童晶晶，黎 軍，周裕文，黃雪娟

（南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院附屬陳村醫(yī)院，廣東 佛山 528000）

慢性心力衰竭是由各種原因引起心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)異常，導(dǎo)致心臟功能不全的一種臨床綜合征，是大多數(shù)心血管疾病進(jìn)展的晚期階段。成人慢性心力衰竭的患病率高達(dá)0.9%，且該數(shù)字可隨著人群年齡的增長(zhǎng)而增加[1]。目前，臨床上仍以利尿劑、強(qiáng)心藥、血管擴(kuò)張藥及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑等西藥為主對(duì)慢性心力衰竭患者進(jìn)行治療，但這類藥物僅可控制其癥狀，無(wú)法延緩其病情的進(jìn)展及根治其病情[2]。近年來，中醫(yī)藥在慢性心力衰竭的治療中取得較大的進(jìn)展。中醫(yī)藥具有長(zhǎng)效、副作用少等特點(diǎn)，不僅注重改善患者的臨床癥狀，而且注重調(diào)理其體質(zhì)，提高其生活質(zhì)量。慢性心力衰竭的癥狀與中醫(yī)“心水”的臨床表現(xiàn)相似。不少醫(yī)家認(rèn)為，中醫(yī)辨證心水以陽(yáng)虛立論[3]。附子是補(bǔ)火助陽(yáng)的經(jīng)典中藥。名老中醫(yī)李可方基于心力衰竭以陽(yáng)虛為本這一理論，重用附子治療慢性心力衰竭，取得顯著的療效。這說明，用附子治療慢性心力衰竭具有廣闊的應(yīng)用前景。不過，用附子治療慢性心力衰竭時(shí)，該藥物的活性成分及作用靶點(diǎn)尚待相關(guān)研究人員進(jìn)行進(jìn)一步的探討。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建了附子- 慢性心力衰竭- 靶點(diǎn)，為進(jìn)一步探討附子治療心力衰竭的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 建立附子的信息數(shù)據(jù)集

BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）是國(guó)內(nèi)科學(xué)家開發(fā)的首個(gè)探討中藥分子機(jī)制的在線分析工具。BATMAN-TCM 的主要功能包括中藥組成成分的靶標(biāo)預(yù)測(cè)和潛在靶標(biāo)的功能分析，還可進(jìn)行成分-靶標(biāo)-通路/ 疾病關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的可視化分析。利用BATMAN-TCM 建立附子信息數(shù)據(jù)集，在BATMAN-TCM 的搜索框內(nèi)輸入“附子”，將檢索條件設(shè)置為系統(tǒng)默認(rèn)值（即調(diào)整后的P 值≤0.05，Score cutoff ≥20），即可得出附子的活性成分- 靶標(biāo)信息數(shù)據(jù)集。

1.2 建立慢性心力衰竭的生物信息數(shù)據(jù)集

CTD（http://ctdbase.org/）可用于選擇與慢性心力衰竭相關(guān)的靶標(biāo)。CTD 是一個(gè)開放式數(shù)據(jù)庫(kù)，可提供不同類型分子的集中式集成數(shù)據(jù)及來自各種生物的毒理學(xué)數(shù)據(jù)。CTD整合了有關(guān)化學(xué)基因、蛋白質(zhì)相互作用、化學(xué)疾病和基因疾病相互作用的信息。在CTD 搜索框內(nèi)輸入 “心力衰竭”、“慢性心力衰竭”、“充血性心力衰竭”及“心肌衰竭”等關(guān)鍵詞，以獲得與慢性心力衰竭相關(guān)的靶標(biāo)。

1.3 獲取附子-慢性心力衰竭- 基因數(shù)據(jù)集的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）

Draw Venn Diagram 在線工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/Webtools/Venn/）可用于分析慢性心力衰竭和附子的交叉基因集，構(gòu)建附子- 慢性心力衰竭- 基因數(shù)據(jù)集。將構(gòu)建的數(shù)據(jù)集輸入String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）。STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)可預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的直接和間接相互作用、建立蛋白質(zhì)之間網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫(kù)，擁有來自2031種生物的9 443 763 個(gè)蛋白質(zhì)。選擇綜合得分（Combined score）＞0.4 分的蛋白質(zhì)構(gòu)建PPI[4]。

1.4 用基因本體論（Geneontology，GO）分析附子-慢性心力衰竭- 基因的生物學(xué)過程

GO 是在生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的進(jìn)行基因功能分類和基因產(chǎn)物功能描述的系統(tǒng)。 Metascape（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）是一種高效且直觀的基因富集分析在線工具，具有集成發(fā)現(xiàn)和注釋的功能，專注于對(duì)基因功能和GO 術(shù)語(yǔ)的解釋。將慢性心力衰竭和附子的交叉基因集輸入Metascape，對(duì)其進(jìn)行GO 分析[5]。

