楊丹丹 何冰 盧曉 郭芷含 李玉軍

(青島大學附屬醫(yī)院病理科，山東 青島 266003)

腎透明細胞癌起源于近曲小管，是成人腎臟原發(fā)惡性腫瘤中最常見的類型[1]。雖然根治或部分腎切除術以及靶向治療等在腎透明細胞癌患者治療中取得顯著效果，但仍有部分患者會復發(fā)、轉移甚至死亡[2]。了解腎透明細胞癌獨特的代謝途徑是診斷和治療腎透明細胞癌的關鍵[3]。因此，對腎癌發(fā)生機制進行研究，尋找新的生物標志物及治療靶點對改善腎透明細胞癌患者的預后具有重要意義。細胞色素P450 4(CYP4)家族是由CYP4A和CYP4F兩種亞型組成，它們催化所有形式的脂肪酸的ω-羥基化[4]。其中，CYP4A亞型在炎癥的激活和消解中具有雙重作用，并介導腫瘤生長和血管生成的關鍵調節(jié)物類二十烷酸(20-HETE)的形成[5]。研究發(fā)現(xiàn)，CYP4A11是CYP家族的主要成員之一，受PPARα調控，在人體肝臟和腎臟中含量最高[6]。Ki-67是一種參與核糖體RNA轉錄的核蛋白，目前常被作為細胞增殖活性的敏感指標。研究表明，Ki-67的表達與腫瘤的侵襲性及惡性程度相關，可用來評價腫瘤生物學行為[7]。本研究旨在觀察CYP4A11及Ki-67在腎透明細胞癌組織中的表達情況及相關性，并探討其與臨床病理學因素及患者預后的關系。

1 材料與方法

1.1 材料來源

收集我院2010年1月—2015年12月手術切除的151例腎透明細胞癌的組織標本，另取48例癌旁組織標本作為對照。所有納入的病例標本均為原發(fā)病灶，術前均未接受放化療。納入本研究的151例患者中，男95例，女56例；年齡28～87歲，平均年齡58.04歲，中位年齡59歲；腫瘤最大徑≤7 cm 127例，>7 cm 24例；WHO/ISUP核分級：Ⅰ級～Ⅱ級76例，Ⅲ級～Ⅳ級75例；臨床分期Ⅰ期～Ⅱ期126例，Ⅲ期～Ⅳ期25例；未發(fā)生遠處轉移129例，發(fā)生遠處轉移22例。

1.2 抗體與試劑

兔抗人多克隆CYP4A11抗體(克隆號ab3573，稀釋度1∶200)購自英國Abcam公司，Ki-67抗體(工作液)購自丹麥DAKO公司，其他試劑(工作液)為瑞士ROCHE公司產(chǎn)品。

1.3 檢測方法

使用ROCHE VENTANA全自動免疫組化染色機檢測腎透明細胞癌組織中CYP4A11及Ki-67的表達，按照說明書進行操作。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判讀

CYP4A11免疫組化檢測結果采用Histoscore法進行評分[8]。Ki-67指數(shù)判讀按照相關文獻報道的標準[2]。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析處理。CYP4A11在癌與癌旁表達比較采用Mann-Whitney檢驗；CYP4A11及Ki-67的表達與臨床病理特征的關系采用χ2檢驗；CYP4A11與Ki-67相關性應用Spearman等級分析；采用Cox回歸分析進行生存分析，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 CYP4A11在腎透明細胞癌和癌旁組織中的表達情況

腎透明細胞癌組織中CYP4A11定位表達于細胞膜或細胞質(圖1A)，在腎透明細胞癌伴肉瘤樣變區(qū)域中CYP4A11定位表達于細胞質(圖1B)，在癌旁組織中定位表達于細胞質(圖1C)。151例腎透明細胞癌組織中，51例呈高表達，100例呈低表達，而48例癌旁組織中，27例呈高表達，21例呈低表達，兩者比較差異有顯著性(Z=-2.100，P<0.05)。

2.2 CYP4A11表達與腎透明細胞癌臨床病理特征的關系

151例腎透明細胞癌中低級別腎透明細胞癌76例，高級別腎透明細胞癌75例。CYP4A11在低級別腎透明細胞癌中低表達60例，高表達16例，在高級別腎透明細胞癌中低表達40例，高表達35例。高級別腎透明細胞癌組織中CYP4A11的高表達率要顯著高于低級別腎透明細胞癌(χ2=11.072，P<0.05)。

A：CYP4A11在腎透明細胞癌中呈低表達，B：CYP4A11在腎透明細胞癌及伴肉瘤樣變區(qū)域中呈高表達，C：CYP4A11在癌旁組織中呈高表達。En Vision法染色，200倍圖1 CYP4A11在腎透明細胞癌及癌旁組織中的表達

CYP4A11的表達與患者性別及腫瘤最大徑、臨床分期、肉瘤樣變以及遠處轉移有關(χ2=4.438～10.930，P<0.05)；而與患者年齡無關。見表1。

2.3 Ki-67表達及其與腎透明細胞癌臨床病理特征的關系

Ki-67在低級別腎透明細胞癌中低表達69例，高表達7例，在高級別腎透明細胞癌中低表達34例，高表達41例。Ki-67在高、低級別腎透明細胞癌組織中的表達差異有顯著意義(χ2=35.971,P<0.05)。

