梁欣梅，安攀宇，李燮昕，李維，張淼，王鑫

(1.四川旅游學院 食品學院，成都 610100；2.南昌大學 食品學院，南昌 330027)

現(xiàn)階段的肉品加工常用亞硝酸鹽使產(chǎn)品得到玫瑰紅色[1-2]。但亞硝酸鹽在酸性條件下會生成亞硝酸，其分解產(chǎn)生的亞硝基與胺反應產(chǎn)生致癌物亞硝胺[3-4]，使產(chǎn)品的安全性降低。為滿足健康生活的需要，尋找低硝或無硝的發(fā)色劑、著色劑用于食品加工中具有重要意義。

現(xiàn)已有研究人員對畜禽血液中的血紅蛋白進行利用，研制出糖基化亞硝基血紅蛋白，以部分取代亞硝酸鹽的方式對產(chǎn)品進行著色，取得了一定成果[5-6]。但糖基化亞硝基血紅蛋白熱加工程度低、穩(wěn)定性不佳、分散性不強，仍添加有亞硝酸鹽，故其安全性和生產(chǎn)應用有待進一步研究[7]。

將糖基化亞硝基血紅蛋白改進，以?；〈鷣喯趸频玫奶腔；t蛋白成為新的亞硝酸鹽替代物研究目標。朱培培[8]、楊慧娟等[9]、歐秀瓊等[10]對糖基化?；t蛋白的制備、穩(wěn)定性和在中式香腸中的應用進行了研究。結(jié)果表明，糖基化?；t蛋白用于香腸制品中能起到著色和降低亞硝酸鹽殘留量的作用，發(fā)展空間極大。

色素牢固度是指被染色對象經(jīng)染色后色調(diào)穩(wěn)定性或色素對環(huán)境變化的抵抗能力，是衡量色素品質(zhì)的指標，其主要取決于色素的理化性質(zhì)及被染色物質(zhì)的性質(zhì)[11]?，F(xiàn)已有不少學者對糖基化?；t蛋白的制作及應用做出了研究，但對其牢固度卻缺少探討研究。對糖基化酰基血紅蛋白的牢固度進行研究，有助于其加工應用的發(fā)展[12]。本實驗研究了4種不同糖基的糖基化?；t蛋白的牢固度，了解其在不同環(huán)境條件下的穩(wěn)定性，能為進一步開發(fā)利用這類色素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 器材及儀器

1.1.1 材料及試劑

豬血：市售，成都市龍泉驛區(qū)農(nóng)貿(mào)市場。

檸檬酸三鈉、甘油、ZnSO4、CuSO4、MgSO4：天津市致遠化學試劑有限公司；所有試劑均為分析純。

煙酰胺、D-異抗壞血酸鈉、D-果糖、蔗糖、葡萄糖、殼聚糖：味多美食品配料有限公司；所用配料均為食品級。

1.1.2 實驗儀器

JA2003電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；pH-100A手持pH計、LC-LX-HR165A高速冷凍離心機、DE-101T磁力攪拌器 上海力辰儀器科技有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機 上海賀帆儀器有限公司；752N紫外分光光度計 上海菁華有限公司；HH-420電熱恒溫水浴鍋 上海天壹瑞有限公司。

1.2 實驗設計及方法

1.2.1 糖基化酰基血紅蛋白的制備

參照歐秀瓊等的方法，略作改動。

1.2.1.1 原料預處理

新鮮豬血，加0.8%檸檬酸三鈉作抗凝處理，3～6層紗布過濾除雜，放入4 ℃冰箱中冷藏，靜置待用。

1.2.1.2 制備血細胞

靜置后的豬血，用高速冷凍離心機在4000 r/min、15 min的條件下進行離心處理，去除上層血漿，得到血細胞。向血細胞中加入等體積蒸餾水，混勻攪拌約4 h，細胞壁破裂，釋放出血紅蛋白。加入1%的D-異抗壞血酸鈉后將血紅蛋白溶液放入-20 ℃條件下保藏備用。

