樊雪，吳錚，王一平，李璇，周荔葆

遼寧成大生物股份有限公司研發(fā)部，遼寧沈陽110179

四價(jià)流感病毒裂解疫苗系用甲型和乙型流感病毒株（每型各兩種病毒株型）接種于雞胚培養(yǎng)適宜時(shí)間后，收獲病毒液，再經(jīng)病毒滅活、純化、裂解等工藝步驟后配制而成。在臨床上用于預(yù)防由這4種病毒株型導(dǎo)致的流行性感冒。在生物制品生產(chǎn)工藝過程中，常將Triton X-100作為裂解劑或滅活劑，而Triton X-100本身具有一定的刺激性，殘留的Triton X-100需在后續(xù)純化工藝步驟中去除［1-2］。在流感病毒裂解疫苗生產(chǎn)工藝過程中，加入了Triton X-100對病毒進(jìn)行裂解［3］，后續(xù)工藝中可能會(huì)有部分殘留，《中國藥典》三部（2015版）對其殘留量進(jìn)行了明確的規(guī)定［4］，因此，需對其工藝過程中的Triton X-100殘留量進(jìn)行檢測。《中國藥典》三部（2015版）“重組乙型肝炎疫苗（釀酒酵母）”項(xiàng)下的Triton X-100殘留量檢測采用的是比濁法，將標(biāo)準(zhǔn)品和供試品與苯酚反應(yīng)，生成具有一定濁度的復(fù)合物，其濃度與吸光度值正比［5］。但比濁法的專屬性、靈敏度、準(zhǔn)確度較差，要求供試品本身沒有濁度，否則將會(huì)干擾測定。而高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）具有較高的專屬性、靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度［6-7］。

本研究建立了適用于四價(jià)流感病毒裂解疫苗中Triton X-100殘留量檢測的HPLC法，對方法進(jìn)行驗(yàn)證，并與比濁法進(jìn)行對比［8］，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 疫苗原液 流感病毒裂解疫苗原液（批號(hào)：2018-1225、20181226、20181227）由遼寧成大生物股份有限公司制備。

1.2 主要試劑及儀器 甲醇（批號(hào)：126273）購自美國Fisher公司；Triton X-100（批號(hào)：100M01281V）購自美國Sigma公司；苯酚（批號(hào)：20160725）購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；高效液相色譜儀（LC-2010A）購自日本SHIMADZU公司；色譜柱BDS HYPERSIL C18（250 mm×4.6 mm，5μm）購自美國Thermo公司；紫外可見分光光度計(jì)（ultrospec 2100 pro）購自美國Amersham Biosciences公司。

1.3 HPLC法的建立及驗(yàn)證

1.3.1 色譜條件的篩選

1.3.1.1 流動(dòng)相比例的篩選 選擇流動(dòng)相水∶甲醇比例分別為30∶70、20∶80、10∶90，考察Triton X-100在色譜柱上的保留。

1.3.1.2 流速的篩選 選擇流速分別為1.0、1.2、1.4 mL／min，考察待測物保留行為。

1.3.1.3 進(jìn)樣量的篩選 選擇進(jìn)樣量分別為5、10、20μL，考察待測物保留行為。

1.3.2 溶液的配制

1.3.2.1 Triton X-100對照品儲(chǔ)備液 精密稱取Triton X-100對照品100 mg，放置于100 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容，得到濃度為1 000μg／mL的對照品儲(chǔ)備液。

1.3.2.2 工作溶液 精密量取1 000μg／mL的Triton X-100儲(chǔ)備液1、0.5、0.2、0.1 mL至10 mL容量瓶中，定容，得到濃度為100、50、20、10μg／mL的對照品工作溶液。精密量取10μg／mL的Triton X-100工作溶液5、2、1 mL至10 mL容量瓶中，定容，得到濃度為5、2、1μg／mL的對照品工作溶液。

1.3.3 方法的驗(yàn)證

1.3.3.1 系統(tǒng)適用性和專屬性 取10μg／mL的對照品溶液，按照確定的色譜條件進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，測定理論塔板數(shù)和分離度。同時(shí)記錄空白溶液和供試品溶液色譜圖。

1.3.3.2 線性及范圍 取2、5、10、20、50、100μg／mL的對照品工作溶液，按照確定的色譜條件進(jìn)樣，考察線性和范圍。以各樣品測得的峰面積（A）為縱坐標(biāo)，加入對照品溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

1.3.3.3 準(zhǔn)確性 精密量取供試品（批號(hào)：20181225）9份，每份1 mL，分別精密加入Triton X-100對照品，配制成8、10、12μg／mL的加標(biāo)樣品，每個(gè)濃度各3份，按照確定的色譜條件進(jìn)樣。計(jì)算回收率。

1.3.3.4 精密性 精密量取供試品（批號(hào)：20181225）6份，每份1 mL，精密加入Triton X-100對照品，配制成10μg／mL的加標(biāo)樣品，按照確定的色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算Triton X-100峰面積的RSD，驗(yàn)證方法的重復(fù)性。另一名試驗(yàn)員在第2天同法操作，驗(yàn)證方法的中間精密性。

