石磊泰，李加，張月蘭，王輝，雷繼軍，郭中平，李玉華

1.中國食品藥品檢定研究院，北京102629；2.北京生物制品研究所有限責任公司，北京100176；3.武漢生物制品研究所有限責任公司，湖北 武漢430070；4.國家藥典委員會，北京100061

從1965年武漢生物制品研究所和蘭州生物制品研究所聯(lián)合中國藥品生物制品檢定所用北京株狂犬病病毒固定毒株，在原代地鼠腎細胞適應傳代，研制成功原代地鼠腎細胞培養(yǎng)的人用狂犬病滅活疫苗，至今為止，在我國已有50多年的使用歷史［1-3］。目前該類疫苗仍在市場流通，為我國狂犬病的預防做出了卓越的貢獻?？袢∈侵滤佬约膊?，全世界每年因其死亡約59 000人［4］，我國近年的狂犬病疫情雖有所緩解，但情況仍不容樂觀。我國人用狂犬病疫苗市場需求量較大，2015—2019年連續(xù)5年人用狂犬病疫苗（地鼠腎細胞）的批簽發(fā)量就分別達到了80萬、80萬、100萬、120萬和63萬人份［5］。狂犬病疫苗接種無禁忌癥，受種群體廣泛，因此其有效性和安全性就顯得尤為重要，而就安全性而言，疫苗中的雜質(zhì)控制值得關注。

宿主蛋白作為來源于細胞基質(zhì)的一類異源成分，可能誘導機體產(chǎn)生未知的免疫應答而影響疫苗的功效，也可能引起超敏反應或其他不良反應，有必要進行有效控制。雖然WHO的技術指導原則中未對宿主蛋白殘留量作出含量限定［6-7］，但我國藥品監(jiān)管機構早在《中國藥典》三部（2010版）中就明確了地鼠腎細胞蛋白質(zhì)殘留量的限量標準［8］，并建立了有效的檢測方法［9-10］，在人用狂犬病疫苗（地鼠腎細胞）的質(zhì)量控制中發(fā)揮了技術支撐和監(jiān)管的作用。

在不改變現(xiàn)有檢測方法的前提下，我們優(yōu)化了檢測體系，研制出原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)國家標準品［11］，替換試劑盒自帶標準品，確保了檢定結果的科學性和準確性。為了配合原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)國家標準品的合理、有效使用，有必要建立原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)國家對照品，以保證檢驗檢測體系的準確、可靠。本研究采用ELISA法，用原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)標準品（量值為4.0μg／mL）對原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)對照品進行協(xié)作標定賦值，并進行均勻性和穩(wěn)定性分析。

1 材料與方法

1.1 協(xié)作標定樣品 原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)標準品，批號為：250024-201901，經(jīng)中國食品藥品檢定研究院標準化委員會批準使用，量值為4.0μg／mL，凍干劑型，95%可信限為：（4.0±0.5）μg／mL，6支／實驗室；待標定原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)對照品，凍干劑型，6支／實驗室。

1.2 協(xié)作標定方案 由中國食品藥品檢定研究院設計協(xié)作標定方案并發(fā)放協(xié)作標定作業(yè)指導書，各實驗室使用統(tǒng)一的標準操作規(guī)范和統(tǒng)一的實驗記錄，采用原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)殘留量ELISA檢測試劑盒［由北京生物制品研究所有限責任公司（原天壇生物）提供，批號為：20190414和20190415］，用原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)標準品繪制標準曲線（6.25～200 ng／mL），計算原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)對照品含量。

1.3 數(shù)據(jù)匯總及結果分析 邀請4家實驗室進行協(xié)作標定，各參與單位每次實驗獨立檢測6次，涉及2個批次試劑盒，每批3個數(shù)據(jù)，中國食品藥品檢定研究院匯總各協(xié)作單位檢測結果，經(jīng)統(tǒng)計學軟件SPSS 20.0分析，計算原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)對照品的量值。

1.4 對照品均勻性和穩(wěn)定性分析

1.4.1 均勻性 對于均勻性好的樣品，當總體單元數(shù)大于500時，抽取單元數(shù)不小于15個的要求，該標準品物理檢查合格數(shù)為2 000支，均勻性檢驗抽取的數(shù)目為16支，采用pH值考察均勻性指標。

1.4.2 穩(wěn)定性 將樣品分別在4、25和37℃放置不同時間（1、2、3和4周），不同時間點取3支，于-20℃保存。待所有樣本放置結束后，采用統(tǒng)一的ELISA方法，將樣本用0.5 mL滅菌注射用水復溶，進行抗原含量檢測。

2 結果

2.1 原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)對照品協(xié)作標定結果數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果顯示，最終原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)對照品量值為34.7 ng／mL；95%參考范圍按95%可信限公式（x±1.96S）計算，其中x=34.7 ng／mL，S=5.2，得出95%參考范圍為：（34.7±10.1）ng／mL。見表1。

表1 ELISA法對原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)對照品進行協(xié)作標定的結果（ng／mL）Tab.1 Collaborative calibration of primary hamster kidney cell protein control by ELISA（ng／mL）