1.2.1.3 ?；?/p>

將冷凍的血紅蛋白溶液于室溫解凍，加10 mg/mL甘油、1%煙酰胺充分攪拌，用0.05%檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至7左右，置于4 ℃、避光條件下反應24 h得到酰基化血紅蛋白液。

1.2.1.4 糖基化

將酰基化血紅蛋白液與0.5%的糖溶液等體積混勻(葡萄糖、蔗糖、果糖、殼聚糖)，調(diào)節(jié)pH至7左右，在50 ℃條件下水浴保溫10 min，得到糖基化酰基血紅蛋白溶液。

1.2.1.5 冷凍干燥

將糖基化酰基血紅蛋白溶液過濾，除去未反應及變性凝固的血紅蛋白，分裝后于-48 ℃條件下凍硬。凍硬后的溶液用真空冷凍干燥機進行干燥，得到糖基化?；t蛋白。

1.2.2 糖基化?；t蛋白色素牢固度研究

將據(jù)比爾定律A=a×b×c，吸光度與被測物質(zhì)的含量呈線性關系，選用吸光度值的改變來表征糖基化?；t蛋白經(jīng)不同理化步驟處理后所顯現(xiàn)的各種理化性質(zhì)的變化。紫外掃描圖得到糖基化?；t蛋白的吸收峰，在540 nm波長下測定色素的吸光度，以吸光度變化來衡量糖基化酰基血紅蛋白的牢固度[13]。

1.2.2.1 光照對糖基化?；t蛋白的影響

參照李飛等[14]研究光照對糖基化亞硝基血紅蛋白穩(wěn)定性影響的方法，略作改動。4種糖基化?；t蛋白各取3.0 g 2份置于塑封袋中，放入棕色玻璃廣口瓶和透明玻璃廣口瓶中，將棕色玻璃廣口瓶置于室溫黑暗條件下，透明玻璃廣口瓶在同室溫LED燈(距光源18 cm，5 W自然光)照射下儲藏，觀察其色澤變化情況。每隔一段時間各取適量制成質(zhì)量分數(shù)為1%的溶液(0，3，6，9，12，15 d)，10倍稀釋后在波長為540 nm處紅色物質(zhì)存在吸收峰處測定其吸光度值。記錄數(shù)據(jù)，每個樣品重復測定3次取平均值，下同。

1.2.2.2 金屬離子對糖基化?；t蛋白的影響

參照李飛研究金屬離子對糖基化亞硝基血紅蛋白穩(wěn)定性影響的方法，略作改動。4種糖基化?；t蛋白各取0.2 g，分別與20 mL質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的各類金屬離子(MgSO4、ZnSO4、CuSO4)溶液混合均勻，密封后置于避光條件下，在不同時間點(0，0.5，1，1.5，2，2.5，3 h)觀察樣品的顏色變化，取上清液稀釋10倍，于波長540 nm處測定吸光度值。

1.2.2.3 pH對糖基化?；t蛋白的影響

參照邢紹平等[15]研究pH對含蔗糖的糖基化亞硝基血紅蛋白穩(wěn)定性影響的方法，略作改動。取蒸餾水，用0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液和1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)出不同pH值的溶液(5.0，6.0，7.0，8.0，9.0)，用調(diào)節(jié)好pH值的溶劑配制出相應的質(zhì)量分數(shù)為1%的糖基化?；t蛋白溶液，在室溫條件下放置30 min后，觀察溶液顏色變化，測其在540 nm處的吸光度值。