Ki-67的表達與腫瘤最大徑、臨床分期、肉瘤樣變、遠處轉移有關(χ2=4.365～10.833，P<0.05)；而與患者性別、年齡無關。見表1。

表1 腎透明細胞癌CYP4A11及Ki-67表達與臨床病理學參數(shù)的關系

2.4 CYP4A11與Ki-67表達的相關性

151例腎透明細胞癌中，CYP4A11和Ki-67均高表達者26例，CYP4A11高表達Ki-67低表達者25例，CYP4A11低表達Ki-67高表達者22例，CYP4A11和Ki-67都低表達者78例。Spearman相關性分析顯示，腎透明細胞癌組織中CYP4A11與Ki-67表達呈顯著正相關(rs=0.231，P<0.05)。

2.5 腎透明細胞癌組織中CYP4A11及Ki-67表達與患者總生存時間的關系

本研究中151例腎透明細胞癌患者中隨訪成功138例，失訪13例，失訪率8.6%。單因素Cox回歸分析顯示，性別與腫瘤最大徑、WHO/ISUP核分級、臨床分期、肉瘤樣變、遠處轉移以及CYP4A11、Ki-67水平對患者總生存時間有影響。對上述指標進行多因素Cox回歸分析顯示，臨床分期、遠處轉移為影響腎透明細胞癌患者總生存時間的獨立危險因素。見表2。

表2 單因素和多因素Cox回歸模型分析腎透明細胞癌患者總體生存時間的影響因素

3 討 論

約70%腎透明細胞癌中VHL基因突變或者高甲基化導致pVHL表達失活，使得缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)大量增加并激活下游一系列缺氧反應基因，如血管內皮生長因子(VEGF)等，誘導血管生成、促進糖酵解及脂質沉積等，使其具有不同于正常腎小管上皮細胞的代謝特征。因此，典型腎透明細胞癌組織富含血管、糖原和脂質[9-12]。CYP4A11是CYP家族的主要成員之一，參與脂肪酸分解代謝以及催化20-HETE的形成，在調節(jié)血管張力、腎血流量和腎小管鈉轉運等方面發(fā)揮重要作用，并與腫瘤血管生成、增殖和轉移相關[13-19]。CYP4A11基因的啟動子區(qū)域中含過氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPARα)反應元件，PPARα調控CYP4A11。既往研究表明，PPARα基因在腎透明細胞癌、前列腺癌、腎乳頭狀細胞癌中均明顯下調，PPARα蛋白在透明細胞癌組織中的表達水平明顯低于癌旁正常組織，而且與生存不良密切相關，可作為臨床診斷和預后指標[20]。同時有研究表明，PPARα在高級別腎透明細胞癌組織中較低級別組織中表達增高[21]。CYP4A11在人體肝中含量最高，其次是腎臟，在其他器官中表達較低[6]。研究表明CYP4A11在肝癌中表達水平明顯低于正常組織，且與肝癌轉移和預后相關，而CYP4A11在三陰性乳腺癌、胰腺癌、結腸癌等組織中表達水平高于正常組織，其代謝產(chǎn)物20-HETE表達也增加[18，22-25]。20-HETE已被公認為是癌癥進展的關鍵調節(jié)因子，與VEGF等共同作用，促進細胞增殖、新生血管形成、腫瘤生長以及轉移[5,26-27]。CYP4A11參與細胞脂肪酸代謝，并促進非酒精性脂肪肝的形成[28]。本研究結果顯示，CYP4A11在腎透明細胞癌組織中的表達水平明顯低于癌旁組織，CYP4A11表達水平的變化提示其受PPARα的調控，而在腎透明細胞癌組織當中，CYP4A11在高級別腎透明細胞癌中的高表達率顯著高于低級別腎透明細胞癌，這可能表明CYP4A11在正常腎小管細胞和腎透明細胞癌細胞的脂肪酸代謝中發(fā)揮不同作用。具體機制有待于進一步探索。本研究評估CYP4A11在不同組織學級別的腎透明細胞癌中的表達，分析其表達與臨床病理特征的關系，發(fā)現(xiàn)CYP4A11與患者性別及腫瘤最大徑、臨床分期、肉瘤樣變、遠處轉移有關，提示CYP4A11可能參與腎透明細胞癌的惡性生物學行為過程，并對患者的生存及預后具有提示意義。腎透明細胞癌伴肉瘤樣分化是一種惡性程度更高的類型[29]。本研究結果發(fā)現(xiàn)CYP4A11在肉瘤樣區(qū)域中表達于細胞質且表達程度明顯高于周圍透明細胞癌區(qū)域。提示CYP4A11可能參與腎透明細胞癌的上皮間質轉化(肉瘤樣變)過程，這有待于進一步探索。

目前Ki-67通常被作為細胞增殖活性的敏感指標[2]。本研究結果顯示，Ki-67在腎透明細胞癌中的表達程度與腫瘤組織學級別、最大徑、臨床分期、肉瘤樣變、遠處轉移有關，而與患者性別、年齡無關。Spearman相關性分析顯示，腎透明細胞癌組織中CYP4A11與Ki-67表達呈正相關。CYP4A11以及Ki-67可以作為預測腎透明細胞癌患者生物學行為的有效指標，對腎透明細胞癌的預后評估具有指導意義。

本研究單因素分析顯示，性別與腫瘤最大徑、WHO/ISUP核分級、臨床分期、肉瘤樣變、遠處轉移以及CYP4A11、Ki-67水平對患者總生存時間有影響。對上述指標進行多因素分析顯示，臨床分期、遠處轉移為影響腎透明細胞癌患者總生存時間的獨立危險因素。以上生存分析結果說明腎透明細胞癌的轉移進展及預后不良與CYP4A11及Ki-67表達程度有關，兩者在判斷腎透明細胞癌患者預后中有潛在的價值。