張倩文 王爽 祝穎 劉澤媛 余波 王斌

(青島大學基礎醫(yī)學院,山東 青島 266071)

人巨細胞病毒(HCMV)是一種普遍存在的病原體，屬于β皰疹病毒亞科，人群中的潛在感染率很高[1]。潛伏感染幾乎不會對健康個體造成嚴重威脅，但是在免疫功能低下的人群中如器官或造血干細胞移植者中，感染了HIV或患有淋巴細胞白血病的患者中[2]，先天性感染HCMV的新生兒中[3]，則會導致病毒活化和各種HCMV相關疾病[4-7]，增加家庭和社會的經(jīng)濟負擔。目前抗HCMV的藥物副作用較大，也沒有相應的疫苗被批準上市[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)HCMV可編碼大量病毒包膜蛋白[10]，其中gB和gH蛋白是兩種主要的糖蛋白，是病毒侵入細胞的必需蛋白[11]，也是抗病毒抗體應答的重要靶點，這兩個蛋白的被關注度最高[12]。目前亞單位疫苗針對gB蛋白研究較多，較少有將gH蛋白作為目標蛋白的研究。HCMV PP65蛋白是病毒支架蛋白，是病毒被膜中含量最豐富的成分[13]，在調(diào)節(jié)病毒激酶活性以及減弱宿主抗病毒反應中均發(fā)揮重要作用[14-15]，也是T細胞應答的主要靶點，在HCMV疫苗中可作為T細胞誘導的亞單位[16-19]。本研究利用生物信息學方法對gH和PP65蛋白的B、T細胞優(yōu)勢抗原表位進行預測，為HCMV亞單位疫苗的研發(fā)提供有價值的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 gH和PP65蛋白的二級結構預測

首先從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)中獲得gH和PP65蛋白的氨基酸序列。利用在線分析軟件SOMPA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)[20]對gH和PP65蛋白的二級結構進行分析，計算α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無規(guī)卷曲所占比例，明確β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲所在位點。

1.2 gH和PP65蛋白B細胞抗原表位預測

利用軟件ABCpred(http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/)、BCPREDS(http://ailab-projects1.ist.psu.edu:8080/bcpred/index.html)[21]以及BepiPred(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)[22]預測gH和PP65蛋白的B細胞抗原表位。對3個軟件預測結果中得分最高的前10個表位(如預測結果小于10個表位，則選擇所有表位)進行重疊，結合蛋白二級結構分析結果，得到gH以及PP65蛋白的B細胞抗原表位。

1.3 gH和PP65蛋白T細胞抗原表位預測

利用軟件NetMHC 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)[23-24]和IEDB(http://tools.iedb.org/mhci/)中的consensus方法[25]預測gH和PP65蛋白的CD8+T細胞抗原表位，等位基因選擇A1、A2、A3、A11和A24(CPF88.1%)[26]，對預測為strong binders和consensus score≤2的表位進行進一步分析。選擇兩個軟件預測結果中的重疊表位作為蛋白的CD8+T細胞抗原表位。

再使用軟件NetMHCⅡ 2.3 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCⅡ/)[27]和NetMHCⅡpan 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCⅡpan/)[28]預測gH和PP65蛋白的CD4+T細胞抗原表位，等位基因選擇DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301和DRB1*1501[29]，對預測為strong binders的表位進行進一步分析。選擇兩個軟件預測結果中的重疊表位作為蛋白的CD4+T細胞抗原表位。

1.4 抗原性分析

將上述得到的B細胞、CD8+T細胞以及CD4+T細胞的抗原表位利用軟件VaxiJen v.2.0 Server(http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html)進行抗原性分析，“TARGET ORGANISM”選擇病毒，閾值設為0.4，排除抗原性差的表位，獲得B、T細胞優(yōu)勢抗原表位。