1.2.2.4 氧化劑對糖基化?；t蛋白的影響

參照鄭立紅研究氧化劑對亞硝基血紅蛋白穩(wěn)定性影響的方法，略作改動。在20 mL不同濃度的過氧化氫溶液中(H2O2濃度分別為0%、0.03%、0.3%、1%、1.5%、3%，按10倍變化來設置濃度差。通過前期預實驗發(fā)現(xiàn)，因0.3%與3%濃度跨度過大，中間濃度變化影響無法反映，故在期間增設1%和1.5%便于觀察吸光度值變化趨勢)，各加入0.2 g糖基化?；t蛋白，配成質(zhì)量分數(shù)為1%的溶液。置于室溫條件下制分別反應0，10，20，30，40，50，60 min后觀察樣品顏色變化，每個時間點取1 mL溶液做10倍稀釋后，測其在540 nm下的吸光度值。

1.2.2.5 溫度對糖基化?；t蛋白的影響

參照歐秀瓊研究溫度對糖基化酰基血紅蛋白穩(wěn)定性影響的方法，略作改動。將制得的4種糖基化?；t蛋白都配制成質(zhì)量分數(shù)為5%的溶液，分別于40，50，70，90，100 ℃條件下水浴加熱，并分別在加熱時間為0，10，20，30 min時各取1 mL樣品液，做102倍稀釋后，于波長540 nm處測定溶液的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計分析

1.3.1 溶液吸光度變化率計算

通過計算糖基化?；t蛋白溶液經(jīng)條件處理前后的吸光度值變化率，可以反映出糖基化?；t蛋白鍵與鍵之間結(jié)合的牢固程度。吸光度變化率按下式計算：

1.3.2 吸光度值熱圖和層次聚類分析

對溶液的吸光度值制作熱圖并做層次聚類分析，可以對實驗數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制并直觀地展現(xiàn)研究對象吸光度值的差異變化情況[16]。熱圖中通過設置不同顏色帶隨物質(zhì)含量的變化而變化[17-18]，可直觀地反映出各樣本組內(nèi)或組間吸光度值的重復性及變化快慢等情況。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個樣品實驗重復3次，測定出的吸光度值結(jié)果均用平均值表示。采用軟件IBM SPSS Statistics 23進行顯著性差異分析，采用MeV軟件制作熱圖并做聚類分析，圖或表通過Microsoft Word和Microsoft Excel制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照對糖基化?；t蛋白的影響

由圖1～圖4可知，光照條件下，隨著時間的延長，4種糖基化?；t蛋白的吸光度值均呈現(xiàn)出下降趨勢。這是因為受光照影響，糖基化酰基血紅蛋白中的亞鐵離子被氧化為高鐵離子，故糖基化?；t蛋白出現(xiàn)由紅色變?yōu)榧t褐色的現(xiàn)象，溶液中紅色物質(zhì)含量降低，褐色物質(zhì)增加，由于褐色物質(zhì)的吸光度吸收峰所需的波長與紅色不同，故溶液在540 nm處的吸光度值降低。

圖1 光照對殼聚糖糖基化?；t蛋白的影響Fig.1 The effect of light on chitosan glycosylated acyl-hemoglobin注：圖中標注的不同字母表示差異顯著(p<0.05)，相同字母表示差異不顯著(p>0.05)，下同。字母下的數(shù)字下腳標表示不同的組別，例：“1”表示黑暗條件下吸光度差異性，“2”表示光照條件下吸光度差異性，下同。

圖2 光照對葡萄糖糖基化酰基血紅蛋白的影響Fig.2 The effect of light on glucose glycosylated acyl-hemoglobin

圖3 光照對蔗糖糖基化?；t蛋白的影響Fig.3 The effect of light on sucrose glycosylated acyl-hemoglobin

圖4 光照對果糖糖基化酰基血紅蛋白的影響Fig.4 The effect of light on fructose glycosylated acyl-hemoglobin

