李曉瑞，李興航綜述，嚴漢池審校

1.天津大學生命科學學院，天津310110；2.武漢生物制品研究所，湖北 武漢430207

2020年1月12日，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）正式將引起新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）的病原體命名為“2019新型冠狀病毒”（2019 novel corona virus，2019-nCoV），國際病毒分類學委員會命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）。SARS-CoV-2導致的COVID-19大流行給人類健康和全球經濟造成了重大損失且，尚未發(fā)現(xiàn)特效的抗病毒藥物，因此，接種疫苗成為有效防治疾病的策略。鑒于SARSCoV-2與2003年暴發(fā)的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory symptom coronavirus，SARSCoV）和2012年暴發(fā)的中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle Eastern respiratory syndrome-related coronavirus，MERS-CoV）均屬于冠狀病毒［1］，因此，在新型冠狀病毒疫苗（簡稱新冠疫苗）的研究中，結合了研發(fā)SARS-CoV和MERS-CoV疫苗的經驗，迅速提出了滅活疫苗、重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗、核酸疫苗和減毒活疫苗這5大新冠疫苗的主要研究路線，同時也在嘗試運用反向疫苗學和疫苗組學等新興概念進行疫苗的設計［2-3］。本文對目前正在研發(fā)和臨床試驗的各類SARS-CoV-2疫苗以及研發(fā)所面臨的挑戰(zhàn)作一綜述。

1 SARS-CoV-2簡介

SARS-CoV-2屬于β屬冠狀病毒（Betacoronavirus Coronavirdae，β-CoV），是一種有包膜、基因組為線性單股正鏈的RNA病毒，基因組編碼4種結構蛋白：刺突糖蛋白（spike，S）、包膜蛋白（envelope，E）、膜糖蛋白（membrane glycoprotein，M）和核衣殼蛋白（nucleocapsid，N），其中S蛋白形成三聚體結構，負責識別并結合宿主細胞表面的受體，是一種主要的保護性抗原，可誘導機體產生高效價中和抗體（neutralizing antibody，Nab），在防止病毒感染過程中發(fā)揮重要作用［1］。S蛋白直接與宿主細胞表面受體血管緊張素轉換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）結合進入上皮細胞引起感染，促進病毒增殖［4-6］，目前，大多數(shù)新冠疫苗的設計正是針對S蛋白。

2 新冠疫苗的研究策略

自從SARS-CoV-2的基因序列公布以來，全世界的科研人員均在加快速度研發(fā)針對COVID-19的疫苗，這些候選疫苗的類型、研究進展、優(yōu)勢以及存在的問題見表1。

2.1 滅活疫苗（inactivated virus vaccine） 滅活疫苗通常是選用免疫原性強的病原體，經大量培養(yǎng)后，采用理化方法進行滅活而制成的疫苗。最經典的滅活疫苗的研究途徑是先對病毒滅活處理后進行多次純化，如脊髓灰質炎和流感疫苗，其安全性和有效性已得到廣泛認可［7-8］。針對SARS的滅活疫苗，在恒河猴、雪豹模型中能產生高滴度中和抗體［9-10］，SARS滅活疫苗Ⅰ期臨床試驗表明，其對人體安全有效，耐受性強［11］。2020年4月13日，國藥集團中國生物技術股份有限公司（簡稱國藥中國生物）武漢生物制品研究所SARS-CoV-2滅活疫苗進入臨床試驗，該疫苗是世界上第一支進入臨床的滅活疫苗。2020年6月16日宣布了該疫苗的揭盲結果，Ⅰ／Ⅱ期臨床研究受試者已全部完成2針次接種，疫苗接種后安全、有效，受試者均產生了高滴度抗體，18～59歲組中按照0，14 d和0，21 d程序接種兩劑后，中和抗體陽轉率達97.6%；按照0，28 d程序接種兩劑后，中和抗體陽轉率達100%［12］。另一個值得關注的是北京科興中維生物技術有限公司（簡稱科興中維）研制的新冠滅活疫苗克爾來福，GAO等［1］發(fā)表了SARS-CoV-2滅活病毒疫苗（PiCo Vacc）臨床前研究的最新成果，PiCoVacc可在小鼠、大鼠和恒河猴動物模型中誘導出SARS-CoV-2特異性中和抗體，證明了PiCoVacc在恒河猴中的安全性和有效性。2020年6月14日公布了該疫苗的Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗結果，初步顯示具有良好的安全性和免疫原性，科興中維與巴西展開合作，雙方將在巴西共同開展Ⅲ期臨床試驗［13-14］。此外，國藥中國生物北京生物制品研究所、中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所研制的SARS-CoV-2滅活疫苗也均在開展Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗。