2 結 果

2.1 gH和PP65蛋白的二級結構

gH蛋白氨基酸序列(ACL51144.1)全長共含有743個氨基酸；PP65蛋白氨基酸序列(ACL51152.1)全長含有561個氨基酸。gH蛋白二級結構的分析結果顯示，α-螺旋約占33.24%，β-折疊約占22.61%，β-轉(zhuǎn)角約占3.63%，無規(guī)卷曲約占40.51%，其中β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲所在位點為2～7、33～37、45～49、54～69、83～87、93～96、128～133、145～165、172～195、200～203、209～214、219～224、240～246、252～255、260～266、272～277、284～296、328～337、353～363、386～393、410～418、429～437、460～464、479～482、495～498、510～516、520～530、543～549、560～568、572～579、584～587、599～606、619～636、642～648、659～664、681～685、690～693、700～703、714～718(圖1A)。PP65蛋白二級結構的分析結果顯示，α-螺旋占19.07%，β-折疊占23.71%，β-轉(zhuǎn)角占4.28%，無規(guī)卷曲占52.94%，其中β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲所在位點為3～9、15～20、28～39、44～46、51～54、61～74、83～88、95～109、116～125、129～143、170～179、189～196、232～239、247～252、257～271、276～279、283～288、297～300、306～312、316～325、340～343、359～368、386～407、413～418、421～441、446～473、484～489、495～497、503～512、515～519、529～551、554～561(圖1B)。

2.2 gH和PP65蛋白的B細胞抗原表位預測結果

將ABCpred、BCPREDS和BepiPred在線軟件預測結果重疊后共得到2個gH蛋白B細胞抗原表位，再結合二級結構中β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲所在位點進行分析，得到gH蛋白B細胞抗原表位，其氨基酸位點為179～186，所對應的氨基酸序列為KGSHTTSG；同樣通過上述3個軟件預測的PP65蛋白B細胞抗原表位共6個，再結合二級結構分析中

A：gH蛋白，B：PP65蛋白，圖中h為α-螺旋，c為無規(guī)卷曲，e為β-折疊，t為β-轉(zhuǎn)角圖1 gH和PP65蛋白的二級結構分析結果

β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲所在位點進行分析，得到PP65蛋白B細胞抗原表位，其氨基酸位點分別為257～262、390～397、391～404、427～441和533～548，對應的氨基酸序列分別為TRNPQP、EGAAQGDD、GAAQGDDDVWTSGS、AGASTSAGRKRKSAS、PAAQPKRRRHRQDALP。

2.3 gH和PP65蛋白的T細胞抗原表位預測結果

2.3.1gH和PP65蛋白CD8+T細胞抗原表位預測結果 綜合在線軟件NetMHC 4.0 Server和IEDB中的consensus方法的預測結果，得到gH和PP65蛋白的CD8+T細胞抗原表位分別為34和10個，各等位基因及其對應的位點及氨基酸序列見表1～2。

表1 gH蛋白的CD8+T細胞抗原表位預測結果

表2 PP65蛋白的CD8+T細胞抗原表位預測結果

2.3.2gH和PP65蛋白CD4+T細胞抗原表位預測結果 綜合在線軟件NetMHCⅡ2.3 Server和NetMHCⅡpan 4.0 Server分析蛋白的CD4+T細胞抗原表位結果，得到gH和PP65蛋白的CD4+T細胞抗原表位分別為32和8個，具體等位基因及其對應的位點和氨基酸序列見表3～4。

表3 gH蛋白的CD4+T細胞抗原表位預測結果

表4 PP65蛋白的CD4+T細胞抗原表位預測結果

2.4 gH和PP65蛋白各抗原表位的抗原性分析

利用軟件VaxiJen v.2.0 Server對上述得到的B細胞、CD8+T細胞及CD4+T細胞抗原表位進行抗原性分析，排除抗原性較差的表位后，結果顯示，gH蛋白有20個CD8+T細胞優(yōu)勢抗原表位，15個CD4+T細胞優(yōu)勢抗原表位，1個B細胞優(yōu)勢抗原表位，PP65蛋白有8個CD8+T細胞優(yōu)勢抗原表位，8個CD4+T細胞優(yōu)勢抗原表位，3個B細胞優(yōu)勢抗原表位，各優(yōu)勢抗原表位的等位基因及其對應的位點、氨基酸序列及抗原性得分見表5～7。