由表1可知，光照15 d果糖糖基化?；t蛋白的吸光度變化率最小。結(jié)合圖5，根據(jù)吸光度值變化對樣品進行層次聚類分析，結(jié)果表明：將樣品分為兩類時，果糖糖基化?；t蛋白被單獨歸為一類，說明果糖糖基化?；t蛋白的吸光度值變化明顯有別于另外3種糖基化?；t蛋白。熱圖中，頂端顏色帶從左到右的顏色變化為由淺色帶的白色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯钌珟У暮谏?，表明吸光度值由小變大，穩(wěn)定性由弱到強。隨著光照時間的延長，殼聚糖、蔗糖、葡萄糖分別為糖源的糖基化?；t蛋白溶液吸光度值熱圖的顏色變化均由深色帶跨越到淺色帶，而果糖糖基化血紅蛋白溶液的吸光度值熱圖顏色始終處于深色帶，這可能是由于果糖為糖基的?；t蛋白結(jié)合形成的化學鍵更牢固，耐光性更強。則在光照條件下果糖糖基化?；t蛋白的牢固度明顯優(yōu)于另外3種糖基化?；t蛋白，較另外3種溶液的吸光度值，其下降幅度最小。

表1 光照對4種糖基化?；t蛋白溶液吸光度值變化率的影響Table 1 The effect of light on the change rates of absorbance values of four glycosylated acyl-hemoglobin solution

圖5 光照條件下4種糖基化?；t蛋白牢固度比較Fig.5 The comparison of stability of four glycosylated acyl-hemoglobins under light conditions注：顏色指示帶上下限值的選擇依據(jù)軟件分析結(jié)果來設定，下同。

由圖1～圖4和圖6可知，隨著時間的延長，在黑暗條件下4種糖基化?；t蛋白溶液的吸光度值均無大幅度下降，熱圖顏色變化均處于深色帶。結(jié)合表1可知，4種糖基化?；t蛋白在黑暗條件下吸光率的變化幅度均較小，故4種糖基化?；t蛋白均可在避光條件下穩(wěn)定保藏。

圖6 避光條件下4種糖基化?；t蛋白牢固度的比較Fig.6 The comparison of stability of four glycosylated acyl-hemoglobins under dark conditions

綜上所述，4種糖基化?；t蛋白在黑暗條件下性質(zhì)穩(wěn)定，牢固度較好；在光照條件下果糖糖基化?；t蛋白穩(wěn)定性良好，牢固度最佳。

2.2 金屬離子對糖基化酰基血紅蛋白的影響

由圖7～圖14可知，在0 h處，測定各溶液的吸光度值存在較大差異，由此可見帶重金屬離子的鹽溶液對糖基化?；t蛋白的溶解度有影響，且因金屬離子種類不同影響大小各異；此外，不同金屬離子與糖基化?；t蛋白的反應速率可能存在差異，也會造成吸光度值差異。

表2 金屬離子對4種糖基化酰基血紅蛋白溶液吸光度值變化率的影響Table 2 The effect of different metal ions on the change rates of absorbance values of four glycosylated acyl-hemoglobin solution

圖7 金屬離子對殼聚糖糖基化?；t蛋白的影響Fig.7 The effect of different metal ions on chitosan glycosylated acyl-hemoglobin注：圖中標注的不同字母表示差異顯著(p<0.05)，相同字母表示差異不顯著(p>0.05)，下同。字母下的數(shù)字下腳標表示不同的組別，例：“1”表示鎂離子條件下吸光度差異性，“2”表示無金屬離子條件下吸光度差異性，“3”表示銅離子條件下吸光度差異性，“4”表示鋅離子條件下吸光度差異性，下同。

圖8 金屬離子對葡萄糖糖基化酰基血紅蛋白的影響Fig.8 The effect of different metal ions on glucose glycosylated acyl-hemoglobin

圖9 金屬離子對蔗糖糖基化?；t蛋白的影響Fig.9 The effect of different metal ions on sucrose glycosylated acyl-hemoglobin

圖10 金屬離子對果糖糖基化?；t蛋白的影響Fig.10 The effect of different metal ions on fructose glycosylated acyl-hemoglobin

圖11 金屬離子對殼聚糖糖基化酰基血紅蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.11 The effect of different metal ions on the stability of chitosan glycosylated acyl-hemoglobin