1.3.3.5 定量限及檢測限 逐步稀釋10μg／mL的Triton X-100對照品溶液，按照確定的色譜條件進(jìn)樣，確定該方法的定量限及檢測限。

1.3.3.6 耐用性 考察色譜柱溫度（30±2）℃，流動(dòng)相流速（1.2±0.1）mL／min的耐用性。分別取10μg／mL的對照品工作液進(jìn)樣6次，計(jì)算RSD和相對誤差（RE）。

1.4 比濁法的驗(yàn)證

1.4.1 溶液的配制 取含量為100μg／mL的對照品工作溶液，配制成濃度為10、20、40、60、80μg／mL的工作溶液。

1.4.2 方法的步驟 參照《中國藥典》三部（2015版）“重組乙型肝炎疫苗（釀酒酵母）”項(xiàng)下檢測方法，取供試品2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，充分反應(yīng)后在340 nm波長處測定吸光度值。

1.4.3 方法的驗(yàn)證

1.4.3.1 線性和范圍 取10、20、40、60、80、100μg／mL對照品系列工作溶液2 mL于試管中，每個(gè)濃度取2份，每管分別加入5%苯酚溶液1 mL，迅速渦旋振蕩，室溫放置15 min。以生理鹽水作為空白對照，在波長340 nm處測定吸光度值。以對照品溶液中Triton X-100的含量對其吸光度值做線性回歸，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

1.4.3.2 準(zhǔn)確性 精密量取供試品（批號(hào)：20181225）9份，分別精密加入低、中、高3個(gè)濃度的Triton X-100對照品工作溶液，配制成20、40、80μg／mL的加標(biāo)樣品，每個(gè)濃度各3份，按照1.4.2.1項(xiàng)步驟進(jìn)行分析。并計(jì)算回收率。

1.4.3.3 精密性 精密量取供試品（批號(hào)：20181225）6份，每份2 mL，按照1.4.2.1項(xiàng)步驟進(jìn)行分析。將供試品的吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中進(jìn)行計(jì)算得到樣品含量，并計(jì)算RSD，驗(yàn)證方法的重復(fù)性。另一名試驗(yàn)員在隔天同法操作，精密量取供試品6份，計(jì)算RSD，驗(yàn)證方法的中間精密性。

1.4.3.4 定量限 將10μg／mL的定量限工作溶液按照1.4.2.1項(xiàng)步驟進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，計(jì)算RSD。

1.5 兩種方法的對比

1.5.1 方法學(xué)對比 將HPLC法與比濁法的主要方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行對比。

1.5.2 供試品Triton X-100殘留量測定結(jié)果對比取流感病毒裂解疫苗原液3批供試品，按照確定的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算Triton X-100殘留量。同時(shí)將這3批供試品采用比濁法，按照

1.4.2.1 項(xiàng)步驟進(jìn)行分析，測定Triton X-100殘留量。

2 結(jié)果

2.1 HPLC法的建立及驗(yàn)證

2.1.1 色譜條件的確定

2.1.1.1 流動(dòng)相比例 甲醇占70%時(shí)，難以將待測物洗脫下來，且色譜峰寬，柱效低；甲醇占80%和90%時(shí)，待測物洗脫峰型良好，對稱性和柱效符合分析檢測的要求。綜合考慮節(jié)約有機(jī)相的使用等因素，最終選擇流動(dòng)相比例為水∶甲醇=20∶80。

2.1.1.2 流速 流速為1.0 mL／min時(shí)，色譜峰展寬，對稱性和柱效不理想；流速為1.2 mL／min時(shí)，待測物洗脫峰對稱性良好，對稱性和柱效符合分析檢測的要求；流速為1.4 mL／min時(shí)，柱壓較高，可能影響色譜柱和色譜儀的使用壽命。最終選擇流速為1.2mL／min。

2.1.1.3 進(jìn)樣量 進(jìn)樣量為5μL時(shí)，靈敏度低，檢測限和定量限不能滿足要求；進(jìn)樣量為20μL時(shí)，由于待測物黏度大，造成色譜峰難以洗脫，峰拖尾。最終選擇進(jìn)樣量為10μL，符合定量檢測的要求。

2.1.1.4 色譜條件 采用ODS C18反相色譜柱，型號(hào)規(guī)格為：BDS HYPERSIL C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：超純水∶甲醇=20∶80；流速：1.2 mL／min；檢測波長：230 nm；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃；運(yùn)行時(shí)間：12 min。

2.1.2 方法的驗(yàn)證

2.1.2.1 系統(tǒng)適用性和專屬性 空白溶液、對照品溶液和供試品溶液的色譜圖見圖1。Triton X-100色譜峰的理論塔板數(shù)不低于3 000，分離度大于1.5，表明雜質(zhì)對測定無干擾，方法的系統(tǒng)適用性和專屬性良好。