2.2 重組蛋白疫苗（recombinant protein vaccine）重組蛋白疫苗是將某種病毒的目的抗原基因構建在表達載體上，將已構建的表達蛋白載體轉化到細菌、酵母或哺乳動物或昆蟲細胞中，在一定的誘導條件下，表達出大量的抗原蛋白，純化后制備的疫苗。該類疫苗目前有兩種研究方案：針對S蛋白的疫苗和病毒顆粒樣蛋白（virus-like particles，VLPs）［15-16］。S蛋白是SARSCoV-2與人體細胞上ACE2受體結合的部位，可在體外表達出S蛋白，再用于疫苗的制備，如美國Novavax公司研發(fā)的重組S蛋白納米顆粒疫苗。VLPs是通過病毒外殼模擬冠狀病毒的結構來誘導免疫應答。美國GeoVax公司采用改良痘病毒（modified vaccinia virus Ankara，MVA）作為疫苗表達載體，選擇SARSCoV-2的S蛋白作為核心抗原，共表達蛋白并協(xié)助VLPs的組裝，利用VLPs激活免疫應答，目前正準備進行動物模型試驗以及Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗［17］。

2.3 病毒載體疫苗（viral vector-based vaccine）病毒載體疫苗是將病毒作為載體，利用基因工程技術將外源保護性抗原基因插入病毒的基因組內，再轉染細胞獲得重組病毒，它們能在機體內表達目的蛋白，并誘導產生相應的抗體，進而獲得免疫力。常用的病毒載體有腺病毒（adenvirus）、痘病毒（proxvirus）、皰疹病毒（herpes simples virus，HSV）等。2017年，康希諾生物股份有限公司（簡稱康希諾）與軍事科學院軍事醫(yī)學研究院陳薇院士團隊以腺病毒為載體研發(fā)了埃博拉病毒疫苗（Ad5-EBOV）［18］。聯(lián)合研發(fā)的以腺病毒為載體的重組SARS-CoV-2疫苗（Ad5-nCoV）于2020年3月17日獲批進入Ⅰ期臨床試驗，108名志愿者已完成接種，2020年4月9日招募Ⅱ期臨床試驗志愿者［19-21］。2020年5月22日，該團隊發(fā)布了Ad5-nCoVⅠ期臨床試驗數(shù)據，108名接種者全部有顯著的細胞免疫反應，表明Ad5-nCoV安全性和耐受性良好，能在人體內產生抗SARS-CoV-2的免疫應答。接種單劑量Ad5-nCoV第14天后，中和抗體滴度明顯增長，第28天后，抗體幾何平均滴度超過接種前4倍。特異性T細胞反應也達到峰值，表明Ad5-nCoV能夠誘導高效的體液和細胞免疫［22］。

2.4 核酸疫苗（nucleic-acid vaccine）核酸疫苗包括DNA和mRNA疫苗。DNA疫苗是直接將編碼病毒抗原基因的DNA序列（常用質粒）注入到宿主內，使病毒的抗原蛋白在宿主體內表達以誘導體液和細胞免疫。研發(fā)機構可根據SARS-CoV-2的基因序列直接生產疫苗。mRNA疫苗是將病毒抗原的mRNA制為疫苗，注入宿主內的mRNA可表達病毒的抗原蛋白，從而誘發(fā)機體產生免疫應答。核酸疫苗由于本身獨特的優(yōu)勢，如在體內可持續(xù)性表達，可誘導體液和細胞免疫，維持時間長，是目前熱門的新冠疫苗研發(fā)方向。

2020年3月16日，美國Moderna公司研發(fā)的COVID-19疫苗（mRNA疫苗，mRNA-1273）進行Ⅰ期臨床試驗的申請［23］。2020年5月18日，Moderna mRNA-1273在Ⅰ期臨床試驗顯示出一定的安全性和免疫原性，18～55歲受試者在注射25、100μg mRNA-1273后，體內產生了新冠抗體，抗體水平與疫苗劑量相關，其中2個劑量水平的8名志愿者達到或超過了恢復期血清中常見的中和抗體滴度。第2針接種14 d后，25μg劑量組志愿者體內抗體水平與病毒感染患者康復后抗體水平相當，而100μg劑量組抗體水平顯著高于康復感染患者。Moderna公司已開始準備mRNA-1273的Ⅱ／Ⅲ期臨床試驗［24-26］。對美國INOVIO研發(fā)的DNA疫苗（INO-4800）已進行動物試驗。經INO-4800免疫后，小鼠和豚鼠可產生能中和S蛋白的中和抗體。INO-4800在臨床前模型中顯示能產生有效的中和抗體和T細胞免疫應答［27］。