圖12 金屬離子對葡萄糖糖基化?；t蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.12 The effect of different metal ions on the stability of glucose glycosylated acyl-hemoglobin

圖13 金屬離子對蔗糖糖基化酰基血紅蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.13 The effect of different metal ions on the stability of sucrose glycosylated acyl-hemoglobin

圖14 金屬離子對果糖糖基化?；t蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.14 The effect of different metal ions on the stability of fructose glycosylated acyl-hemoglobin

由圖7～圖11可知，對于4種不同糖源糖基化的血紅蛋白而言，帶Cu2+和Zn2+的溶液吸光度值在起始位置處遠低于對照組；再結(jié)合圖12～圖14，在同樣的吸光度值顏色變化帶內(nèi)，帶Cu2+和Zn2+的溶液吸光度值的熱圖顏色變化均處于吸光度值較低的灰白色帶內(nèi)。故Cu2+和Zn2+對糖基化酰基血紅蛋白的溶解度影響很大，使糖基化酰基血紅蛋白的溶解度降低，牢固度下降，穩(wěn)定性變差。

由圖7～圖11可知，帶Mg2+的溶液中，其0 h的吸光度值與對照組基本無異，但隨著時間的延長，受Mg2+的影響，溶解在溶液中的溶質(zhì)逐漸被分解，吸光度值趨于下降趨勢。由圖12～圖14可知，熱圖顯示雖受Mg2+影響溶液的吸光度值有起伏波動，但整個實驗過程中熱圖的顏色變化與對照組相似，始終處于黑灰色吸光度值較高的顏色帶，由此可知4種糖基化?；t蛋白對Mg2+的耐受能力較好，對其牢固度影響較小。

綜上所述，Cu2+和Zn2+對4種糖基化?；t蛋白的牢固度影響較大，生產(chǎn)過程中要避免加入；對Mg2+的耐受能力更佳，對比熱圖發(fā)現(xiàn)蔗糖糖基化酰基血紅蛋白和殼聚糖糖基化?；t蛋白對Mg2+的耐受能力更強，對牢固度影響最小，溶質(zhì)分解度更小。

2.3 pH對糖基化?；t蛋白的影響

就蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性而言，pH的變化會對其造成影響。當溶液的pH達到蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)所帶凈電荷會變?yōu)榱?，降低靜電斥力，此時疏水性強的蛋白質(zhì)分子物質(zhì)就會相互吸引，形成沉淀析出，溶質(zhì)的溶解度下降。

由圖15可知，當pH在5～9變化時，殼聚糖糖基化酰基血紅蛋白和葡萄糖糖基化?；t蛋白隨pH的變化吸光度值波動幅度較大。對于蔗糖糖基化?；t蛋白溶液和果糖糖基化酰基血紅蛋白溶液，隨著pH的變化，溶液吸光度值變化平緩，無明顯的波峰或波谷，可見這兩種糖基化?；t蛋白無論在何種酸堿環(huán)境下其溶解度變化都不大，穩(wěn)定性良好。

圖15 pH對4種糖基化?；t蛋白的影響Fig.15 The effect of pH value on four glycosylated acyl-hemoglobins注：圖中標注的不同字母表示差異顯著(p<0.05)，相同字母表示差異不顯著(p>0.05)，下同。字母下的數(shù)字下腳標表示不同的組別，例：“1”表示殼聚糖類吸光度差異性，“2”表示葡萄糖類吸光度差異性，“3”表示蔗糖類吸光度差異性，“4”表示果糖類吸光度差異性。