2.2 原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)對照品均勻性 檢測結果經(jīng)統(tǒng)計學中的方差分析，根據(jù)自由度（15，32）及給定的顯著性水平α=0.05，由F表查得臨界值F0.05=2.02，經(jīng)統(tǒng)計學分析得均勻性檢驗的統(tǒng)計量F=0.50，由此得出F

2.3 原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)對照品穩(wěn)定性 檢測結果經(jīng)統(tǒng)計學中的方差分析，根據(jù)自由度（3，8）及給定的顯著性水平α=0.05，由F表查得臨界值F0.05=4.07，經(jīng)統(tǒng)計學分析可得4℃穩(wěn)定性檢驗的統(tǒng)計量F1=0.94，25℃穩(wěn)定性檢驗的統(tǒng)計量F2=0.03，37℃穩(wěn)定性檢驗的統(tǒng)計量F3=0.59，比較得出F1

表2 原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)對照品均勻性考察（pH）Tab.2 Uniformity of primary hamster kidney cell protein control（pH）

表3 原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)對照品穩(wěn)定性考察（ng／mL）Tab.3 Stability of primary hamster kidney cell protein control（ng／mL）

3 討論

我國人用狂犬病疫苗（地鼠腎細胞）生產(chǎn)是以原代地鼠腎細胞為細胞基質(zhì)，經(jīng)過研發(fā)之初后不斷的工藝優(yōu)化，現(xiàn)在比較固定的生產(chǎn)流程是細胞培養(yǎng)、病毒接種、病毒收獲液濃縮、滅活、純化、半成品配制及成品分裝等步驟［8］。疫苗成品中主要成分為病毒抗原，此外還有宿主細胞殘留蛋白，這些殘留蛋白可對人體產(chǎn)生致敏反應，因此宿主蛋白殘留量的控制顯得尤為重要。

目前我國人用狂犬病疫苗（地鼠腎細胞）蛋白質(zhì)殘留量檢測采用ELISA法，限量標準為不高于24μg／劑［8］，為了定好標尺、嚴把質(zhì)量關，我們研制了原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)國家標準品［11］，為檢測實驗是否成立，保證檢驗檢測體系的準確、可靠，有必要建立原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)對照品。

采用已有的檢驗檢測體系，引入北京生物制品研究所有限責任公司（原天壇生物）生產(chǎn)的2個不同批次的ELISA試劑盒進行檢測，用原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)標準品（4.0μg／mL）繪制標準曲線（6.25～200 ng／mL），邀請4個實驗室進行協(xié)作標定，各參與單位每次實驗獨立檢測，標準品賦值每個實驗室提供不少于6個數(shù)據(jù)（2批試劑盒，每批3個數(shù)據(jù)），對采集到的24個數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析處理，最終原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)對照品量值定為34.7 ng／mL，95%參考范圍為（34.7±10.1）ng／mL。

標準物質(zhì)的特性應該是均勻的，即在規(guī)定的細分范圍內(nèi)其特性保持不變。為了檢驗樣品是否均勻，通常隨機抽取一定數(shù)量的最小包裝單元，采用精密度高的實驗方法，對抽出的各樣品在同樣的實驗條件下進行測定，從而使各樣品間的差異完全由樣品的不均勻性反映出來。方差分析是用來統(tǒng)計檢驗均勻性的最常用方法，該方法是通過組間方差和組內(nèi)方差的比較來判斷各組測量值之間有無系統(tǒng)性差異，如果兩者的比小于統(tǒng)計檢驗的臨界值，則認為樣品是均勻的［12］。用pH值來考察標準品的均勻性，根據(jù)自由度（15，32）及給定的顯著性水平α=0.05，可由F表查得臨界值F0.05=2.02，經(jīng)統(tǒng)計學分析可得均勻性檢驗的統(tǒng)計量F=0.50，由此得出F

標準物質(zhì)的穩(wěn)定性包括短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性，長期穩(wěn)定性是長期監(jiān)測積累數(shù)據(jù)。短期穩(wěn)定性是指在運輸條件下標準物質(zhì)在運輸過程中的穩(wěn)定性，根據(jù)制品性質(zhì)放置不同溫度（一般放置4、25、37℃）、不同時間（1、2、3和4周），進行生物學活性測定，以評估其穩(wěn)定情況［13-14］。根據(jù)自由度（3，8）及給定的顯著性水平α=0.05，可由F表查得臨界值F0.05=4.07，經(jīng)統(tǒng)計學分析可得4℃穩(wěn)定性檢驗的統(tǒng)計量F1=0.94，25℃穩(wěn)定性檢驗的統(tǒng)計量F2=0.03，37℃穩(wěn)定性檢驗的統(tǒng)計量F3=0.59，比較得出F1

本研究成功建立了人用狂犬病疫苗（地鼠腎細胞）宿主蛋白殘留檢測（ELISA法）的原代地鼠腎細胞蛋白質(zhì)對照品（批號為：250025-201901），已經(jīng)賦值并通過了均勻性和穩(wěn)定性檢驗考察，可用于人用狂犬病疫苗（地鼠腎細胞）宿主蛋白檢測體系，判斷實驗是否成立，將對以地鼠腎細胞為基質(zhì)的人用狂犬病疫苗的質(zhì)量控制起到重要作用。