王瑞璇，張莉*，周霞，殷蘭蘭，王政軍

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 海都學(xué)院，山東 萊陽 265200；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266109)

果醋是以水果為主要原料，通過現(xiàn)代生物技術(shù)釀造而成的一種營養(yǎng)豐富的酸性調(diào)味品或飲料[1-2]。目前果蔬醋類占食醋總產(chǎn)值的1/3[3]，其中含有豐富的醋酸、維生素、氨基酸等，集調(diào)味、營養(yǎng)和保健作用于一體[4-5]。近幾年國內(nèi)果醋產(chǎn)品雖日益增多，但市售仍以傳統(tǒng)蘋果醋等為主，蔬菜制成的新型果醋極少。

芋頭作為一種不可或缺的蔬菜兼糧食作物，有著較高的營養(yǎng)和藥用功效；其淀粉顆粒是馬鈴薯淀粉的1/10，消化率可達98%以上[6]。芋頭塊莖富含淀粉和多種對人體有益的礦物質(zhì)及維生素；此外，芋頭還含有降血糖和清除膽固醇作用的粘液蛋白，該蛋白被人體吸收后能產(chǎn)生免疫球蛋白，可提高人體的抵抗力。蓮藕營養(yǎng)價值豐富，含有碳水化合物、多酚、氨基酸、卵磷脂、膳食纖維等[7]，在加快人體新陳代謝和改善人體皮膚狀態(tài)方面的功效極其顯著。目前，芋頭蓮藕復(fù)合醋的研發(fā)還是空白。本研究利用萊陽特產(chǎn)萊陽孤芋和蓮藕榨汁發(fā)酵制醋，獲得的芋頭蓮藕復(fù)合醋既可豐富果醋的種類，為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的參考，又為芋頭和蓮藕的深加工拓寬了渠道。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮芋頭(萊陽孤芋)、蓮藕：購于萊陽市農(nóng)貿(mào)市場；安琪果酒專用酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；α-淀粉酶、糖化酶：河南萬邦實業(yè)有限公司；醋酸菌：成都市調(diào)味品研究所；殼聚糖：山東旭東生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-25BM06A攪拌機 美的集團；水浴鍋 龍口市先科儀器有限公司；糖度計 杭州恒儀儀表科技有限公司；酒精計 廈門雄發(fā)儀器儀表有限公司；YP1002N電子天平 上海天美天平儀器公司；恒溫振蕩培養(yǎng)器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

芋頭和蓮藕預(yù)處理→榨汁→液化→糖化→冷卻→過濾澄清→酒精發(fā)酵(接種酵母菌)→滅菌→過濾澄清→冷卻→醋酸發(fā)酵(接種醋酸菌)→過濾澄清→滅菌→總酸測定→成品。

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 原料預(yù)處理

將成熟、新鮮、無腐爛的芋頭和蓮藕分別洗凈、去皮、切塊并榨汁(料水比為3∶1)。

1.3.2.2 液化與糖化

在芋頭蓮藕混合汁中加入0.25% α-淀粉酶，在水浴鍋中進行液化，溫度為95 ℃，時間為30 min。將液化后的混合汁降溫至65 ℃左右，加入0.3%的糖化酶，調(diào)節(jié)pH為5.3，于水浴鍋中糖化60 min。

1.3.2.3 酒精發(fā)酵

將糖化完全的糖化醪液降溫至30 ℃，用300目的濾布進行過濾，調(diào)整濾液的糖度，將每100 mL濾液裝入250 mL的三角瓶內(nèi)(裝液量為40%)[8]，接入活化的果酒專用酵母，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，以28.5 ℃、120 r/min的轉(zhuǎn)速進行酒精發(fā)酵3 d。

1.3.2.4 醋酸發(fā)酵

將酒精發(fā)酵后的發(fā)酵液在85 ℃的水浴中進行15 min滅菌處理[9]，然后冷卻至室溫，使用濾布(300目)過濾，調(diào)節(jié)發(fā)酵液的酒精含量、初始pH值、發(fā)酵溫度，將醋酸菌接入，然后放進恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，在30 ℃下以120 r/min的轉(zhuǎn)速進行振蕩培養(yǎng)，使醋酸菌發(fā)酵。