由圖16可知，樣品作聚類分析分為三類時，果糖糖基化?；t蛋白和蔗糖糖基化?；t蛋白被歸為一類，另兩種分別為一類。從熱圖顏色帶的變化可以看出，果糖糖基化?；t蛋白和蔗糖糖基化?；t蛋白的穩(wěn)定性更佳，其中蔗糖糖基化?；t蛋白的吸光度值熱圖顏色變化在整個實驗過程中均處于高水平的黑灰色帶，則其穩(wěn)定性是4種糖基化?；t蛋白中最佳的。熱圖顯示：殼聚糖糖基化?；t蛋白和葡萄糖糖基化?；t蛋白的顏色變化帶很寬，從黑灰色帶跨越至灰白色帶，故這兩種糖基化?；t蛋白隨pH值的變化對牢固度的影響明顯，極不穩(wěn)定。

圖16 pH對4種糖基化酰基血紅蛋白牢固度的影響Fig.16 The effect of pH value on the stability of four glycosylated acyl-hemoglobins

2.4 氧化劑對糖基化?；t蛋白的影響

綜上所述，對于糖基化酰基血紅蛋白，選取的糖基不同對不同pH的耐受能力也不同。就本實驗中選取的4種糖基而言，蔗糖或果糖作為糖基優(yōu)酰基血紅蛋白的牢固度更佳，受酸堿環(huán)境變化的影響更小。

由圖17～圖20可知，反應時間相同時，隨著H2O2的濃度增加，4種糖基化?；t蛋白溶液的吸光度值均變化較大，呈下降趨勢。當H2O2的濃度一定時，隨著反應時間的延長，不同濃度的H2O2條件下，溶液的吸光度值變化差異明顯。結(jié)合表3，當H2O2的濃度在0%～0.3%時，隨著反應時間的延長，4種糖基化?；t蛋白溶液的吸光度值變化均較小，穩(wěn)定性良好。當H2O2濃度>0.3%時，隨著反應時間的延長，吸光度值下降明顯，變化率上升，溶液有沉淀析出，溶液顏色由紅變黑，說明H2O2的濃度越大，反應時間越長，對4種糖基化酰基血紅蛋白的牢固度影響越大。

圖17 不同濃度H2O2溶液對殼聚糖糖基化酰基血紅蛋白的影響Fig.17 The effect of H2O2 solution on chitosan glycosylated acyl-hemoglobin注：圖中標注的不同字母表示差異顯著(p<0.05)，相同字母表示差異不顯著(p>0.05)，下同。字母下的數(shù)字下腳標表示不同的組別，例：“1”表示0%條件下吸光度差異性，“2”表示0.03%條件下吸光度差異性，“3”表示0.3%條件下吸光度差異性，依次編號，下同。

圖18 不同濃度H2O2溶液對葡萄糖糖基化?；t蛋白的影響Fig.18 The effect of H2O2 solution on glucose glycosylated acyl-hemoglobin

圖19 不同濃度H2O2溶液對蔗糖糖基化酰基血紅蛋白的影響Fig.19 The effect of H2O2 solution on sucrose glycosylated acyl-hemoglobin

續(xù) 表

圖20 不同濃度H2O2溶液對果糖糖基化?；t蛋白的影響Fig.20 The effect of H2O2 solution on fructose glycosylated acyl-hemoglobin

表3 不同濃度H2O2溶液對4種糖基化?；t蛋白溶液吸光度變化率的影響Table 3 The effect of H2O2 solution on the change rates of absorbance values of four glycosylated acyl-hemoglobin solution

結(jié)合圖21～圖24可知，對溶液中不同H2O2濃度處理的吸光度值結(jié)果做聚類分析，當分為兩類時，0%、0.03%、0.3%被歸為了一類，1%、1.5%、3%被歸為了一類；熱圖結(jié)果顯示，在0%～0.3%濃度范圍內(nèi)，吸光度值處于黑灰色帶，而在1%～3%的濃度范圍內(nèi)，顏色變化跨越了整個顏色帶，跨度較大，吸光度值降低迅速。

圖21 不同濃度H2O2溶液對殼聚糖糖基化酰基血紅蛋白溶液吸光度值的影響Fig.21 The effect of H2O2 solution on the absorbance values of chitosan glycosylated acyl-hemoglobin solution