圖1 空白溶劑（A）、對照品溶液（B）、供試品溶液（C）的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC profile of blank solvent（A），control solution（B）and test sample solution（C）

2.1.2.2線性和范圍 回歸方程為Y=6 478.21X+2 449.11，r=0.999 9。Triton X-100在2～100μg／mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.1.2.3 準(zhǔn)確性 不同加標(biāo)樣品的回收率均在95%～105%之間，見表1。表明該方法準(zhǔn)確性良好。

表1 HPLC準(zhǔn)確性驗(yàn)證結(jié)果Tab.1 Verification for accuracy of HPLC

2.1.2.4 精密性 重復(fù)性和中間精密性試驗(yàn)的RSD分別為2.8%和3.9%，均小于5%，表明該方法重復(fù)性和中間精密性良好。

2.1.2.5 定量限及檢測限 測得Triton X-100的定量限為2μg／mL（S／N＞10），檢測限為1μg／mL（S／N＞3），RSD分別為3.5%和5.2%，均小于10%。

2.1.2.6 耐用性 經(jīng)計(jì)算，色譜柱溫度（30±2）℃，流動(dòng)相流速（1.2±0.1）mL／min的RSD均小于5%，RE在90%～110%之間，見表2。表明該方法耐用性良好。

表2 HPLC耐用性驗(yàn)證結(jié)果（%）Tab.2 Verification for durability of HPLC（%）

2.2 比濁法的驗(yàn)證

2.2.1 線性和范圍 回歸方程為Y=0.011 8X+0.1542，r=0.996 5。Triton X-100在10～100μg／mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2.2 準(zhǔn)確性 不同加標(biāo)濃度樣品的回收率在85%～115%之間，見表3。表明該方法準(zhǔn)確性良好。

表3 比濁法準(zhǔn)確性驗(yàn)證結(jié)果（%）Tab.3 Verification for accuracy of turbidimetric method（%）

2.2.3 精密性 重復(fù)性和中間精密性試驗(yàn)的RSD分別為5.8%和7.2%，均小于10%，表明該方法重復(fù)性和中間精密性良好。

2.2.4 定量限6次平行試驗(yàn)的RSD為10.2%，小于15%。

2.3 兩種方法的對比

2.3.1 方法學(xué)對比結(jié)果HPLC法方法學(xué)的主要驗(yàn)證結(jié)果均優(yōu)于比濁法，見表4。

表4 HPLC法與比濁法方法學(xué)主要驗(yàn)證結(jié)果對比Tab.4 Methodological verification of HPLC and turbidimetric method

2.3.2 供試品Triton X-100殘留量測定結(jié)果對比HPLC法測定3批供試品Triton X-100殘留量均＜2μg／mL，比濁法測定3批供試品Triton X-100殘留量均＜10μg／mL。

3 討論

四價(jià)流感病毒裂解疫苗采用雞胚培養(yǎng)，Triton X-100是適合用于裂解流感病毒的裂解劑，廣泛應(yīng)用于市售流感病毒裂解疫苗的裂解工藝中［9-12］。而Triton X-100是一種非離子表面活性劑，其濃度達(dá)到0.1%時(shí)能破壞生物膜，使細(xì)胞溶解破壞，還可能引起人體過敏反應(yīng)［13］，因此對其殘留量應(yīng)嚴(yán)格控制。四價(jià)流感病毒裂解疫苗的抗原為血凝素，其成分中蛋白質(zhì)含量較高，對Triton X-100殘留量的檢測可能產(chǎn)生干擾，因此本實(shí)驗(yàn)考察了不同方法檢測Triton X-100的適用性。

由于Triton X-100的黏度大，對反相色譜柱吸附較大難以洗脫，易造成色譜峰展寬，因此本實(shí)驗(yàn)考察了HPLC法的流動(dòng)相比例（水∶甲醇=30∶70、20∶80、10∶90）、流速（1.0、1.2、1.4 mL／min）、進(jìn)樣量（5、10、20μL）等條件。綜合考慮色譜柱的柱壓力和使用壽命，最終選擇了超純水∶甲醇=20∶80、流速1.2 mL／min、進(jìn)樣量10μL、檢測波長230 nm為最佳條件，在此條件下，色譜的柱效較高，能夠滿足定量分析的需要。

將相同樣品采用HPLC法和比濁法進(jìn)行對比測定，結(jié)果顯示，HPLC法的專屬性好，線性良好（r=0.999 9）、準(zhǔn)確性較高（回收率99.3%）、精密性良好（RSD<5%），各項(xiàng)驗(yàn)證結(jié)果均優(yōu)于比濁法。且當(dāng)供試品本身蛋白含量較高，有乳濁色時(shí)，比濁法不適用。比濁法的定量限為10μg／mL，HPLC法的定量限為2μg／mL。因此，HPLC法具有更大的優(yōu)勢。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的測定流感病毒裂解疫苗中Triton X-100殘留量的HPLC法，具有良好的專屬性、線性、準(zhǔn)確性、精密性和耐用性，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，適用于流感病毒裂解疫苗中Triton X-100殘留量的檢測。