1.5 用京都基因與基因組百科全書（KEGG）探討附子-慢性心力衰竭-基因的生物學(xué)通路

KEGG 是一個(gè)基因功能系統(tǒng)分析知識(shí)庫(kù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)將基因組信息與高階功能信息聯(lián)系起來，從而獲得豐富的生物學(xué)途徑。將慢性心力衰竭和附子的交叉基因集輸入Funrich 插件，確定其KEGG 途徑，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P ≤0.05。

2 結(jié)果

2.1 附子的生物信息集

在用BATMAN-TCM 進(jìn)行檢索與篩選后，共獲得85個(gè)附子的化合物，其中有27 個(gè)化合物因無(wú)明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)而被剔除，最終納入58 個(gè)化合物，包括Talatisamine、Benzoylaconine、Aconitine、Delphin、Delgrandine、Aconine、14-Deoxy-11、12-Didehydroandrographolide、Delbruline、Deltaline、Delavaconitine、Deltamine、Uracil、Carmichaeline、Delsoline、Delcorine、Karanjin、Salsolinol、Crassicauline A、2,7-Dideacetyl-2,7-Dibenzoyl-Taxayunnanine F、Delphamine、Bullatine B、Benzoylhypaconine、Bullatine C、Coryneine、Vilmorrianine C、3-Acetylaconitine、Deoxyaconitine、Denudatine、Delsemine B、Delphatine、Delsemine A、Demethyldelavaine A、M-Aminophenol、Karakoline、Hypaconitine、Talatizamine 等（見圖1）。附子所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)共有253 個(gè)，包括ABCB1、ABCC9、ACE、ACHE、ADIRF、ADORA2A、ADORA2B、ADRA1A、ADRA1B、ADRA1D、ADRA2A 等（見圖1）。

圖1 附子-化合物-基因相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.2 慢性心力衰竭的生物信息集

通過CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得與慢性心力衰竭相關(guān)的生物信息集，共篩選出113 個(gè)與慢性心力衰竭有關(guān)的基因。將這113個(gè)基因?qū)隒ytoscape 3.7.1 中進(jìn)行可視化。與慢性心力衰竭相關(guān)的靶標(biāo)包括ACAA1B、ACACA、ACADS、ACE、ACLY、ADIPOQ、ADRA2C、ADRB1、ADRB3、AGT、AGTR1、ALB 及ALDH1A7（見圖2）。

2.3 附子-慢性心力衰竭- 基因數(shù)據(jù)集的PPI

將附子的總靶點(diǎn)列表與慢性心力衰竭的相關(guān)基因靶點(diǎn)列表導(dǎo)入VENN 后，得出與附子- 慢性心力衰竭相互交聯(lián)的基因有17 個(gè)重疊靶標(biāo)，包括ACE、NR3C2、NPPA、ADRA2C、ADRB1、TNF、HTR2B、ADRB3、PTGS2、IL-1β、AGTR1、IFNG、ALB、PTGS1、NRG1、CRP、IL6。 這17個(gè)重疊靶標(biāo)代表了附子治療慢性心力衰竭的核心機(jī)制和潛在目標(biāo)（見圖3）。

圖2 慢性心力衰竭的基因靶點(diǎn)集

圖3 附子-慢性心力衰竭-基因的PPI 圖

2.4 附子- 慢性心力衰竭- 基因的生物學(xué)過程

慢性心力衰竭和附子重疊靶標(biāo)的生物學(xué)功能顯著富集于調(diào)節(jié)血管收縮、調(diào)控炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)血壓水平及脂肪的分解中，并可維持多細(xì)胞生物體內(nèi)的平衡，參與鈣介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)和內(nèi)分泌過程、干細(xì)胞分化，同時(shí)參與受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、髓樣白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)等（見圖4）。

圖4 附子-慢性心力衰竭-基因的生物學(xué)過程

2.5 附子- 慢性心力衰竭- 基因的生物學(xué)通路

通過對(duì)附子-慢性心力衰竭的交叉基因進(jìn)行Funrich 分析后發(fā)現(xiàn)，二者的重疊靶點(diǎn)共參與了4 條途徑，包括IL-27信號(hào)通路途徑、IL-23 信號(hào)通路途徑、調(diào)控腎上腺皮質(zhì)激素受體途經(jīng)、調(diào)控生物胺結(jié)合受體途經(jīng)（見圖5）。

圖5 附子-慢性心力衰竭-基因的生物學(xué)通路

3 討論

根據(jù)中醫(yī)辨證論治的原則，慢性心力衰竭屬于“心水”的范疇。該病以心氣心陽(yáng)虛為本，以血瘀、水停、痰飲為標(biāo)，治當(dāng)益氣溫陽(yáng)、活血利水。附子味辛、性大熱，是回陽(yáng)救逆的有效藥物之一，廣泛用于慢性心力衰竭或心肌梗死的治療[6]。但目前臨床上尚未系統(tǒng)地闡明附子治療慢性心力衰竭的物質(zhì)基礎(chǔ)和靶點(diǎn)[7]。本文擬構(gòu)建附子-慢性心力衰竭-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，從而系統(tǒng)地分析附子治療慢性心力衰竭的作用機(jī)制。