圖22 不同濃度H2O2溶液對葡萄糖糖基化?；t蛋白溶液吸光度值的影響Fig.22 The effect of H2O2 solution on the absorbance values of glucose glycosylated acyl-hemoglobin solution

圖23 不同濃度H2O2溶液對蔗糖糖基化?；t蛋白溶液吸光度值的影響Fig.23 The effect of H2O2 solution on the absorbance values of sucrose glycosylated acyl-hemoglobin solution

圖24 不同濃度H2O2溶液對果糖糖基化酰基血紅蛋白溶液吸光度值的影響Fig.24 The effect of H2O2 solution on the absorbance values of fructose glycosylated acyl-hemoglobin solution

綜上所述，氧化劑對糖基化酰基血紅蛋白牢固度有影響，可能是因為血紅蛋白分子與氧氣結(jié)合，破壞了酰基化形成的化學鍵，化學鍵發(fā)生斷裂，所以穩(wěn)定性降低。結(jié)果顯示：當H2O2在0%～0.3%范圍內(nèi)時，對4種糖基化酰基血紅蛋白的牢固度影響較小，性質(zhì)保持穩(wěn)定，但當超過0.3%以后對化學鍵的破壞力度較大，牢固度迅速下降。故4種糖基化?；t蛋白有一定的抗氧化能力但不強，由此可知在生產(chǎn)運用時要盡量避免使用強氧化劑，同時儲藏時要盡量達到在無氧條件下保藏。

2.5 溫度對糖基化?；t蛋白的影響

由圖25～圖28可知，加熱時間不變，加熱溫度的變化對4種糖基化?；t蛋白的影響明顯。隨著溫度的升高，吸光度值先升高后降低，結(jié)果顯示，在低于70 ℃范圍內(nèi)，4種溶液的吸光度值均較高。溫度超過70 ℃后，吸光度值下降，主要是因為溫度值達到了蛋白質(zhì)變性溫度，蛋白質(zhì)發(fā)生變性凝固，溶液中出現(xiàn)紅褐色沉淀，溶質(zhì)減少，溶液的吸光度值降低。當溫度不變時，隨著加熱時間延長，不同溫度條件下溶液的吸光度值變化各異。

圖25 不同溫度對殼聚糖糖基化?；t蛋白的影響Fig.25 The effect of different temperatures on chitosan glycosylated acyl-hemoglobin注：圖中標注的不同字母表示差異顯著(p<0.05)，相同字母表示差異不顯著(p>0.05)，下同。字母下的數(shù)字下腳標表示不同的組別，例：“1”表示40 ℃條件下吸光度差異性，“2”表示50 ℃條件下吸光度差異性，“3”表示70 ℃條件下吸光度差異性，依次編號，下同。

圖26 不同溫度對葡萄糖糖基化?；t蛋白的影響Fig.26 The effect of different temperatures on glucose glycosylated acyl-hemoglobin

圖27 不同溫度對蔗糖糖基化?；t蛋白的影響Fig.27 The effect of different temperatures on sucrose glycosylated acyl-hemoglobin

圖28 不同溫度對果糖糖基化酰基血紅蛋白的影響Fig.28 The effect of different temperatures on fructose glycosylated acyl-hemoglobin

由表4可知，溫度低于70 ℃時，隨著加熱時間的延長，溶液的吸光度值變化率較小，溶液的吸光度值穩(wěn)定；當溫度高于70 ℃時，隨著加熱時間的延長，蛋白質(zhì)變性逐漸加劇，溶液的吸光度值隨之下降，吸光度值變化率急劇增大，溫度越高，變化率增加的幅度越大。

表4 不同加熱溫度對4種糖基化?；t蛋白溶液吸光度值變化率的影響Table 4 The effect of different temperatures on the change rates of absorbance values of four glycosylated acyl-hemoglobin solution