1.3.2.5 滅菌

該試驗的滅菌步驟均為：放入立式壓力蒸汽滅菌器，95 ℃，30 min，防止高溫環(huán)境使其發(fā)生褐變。

1.3.2.6 澄清

利用1%的殼聚糖對發(fā)酵得到的醋液進行澄清，使用量占醋液總質(zhì)量的0.5%，靜置1.5 h[10-11]。

1.3.3 芋頭蓮藕汁最適配比的探索

在芋頭汁∶蓮藕汁分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3 (V/V)的條件下，將混合汁滅菌后接入0.3%活化后的酵母，調(diào)整初始糖度為16%，在酒精度為8%的條件下進行酒精發(fā)酵3 d，再接種 7%的醋酸菌，醋酸發(fā)酵8 d，并通過感官評價指標(biāo)確定芋頭汁與蓮藕汁的最佳配比[12]。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 初始糖度對芋頭蓮藕復(fù)合醋總酸的影響

在初始糖度分別為12%、14%、16%、18%、20%的條件下，將芋頭蓮藕混合汁酒精發(fā)酵3 d，之后接入7%的醋酸菌進行8 d的醋酸發(fā)酵，測定其總酸含量。

1.3.4.2 初始酒精度對芋頭蓮藕復(fù)合醋總酸的影響

以初始糖度為16%進行3 d的酒精發(fā)酵，調(diào)節(jié)初始酒精度分別為6%、7%、8%、9%、10%，接入7%醋酸菌進行8 d的醋酸發(fā)酵，測定其總酸含量。

1.3.4.3 醋酸菌接種量對芋頭蓮藕復(fù)合醋總酸的影響

以初始糖度為16%進行3 d的酒精發(fā)酵，調(diào)節(jié)酒精度為8%，分別接入3%、5%、7%、9%、11%的醋酸菌進行8 d的醋酸發(fā)酵，測定其總酸含量。

1.3.4.4 發(fā)酵時間對芋頭蓮藕復(fù)合醋總酸的影響

以初始糖度為16%進行3 d的酒精發(fā)酵，調(diào)節(jié)酒精度為8%，接入7%的醋酸菌，分別以2，4，6，8，10 d進行醋酸發(fā)酵，測定其總酸含量。

以上試驗發(fā)酵階段均采用恒溫振蕩培養(yǎng)箱(酒精發(fā)酵28.5 ℃、醋酸發(fā)酵30 ℃)，以120 r/min的轉(zhuǎn)速進行發(fā)酵培養(yǎng)，在試驗過程中測定總酸。

1.3.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

選擇對芋頭蓮藕復(fù)合醋影響最大的醋酸菌接種量、初始酒精度、發(fā)酵時間為響應(yīng)面分析的3個因素，響應(yīng)值為總酸，進行三因素三水平的試驗設(shè)計，因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平Table 1 The factors and levels of response surface analysis

1.3.6 指標(biāo)測定

糖度的測定：手持糖度計法；

酒精度的測定：酒精計法；

總酸測定：酸堿滴定法(以醋酸計，參照GB/T 12456-2008標(biāo)準(zhǔn))；

芋頭蓮藕復(fù)合醋的感官質(zhì)量：選擇色澤、滋味和氣味、組織狀態(tài)、雜質(zhì)4個方面進行感官評價。優(yōu)質(zhì)復(fù)合醋:顏色淡棕，醋香馥郁，酸味協(xié)調(diào)，無異味，透明澄清，無肉眼可見雜質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芋頭汁和蓮藕汁最佳配比的確定

在酒精和醋酸的恒定發(fā)酵條件下，對不同比混合均勻的芋頭汁和蓮藕汁發(fā)酵得到的果醋進行感官評價，結(jié)果見表2。

表2 芋頭汁和蓮藕汁最適配比獲得復(fù)合醋的感官評價Table 2 The sensory evaluation of compound vinegar at the optimal ratio of taro juice and lotus root juice

由表2可知，當(dāng)芋頭汁與蓮藕汁的比例為1∶2(V/V)時，發(fā)酵得到的果醋為淡棕色，酸味柔和，香氣濃郁協(xié)調(diào)，感官評價最優(yōu)，為最佳配比。

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 初始糖度對芋頭蓮藕復(fù)合醋總酸的影響

由圖1可知，初始糖度對芋頭蓮藕復(fù)合醋的總酸產(chǎn)生有一定影響，在其他發(fā)酵條件不變的情況下，當(dāng)初始糖度為12%～14%時，隨著初始糖度升高，總酸含量呈現(xiàn)上升趨勢；在初始糖度為16%時，復(fù)合醋的總酸達到最大值；當(dāng)初始糖度為18%～20%時，總酸含量沒有繼續(xù)升高，反而呈現(xiàn)輕微下降趨勢，但總體變化較小。這是由于過高的初始糖度抑制了酵母菌的生長，使得酒精積累下降，導(dǎo)致最終醋酸發(fā)酵產(chǎn)生的總酸含量不高。綜上所述，最適初始糖度為16%。

