定的顯著性水平α=0.05，由F表查得臨界值F0.05=2.02，經(jīng)統(tǒng)計學分析得均勻性檢驗的統(tǒng)計量F=0.50，由此得出F

2.3 原代地鼠腎細胞蛋白質對照品穩(wěn)定性 檢測結果經(jīng)統(tǒng)計學中的方差分析，根據(jù)自由度（3，8）及給定的顯著性水平α=0.05，由F表查得臨界值F0.05=4.07，經(jīng)統(tǒng)計學分析可得4℃穩(wěn)定性檢驗的統(tǒng)計量F1=0.94，25℃穩(wěn)定性檢驗的統(tǒng)計量F2=0.03，37℃穩(wěn)定性檢驗的統(tǒng)計量F3=0.59，比較得出F1

表2 原代地鼠腎細胞蛋白質對照品均勻性考察（pH）Tab.2 Uniformity of primary hamster kidney cell protein control（pH）

表3 原代地鼠腎細胞蛋白質對照品穩(wěn)定性考察（ng／mL）Tab.3 Stability of primary hamster kidney cell protein control（ng／mL）

3 討論

我國人用狂犬病疫苗（地鼠腎細胞）生產(chǎn)是以原代地鼠腎細胞為細胞基質，經(jīng)過研發(fā)之初后不斷的工藝優(yōu)化，現(xiàn)在比較固定的生產(chǎn)流程是細胞培養(yǎng)、病毒接種、病毒收獲液濃縮、滅活、純化、半成品配制及成品分裝等步驟［8］。疫苗成品中主要成分為病毒抗原，此外還有宿主細胞殘留蛋白，這些殘留蛋白可對人體產(chǎn)生致敏反應，因此宿主蛋白殘留量的控制顯得尤為重要。

目前我國人用狂犬病疫苗（地鼠腎細胞）蛋白質殘留量檢測采用ELISA法，限量標準為不高于24μg／劑［8］，為了定好標尺、嚴把質量關，我們研制了原代地鼠腎細胞蛋白質國家標準品［11］，為檢測實驗是否成立，保證檢驗檢測體系的準確、可靠，有必要建立原代地鼠腎細胞蛋白質對照品。

采用已有的檢驗檢測體系，引入北京生物制品研究所有限責任公司（原天壇生物）生產(chǎn)的2個不同批次的ELISA試劑盒進行檢測，用原代地鼠腎細胞蛋白質標準品（4.0μg／mL）繪制標準曲線（6.25～200 ng／mL），邀請4個實驗室進行協(xié)作標定，各參與單位每次實驗獨立檢測，標準品賦值每個實驗室提供不少于6個數(shù)據(jù)（2批試劑盒，每批3個數(shù)據(jù)），對采集到的24個數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析處理，最終原代地鼠腎細胞蛋白質對照品量值定為34.7 ng／mL，95%參考范圍為（34.7±10.1）ng／mL。

標準物質的特性應該是均勻的，即在規(guī)定的細分范圍內其特性保持不變。為了檢驗樣品是否均勻，通常隨機抽取一定數(shù)量的最小包裝單元，采用精密度高的實驗方法，對抽出的各樣品在同樣的實驗條件下進行測定，從而使各樣品間的差異完全由樣品的不均勻性反映出來。方差分析是用來統(tǒng)計檢驗均勻性的最常用方法，該方法是通過組間方差和組內方差的比較來判斷各組測量值之間有無系統(tǒng)性差異，如果兩者的比小于統(tǒng)計檢驗的臨界值，則認為樣品是均勻的［12］。用pH值來考察標準品的均勻性，根據(jù)自由度（15，32）及給定的顯著性水平α=0.05，可由F表查得臨界值F0.05=2.02，經(jīng)統(tǒng)計學分析可得均勻性檢驗的統(tǒng)計量F=0.50，由此得出F

標準物質的穩(wěn)定性包括短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性，長期穩(wěn)定性是長期監(jiān)測積累數(shù)據(jù)。短期穩(wěn)定性是指在運輸條件下標準物質在運輸過程中的穩(wěn)定性，根據(jù)制品性質放置不同溫度（一般放置4、25、37℃）、不同時間（1、2、3和4周），進行生物學活性測定，以評估其穩(wěn)定情況［13-14］。根據(jù)自由度（3，8）及給定的顯著性水平α=0.05，可由F表查得臨界值F0.05=4.07，經(jīng)統(tǒng)計學分析可得4℃穩(wěn)定性檢驗的統(tǒng)計量F1=0.94，25℃穩(wěn)定性檢驗的統(tǒng)計量F2=0.03，37℃穩(wěn)定性檢驗的統(tǒng)計量F3=0.59，比較得出F1

本研究成功建立了人用狂犬病疫苗（地鼠腎細胞）宿主蛋白殘留檢測（ELISA法）的原代地鼠腎細胞蛋白質對照品（批號為：250025-201901），已經(jīng)賦值并通過了均勻性和穩(wěn)定性檢驗考察，可用于人用狂犬病疫苗（地鼠腎細胞）宿主蛋白檢測體系，判斷實驗是否成立，將對以地鼠腎細胞為基質的人用狂犬病疫苗的質量控制起到重要作用。