由圖29～圖32可知，對加熱溫度進行聚類分析分為兩類時，40，50，70 ℃的結(jié)果被歸為一類，另一類為90 ℃和100 ℃；熱圖的結(jié)果顯示，在40～70 ℃的加熱范圍內(nèi)，吸光度值處于較高水平的黑灰色帶，而90 ℃和100 ℃的顏色帶跨越度較大，由黑色跨至了白色，由此可知分為兩類時40～70 ℃的加熱范圍內(nèi)為糖基化?；t蛋白牢固度更佳、穩(wěn)定性更好的一類。

圖29 不同溫度對殼聚糖糖基化?；t蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.29 The effect of different temperatures on the stability of chitosan glycosylated acyl-hemoglobin

圖30 不同溫度對葡萄糖糖基化?；t蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.30 The effect of different temperatures on the stability of glucose glycosylated acyl-hemoglobin

圖31 不同溫度對蔗糖糖基化?；t蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.31 The effect of different temperatures on the stability of sucrose glycosylated acyl-hemoglobin

圖32 不同溫度對果糖糖基化?；t蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.32 The effect of different temperatures on the stability of fructose glycosylated acyl-hemoglobin

綜上所述，溫度對糖基化?；t蛋白的牢固度有顯著影響，當溫度低于70 ℃時，化學鍵結(jié)合牢固，穩(wěn)定性良好；當溫度高于70 ℃時，蛋白質(zhì)易發(fā)生變性，溶液吸光度值降低。故糖基化?；t蛋白在一定的熱加工時間內(nèi)具有一定的耐熱性，其加工溫度不宜過高，由此可考慮在熱加工完成后添加使用，這樣產(chǎn)品著色效果會更佳。在石飛云等[19]關于亞硝基血紅蛋白合成及其應用的研究中，關于溫度選擇的結(jié)論為不宜超過60 ℃；在何平關于糖基化亞硝基血紅蛋白的合成及應用研究中顯示溫度為50 ℃時，吸光度最大，高于此溫度時，產(chǎn)物的吸光度值下降；在王東等[20]關于新型肉制品著色劑亞硝基血紅蛋白色素的研究中顯示亞硝基血紅蛋白色素具有一定耐熱性，但建議在40 ℃以下使用。綜上研究結(jié)論說明糖基化?；t蛋白的熱處理溫度更優(yōu)于亞硝基血紅蛋白。

3 結(jié)論

通過單因素實驗對4種糖基化?；t蛋白的牢固度進行了考察。結(jié)果表明，經(jīng)糖基化的酰基血紅蛋白，血紅蛋白的穩(wěn)定性得到優(yōu)化。使用不同的糖源作糖基，對?；t蛋白的牢固度會造成差異，結(jié)果如下：

4種糖基化酰基血紅蛋白在黑暗條件下性質(zhì)穩(wěn)定；果糖糖基化酰基血紅蛋白較另外3種血紅蛋白在光照條件下共價鍵結(jié)合得更牢固穩(wěn)定性更佳。故糖基化酰基血紅蛋白宜在避光條件下儲藏，如需在光照下使用，則以果糖糖基化?；t蛋白為佳。

Mg2+對4種糖基化?；t蛋白的溶解度和牢固度影響最小，除此之外，包括Cu2+和Zn2+在內(nèi)的重金屬離子在加工過程中應盡量避免接觸。

pH對糖基化酰基血紅蛋白的影響因糖基的不同而不同。本實驗中選取的4種糖基，蔗糖或果糖為糖基的?；t蛋白受pH變化的影響小，其牢固度更佳。

H2O2在0%～0.3%的范圍內(nèi)時，對4種糖基化酰基血紅蛋白的牢固度影響較小，故4種糖基化酰基血紅蛋白有一定的抗氧化能力但不強，故生產(chǎn)運用時避免大量使用強氧化劑。

生產(chǎn)及加工溫度<70 ℃時化學鍵結(jié)合最牢固，隨著溫度的升高、時間的延長，色素穩(wěn)定性良好。