圖1 初始糖度對芋頭蓮藕復(fù)合醋總酸的影響Fig.1 Effect of initial sugar content on total acid of taro and lotus root compound vinegar

2.2.2 初始酒精度對芋頭蓮藕復(fù)合醋總酸的影響

由圖2可知，初始酒精度是芋頭蓮藕復(fù)合醋總酸含量的重要影響因素[13]，隨著初始酒精度的增大，最終獲取的總酸也會增多，但是當(dāng)酒精度為8%時，發(fā)酵得到的總酸含量最高。這是因為在相對較低的酒精度條件下，醋酸菌的代謝物質(zhì)會相應(yīng)地降低；如果酒精度相對比較高，會導(dǎo)致醋酸菌的活力受到較大的限制，進而使得總酸含量下降，初始酒精度應(yīng)該控制在合理的范圍內(nèi)[14]，綜上所述，最佳初始酒精度選擇8%。

圖2 初始酒精度對芋頭蓮藕復(fù)合醋總酸的影響Fig.2 Effect of initial alcohol content on total acid of taro and lotus root compound vinegar

2.2.3 醋酸菌接種量對芋頭蓮藕復(fù)合醋總酸的影響

由圖3可知，復(fù)合醋的總酸含量受醋酸菌接種量的影響較大，但醋酸菌接種量過大也可降低總酸的產(chǎn)量，對醋酸發(fā)酵起到相反作用。發(fā)酵液中總酸含量隨著醋酸菌接種量的升高呈增大趨勢，當(dāng)接種量達到7%時，復(fù)合醋中的總酸含量達到最高。當(dāng)接種量超過7%繼續(xù)增加時，發(fā)酵得到的總酸反而減少。這可能是因為醋酸菌量較少時，在短時間內(nèi)無法利用過多的乙醇；隨著醋酸菌增多，該菌產(chǎn)生的有害代謝物逐漸增多，容易使細胞出現(xiàn)老化和發(fā)生自溶，導(dǎo)致得到的總酸量降低[15]。因此，選擇7%為醋酸菌的最佳接種量。

圖3 醋酸菌接種量對芋頭蓮藕復(fù)合醋總酸的影響Fig.3 Effect of acetic acid bacteria inoculation amount on total acid of taro and lotus root compound vinegar

2.2.4 發(fā)酵時間對芋頭蓮藕復(fù)合醋總酸的影響

由圖4可知，發(fā)酵初期，復(fù)合醋的總酸含量增長較快，呈直線式上升；當(dāng)發(fā)酵時間達到8 d時，復(fù)合醋的總酸量達到峰值，發(fā)酵天數(shù)繼續(xù)增加，總酸量又稍微下降。這是因為在初期階段，醋酸菌的數(shù)量比較少，隨著發(fā)酵逐步深入進行，在醋酸菌數(shù)量達到一定的規(guī)模時，會導(dǎo)致其醋酸形成的速度逐步加快；當(dāng)發(fā)酵進入到最后的階段，醋酸菌能利用的乙醇量逐漸降低，從而產(chǎn)生的乙酸與乙酸揮發(fā)達到平衡狀態(tài)，復(fù)合醋的總酸度達到頂峰。當(dāng)發(fā)酵接近尾聲時，乙酸揮發(fā)增加，進而造成總酸量的降低。因此，選擇8 d為最適發(fā)酵時間。

圖4 發(fā)酵時間對芋頭蓮藕復(fù)合醋總酸的影響Fig.4 Effect of fermentation time on total acid of taro and lotus root compound vinegar

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果及分析

響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及復(fù)合醋總酸含量見表3，回歸方程的方差分析見表4。

表3 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果Table 3 Response surface test scheme and results

表4 響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 4 Response surface variance analysis results

利用Design-Expert V8.0.6軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到總酸與各因素的二次多項回歸方程模型為：總酸(g/L)=59.9+1.63A+2.04B+1.96C-1.15AB-1.30AC-1.11BC-3.26A2-3.44B2-4.29C2。