與附子- 慢性心力衰竭相互交聯(lián)的基因有17 個(gè)靶點(diǎn)，分別為ACE、NR3C2、NPPA、ADRA2C、ADRB1、TNF、HTR2B、ADRB3、PTGS2、IL-1β、AGTR1、IFNG、ALB、PTGS1、NRG1、CRP、IL-6。附子- 慢性心力衰竭- 基因數(shù)據(jù)集的功能包括類固醇激素受體激活、心率調(diào)節(jié)和血壓調(diào)節(jié)。這些功能還與心肌細(xì)胞代謝、心電圖活動(dòng)、血液灌注、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。此外，附子- 慢性心力衰竭- 基因數(shù)據(jù)集具有相似的生物學(xué)過程和多靶標(biāo)協(xié)同的特性。例如，CRP、IL-1β 及IL-6 水平的升高可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡，降低心室壁的順應(yīng)性，并可引起冠狀動(dòng)脈微血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)。靶向CRP、IL-6 和IL-1β 具有減輕心臟循環(huán)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的作用，并可改善心室的適應(yīng)性[8]。腎素- 血管緊張素系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)血管收縮、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。在慢性心力衰竭的狀態(tài)下，腎素-血管緊張素系統(tǒng)被激活，參與心臟前后負(fù)荷的形成，故治療指南中明確指出，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑是治療慢性心力衰竭的基本藥物，靶向血管緊張素轉(zhuǎn)化酶是治療該病的一個(gè)重要靶標(biāo)，而ACE、AGTR1 參與調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)[9-10]。NR3C2 的激活與過度炎癥反應(yīng)、纖維化及靶器官損傷的發(fā)生均具有密切的關(guān)系。NPPA 是心力衰竭的敏感標(biāo)志物。慢性心力衰竭患者的病情嚴(yán)重時(shí)，其NPPA 的水平可明顯上升。通過抑制NR3C2 的表達(dá)，可減輕心肌間質(zhì)纖維化的程度[11-12]。研究表明，使用可抑制PTGS1 和PTGS2 活性的非甾體抗炎藥可增加慢性心力衰竭的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。其原因?yàn)?，這兩種酶類可減少具有心臟保護(hù)作用的前列腺素E 的產(chǎn)生。ADRA2C 和ADRB1 均參與心肌收縮力、心率和血壓的調(diào)節(jié)過程。TNF 參與心臟重塑的過程。這表明，與附子- 慢性心力衰竭相互交聯(lián)的重疊靶標(biāo)的生物學(xué)功能在治療慢性心力衰竭中具有重要的作用[13-15]。研究證實(shí)，使用5-HT2B受體阻滯劑可明顯改善心臟肥大的癥狀，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度和細(xì)胞外細(xì)胞基質(zhì)活化的程度。ADRB3 具有抑制心肌纖維化的作用[16-17]。內(nèi)皮素拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、高級(jí)糖基化終產(chǎn)物抑制劑等治療慢性心力衰竭和糖尿病相關(guān)性心臟病的藥物大多作用于上述的途徑。本次研究的結(jié)果表明，附子可作用于上述的多靶點(diǎn)、多通路，具有治療慢性心力衰竭的潛在作用。

進(jìn)行GO 分析的結(jié)果顯示，附子治療慢性心力衰竭的生物過程與其調(diào)節(jié)血管收縮、炎癥反應(yīng)發(fā)生、血壓的水平及脂肪的分解、鈣介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、內(nèi)分泌的過程、免疫反應(yīng)等相關(guān)。進(jìn)行KEGG 通路富集分析的結(jié)果顯示，共篩選出4 條信號(hào)通路途經(jīng)，包括IL-27 信號(hào)通路途徑、IL-23信號(hào)通路途徑、調(diào)控腎上腺皮質(zhì)激素受體途經(jīng)和調(diào)控生物胺結(jié)合受體途經(jīng)。GO 和KEGG 富集的結(jié)果與附子- 慢性心力衰竭- 基因數(shù)據(jù)集涉及的生物功能相似。因此，我們推測(cè)，附子的活性成分可能通過作用于這些信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，達(dá)到治療慢性心力衰竭相的目的。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)附子治療慢性心力衰竭的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑進(jìn)行了初步的探討。本次研究的結(jié)果初步預(yù)測(cè)了附子治療慢性心力衰竭的分子機(jī)制，為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制提供了先導(dǎo)信息和基礎(chǔ)，也為研究成分更為復(fù)雜的中藥復(fù)方的作用機(jī)制提供了借鑒。