2.5 減毒活疫苗（live attenuated vaccine） 該路線是將病毒進行減毒后制成疫苗。LAM等［28］發(fā)現(xiàn)，SARSCoV-2與穿山甲體內的某個冠狀病毒RBD氨基酸序列相似性高達97.4%，研究者希望從動物冠狀病毒中找到具有交叉保護作用，同時對人無致病性的毒株，作為新冠疫苗候選株進行后續(xù)研發(fā)。2020年6月18日，美國Codagenix宣布與印度血清研究所合作研發(fā)的減毒活疫苗CDX-005目前正進行動物安全性和有效性試驗，與SARS-CoV-2相比，其毒性明顯減弱，預計7月初將獲得臨床前數(shù)據［29］。

此外還有一種基于流感病毒載體的研究策略，香港大學的研究者基于DelNS1流感疫苗系統(tǒng)，結合反向遺傳學技術，在DelNS1系統(tǒng)表達外源抗原，并已成功研制出MERS疫苗（DelNS1-MERS-CoV）［30］。這種DelNS1疫苗仍具備完整的流感病毒顆粒，帶有普通流感病毒的表面蛋白，但能同時在NS1上表達冠狀病毒S蛋白抗原，實驗結果表明，此系統(tǒng)能夠有效表達MERS-CoV RBD或N蛋白［31］?？紤]到冠狀病毒RBD功能的相似性，研究者提出可利用此平臺快速研制DelNS1-2019nCoV疫苗［32］。

2.6 利用反向遺傳學和疫苗組學的研究策略 反向疫苗學是從全基因水平來篩選具有保護性免疫反應的候選抗原的疫苗研發(fā)策略。其以微生物基因組為平臺，對毒力因子、外膜抗原、侵襲及毒力相關抗原等蛋白基因進行高通量克隆、表達，純化出重組蛋白，再對純化后的抗原進行體內、體外評價，篩選出保護性抗原，進行疫苗研究［33-34］。近日，ONG等［35］使用Vaxign反向疫苗學工具以及新開發(fā)的Vaxignl-ML機器學習工具用于預測COVID-19候選疫苗。除了常用的S蛋白外，非結構蛋白3（non-structural protein 3，Nsp3）目前尚未在任何冠狀病毒疫苗研究中作為候選靶標。Nsp3在SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERSCoV中的保守性遠高于感染人和其他動物的15種冠狀病毒。并提出含有結構蛋白（structural protein，Sp）和非結構蛋白（Nsp）的“p-u002FNsp混合疫苗”。

表1 新冠疫苗的類型、研究進展、優(yōu)勢及存在的問題Tab.1 Type，progress，advantage and problem in development of 2019-nCoV vaccine

3 新冠疫苗的展望與挑戰(zhàn)

新疫苗的安全和有效仍是研發(fā)的第一位，但同時存在一些挑戰(zhàn)。首先是常出現(xiàn)在冠狀病毒疫苗的ADE，ADE會在接種疫苗后加重病毒感染，中和抗體水平越低時感染越嚴重［37-39］。有研究表明，SARS、HIV和埃博拉病毒（Ebola virus，EV）會出現(xiàn)ADE現(xiàn)象［39-41］，COVID-19是否存在ADE效應暫時尚無明確報道。

對于核酸疫苗而言，DNA疫苗的缺點在于需要特殊的接種設備，且外源性DNA可能會與自身細胞的DNA整合，因此，DNA疫苗的安全性值得關注［42］。mRNA疫苗不穩(wěn)定，易降解，且mRNA能否順利進入宿主細胞，產生具有免疫原性的目的蛋白，也是一個關鍵問題［43］。

SARS-CoV-2的變異情況也備受關注，KORBER等［44］研究發(fā)現(xiàn)了S蛋白突變，第614位的天冬氨酸（D614）突變成甘氨酸（G614），G614的傳染性更強。自2020年3月以來，G164已成為全球主要的流行毒株，所占比例持續(xù)增加。突變后其傳播能力增強，感染后機體內病毒載量增加，而毒力并未發(fā)生明顯變化，類似的突變是否會對疫苗的有效性產生影響還亟待研究，需密切關注其突變情況，尤其是RBD序列的變異情況。最后，新冠疫苗的研發(fā)多數(shù)已進入Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗，證實了疫苗的安全性，且有一定的免疫原性，在國內疫情大體控制的情況下，如何合理設計與開展Ⅲ期臨床試驗以及新型疫苗的可獲得性，包括疫苗的成本和獲得途徑，能否迅速規(guī)?；a等，均是所要面臨的挑戰(zhàn)。

SARS-CoV-2全球大暴發(fā)影響了數(shù)十億人的正常生活。帝國理工學院的FERGUSON等［45］建模表明，如無特效疫苗出現(xiàn)，封城、社交隔離與社會的解封將會持續(xù)循環(huán)下去。因此，研發(fā)針對COVID-19的疫苗和特效藥物是唯一有效的方法，對預防病毒感染和疫情防控具有重要意義。