檢驗?zāi)Ｐ偷娘@著性，由表4可知，模型的F值為73.83，P<0.0001，說明該模型因子具有顯著性意義。F值越大，表明該因素對芋頭蓮藕復(fù)合醋總酸度的影響越顯著，3個因素對總酸度的影響大小依次為：B發(fā)酵時間(d)>C初始酒精度(%)>A醋酸菌接種量(%)。

回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9896，擬合度良好，表明試驗數(shù)據(jù)可以較好地反映各因素和總酸度之間的關(guān)系。

2.3.2 各因素交互作用結(jié)果及分析

根據(jù)模型繪制而成的響應(yīng)面圖，坡度越陡，等高線越近似于橢圓，說明兩者的交互作用越大，等高線密集程度也反映了此因素對總酸的影響程度。據(jù)此便可直觀地看出各因素的交互作用對芋頭蓮藕復(fù)合醋總酸度的影響。

2.3.2.1 醋酸菌接種量和發(fā)酵時間因素間的交互作用

由圖5可知，復(fù)合醋的總酸含量隨著醋酸菌接種量的增大而增大，當(dāng)接種量大于7%～8%時，總酸呈下降趨勢。隨著發(fā)酵時間的延長，總酸在增加，當(dāng)發(fā)酵時間超過8～9 d時，總酸開始下降。由等高線的橢圓形可以看出，醋酸菌接種量和發(fā)酵時間兩個因素之間的交互作用顯著。

圖5 醋酸菌接種量和發(fā)酵時間對芋頭蓮藕復(fù)合醋總酸度影響的曲面圖與等高線Fig.5 The response surface and contour of the effect of acetic acid bacteria inoculation amount and fermentation time on the total acidity of taro and lotus root compound vinegar

2.3.2.2 醋酸菌接種量和初始酒精度因素間的交互作用

由圖6可知，當(dāng)醋酸菌接種量超過7%～8%、初始酒精度超過8%～8.5%時，復(fù)合醋總酸開始下降，且響應(yīng)面坡度極為陡峭，說明醋酸菌接種量和初始酒精度對復(fù)合醋的總酸含量影響較大。等高線呈現(xiàn)橢圓形，表明醋酸菌接種量和初始酒精度兩個因素之間的交互作用顯著。

圖6 醋酸菌接種量和初始酒精度對芋頭蓮藕復(fù)合醋總酸度影響的曲面圖與等高線Fig.6 The response surface and contour of the effect of acetic acid bacteria inoculation amount and initial alcohol content on the total acidity of taro and lotus root compound vinegar

2.3.2.3 發(fā)酵時間和初始酒精度因素間的交互作用

由圖7可知，發(fā)酵時間越長，復(fù)合醋的總酸含量越大，當(dāng)發(fā)酵時間大于8～9 d時，總酸量開始下降。隨著初始酒精度的升高，總酸亦升高，初始酒精度超過8%～8.5%時，總酸呈下降趨勢。等高線呈現(xiàn)橢圓形，表明發(fā)酵時間和初始酒精度之間的交互作用顯著。

圖7 發(fā)酵時間和初始酒精度對芋頭蓮藕復(fù)合醋總酸度影響的曲面圖與等高線Fig.7 The response surface and contour of the effect of fermentation time and initial alcohol content on the total acidity of taro and lotus root compound vinegar

2.3.3 響應(yīng)面模型驗證

通過二次回歸方程，預(yù)測得到芋頭蓮藕復(fù)合醋的最優(yōu)工藝條件為：醋酸菌接種量7.344%、發(fā)酵時間8.478 d、初始酒精度8.171%時，此條件下總酸為60.452 g/L。結(jié)合試驗實際情況，選取醋酸菌接種量7.3%、發(fā)酵時間8.5 d、初始酒精度8.2%，進行3次試驗，測定總酸為60.21 g/L，與預(yù)測值接近，說明該最佳工藝條件合理可行。

3 結(jié)論

本試驗先進行單因素試驗研究，再通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到芋頭蓮藕復(fù)合醋的最優(yōu)加工工藝:初始酒精度8.2%，醋酸菌接種量7.3%，30 ℃下發(fā)酵8.5 d，在此條件下得到的芋頭蓮藕復(fù)合醋的總酸為60.21 g/L，最終產(chǎn)品芋頭蓮藕復(fù)合醋呈淡棕色，醋味柔和且醋香濃郁協(xié)調(diào)，無異味，透明澄清，無懸浮物及沉淀物。