表5 gH和PP65蛋白的B細胞優(yōu)勢抗原表位

表6 gH和PP65蛋白的CD8+T細胞優(yōu)勢抗原表位

表7 gH和PP65蛋白的CD4+T細胞優(yōu)勢抗原表位

3 討 論

隨著生物信息學技術的快速發(fā)展，在診斷試劑制備和多肽疫苗合成的前期工作中，多利用分子生物學輔助軟件進行蛋白抗原表位的預測，比用傳統(tǒng)實驗方法更省時高效。PP65蛋白中的495～503抗原表位與gB蛋白中的607～621抗原表位即是首先通過生物信息學預測得到的，然后再重組成蛋白，發(fā)現(xiàn)可誘導小鼠產(chǎn)生較強的體液免疫和細胞免疫反應[30]，證明通過生物信息學方法預測抗原表位具有一定的可靠性。

二級結構是B細胞表位的基礎。在蛋白質(zhì)的二級結構中α-螺旋和β-折疊對蛋白質(zhì)骨架起到穩(wěn)定的作用，而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲多位于蛋白質(zhì)表面，結構松散，易發(fā)生扭曲，成為抗原表位的可能性較大。因此本研究在預測B細胞抗原表位時以無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角作為B細胞抗原表位的候選區(qū)域。

T細胞抗原表位主要是由組織相容性復合體(MHC)Ⅰ類分子和Ⅱ類分子提呈，并分別被CD8+T細胞和CD4+T細胞識別。因此，本研究在預測T細胞抗原表位時分別對CD8+和CD4+T細胞抗原表位進行了預測分析。

不同的抗原分子激活免疫應答時需要不同的基因位點進行提呈，但是人群HLA的遺傳背景復雜，因此本研究選擇了具有代表性的等位基因，即5個MHC-Ⅰ類分子等位基因A1、A2、A3、A11和A24以及8個MHC-Ⅱ類分子等位基因DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301以及DRB1*1501[26]，預測了不同等位基因的抗原表位，克服了HLA的遺傳限制，實現(xiàn)了較高的人群覆蓋率。為避免單獨一種分析軟件預測抗原表位的局限性和提高結果的準確性，本研究采用了多個生物信息學的軟件同時進行了分析預測，以各結果的重疊表位作為優(yōu)勢抗原表位。

研究發(fā)現(xiàn)，HCMV的gB和gH蛋白是抗病毒抗體應答的重要靶點，但Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗顯示，gB蛋白亞單位疫苗與佐劑MF259(為水包角鯊烯乳劑配方，由角鯊烯、Tween280和Span285等組成)在體內(nèi)產(chǎn)生的抗體應答短暫，僅能夠維持幾個月[31]，因此本研究著重分析了gH蛋白的抗原表位。PP65是CD4+T細胞及CD8+T細胞的主要識別位點，在細胞免疫反應中發(fā)揮重要作用。本研究目的是通過生物信息學方法分析預測出產(chǎn)生抗體應答的重要靶點蛋白gH蛋白和產(chǎn)生細胞免疫反應的PP65蛋白的優(yōu)勢抗原表位，以期能夠用于HCMV亞單位疫苗的研究，但這些表位是否可以產(chǎn)生體液和細胞免疫反應，還需要通過體外和體內(nèi)的免疫激活實驗進行驗證。

綜上所述，gH蛋白有20個CD8+T細胞優(yōu)勢抗原表位，15個CD4+T細胞優(yōu)勢抗原表位，1個B細胞優(yōu)勢抗原表位，PP65蛋白有8個CD8+T細胞優(yōu)勢抗原表位，8個CD4+T細胞優(yōu)勢抗原表位，3個B細胞優(yōu)勢抗原表位，且都具有良好的抗原性。