禹雯怡 趙璐 孔憲琛 唐永平 萬梅 邱建忠 袁榮濤

(1 青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266003； 2 青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心)

牙源性角化囊腫(OKC)是一種單囊或多囊的牙源性發(fā)育性囊腫[1]，是臨床上較常見的良性頜骨病損，約占牙源性囊腫的10%[2]。OKC可作為單獨(dú)病變或痣樣基底細(xì)胞癌綜合征(NBCCS)的一部分出現(xiàn)，約5%的病例與NBCCS伴發(fā)[3]。OKC是頜骨最具爭(zhēng)議性的病理實(shí)體之一，其特征為具有高生長(zhǎng)潛力和復(fù)發(fā)傾向的局部侵襲性病變[4]。刮除術(shù)為目前臨床上治療OKC常用的方法，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高；開窗減壓配合二期手術(shù)或頜骨節(jié)段性切除術(shù)可用于較大囊腫的治療，但治療周期較長(zhǎng)，患者可能面臨較大的手術(shù)創(chuàng)傷，并且術(shù)后并發(fā)癥較多。揭示OKC發(fā)病機(jī)制是改進(jìn)該病治療方法的重要前提，然而其發(fā)病的起始因素及其分子機(jī)制目前仍不清楚。近年來研究表明，位于染色體9q22.3-q31上抑癌基因Patched(PTCH)突變及其引起的Sonic Hedgehog(Shh)信號(hào)通路的異常激活與OKC發(fā)病的關(guān)聯(lián)程度最大[5]。OKC囊壁上皮組織中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)及Ki-67表達(dá)強(qiáng)度高于含牙囊腫和根端囊腫組織[6]。囊腔內(nèi)正壓力促進(jìn)OKC上皮細(xì)胞炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)的表達(dá)，可能參與了刺激破骨細(xì)胞的生成和激活病變周圍骨吸收過程[7]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)就是采用高通量的測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序分析，本研究對(duì)利用RNA-seq獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選與OKC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的差異表達(dá)基因(DEGs)，并進(jìn)行功能富集和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，以期為OKC的靶向治療尋找潛在作用靶點(diǎn)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2019年1月1日—12月31日在我院口腔頜面外科接受手術(shù)治療，病理學(xué)證實(shí)為原發(fā)性非綜合征型OKC患者3例，男2例，女1例；年齡38～67歲，平均54歲。所有患者在標(biāo)本采集前均未接受任何其他治療。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(#2016-04-28-05)，并征得患者書面知情同意。

1.2 樣品收集和準(zhǔn)備

收集3對(duì)囊壁和正?？谇火つそM織(距離囊腫邊緣≥2 cm)標(biāo)本，離體后立即投入液氮中保存，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

1.2.1RNA提取與檢測(cè) 使用Trizol法提取組織RNA，Agilent 2100生物分析儀精確檢測(cè)RNA完整性，Nanodrop超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度。

1.2.2文庫(kù)構(gòu)建與質(zhì)控 使用Illumina的NEBNext?UltraTM RNA Library Prep Kit生成測(cè)序文庫(kù)。用附有Poly-T oligo(dT)的磁珠從總RNA中純化mRNA，隨后在高溫下使用二價(jià)陽離子在NEBNext第一鏈合成反應(yīng)緩沖液(5X)中將得到的mRNA進(jìn)行片段化。然后使用隨機(jī)六聚體引物和M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA，使用DNA聚合酶Ⅰ和RNase H合成第二鏈cDNA，隨后使用AMPure XP beads進(jìn)行cDNA純化。純化后的雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，采用AMPure XP系統(tǒng)對(duì)文庫(kù)片段進(jìn)行純化，篩選長(zhǎng)度為240 bp的cDNA片段。最后通過PCR富集方法得到cDNA文庫(kù)。

在Agilent 2100系統(tǒng)上評(píng)估cDNA文庫(kù)質(zhì)量，insert size符合預(yù)期后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)方法對(duì)文庫(kù)有效濃度進(jìn)行精準(zhǔn)定量，其中文庫(kù)的有效濃度應(yīng)大于2 nmol/L。

1.2.3上機(jī)測(cè)序 文庫(kù)質(zhì)檢完成后，根據(jù)目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量將不同的文庫(kù)進(jìn)行合并，隨后采用Illumina Novaseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，產(chǎn)生150 bp端讀數(shù)。RNA-Seq相關(guān)性分析結(jié)果表明，樣品間基因表達(dá)模式相似度質(zhì)量評(píng)估合格，樣本選擇合理。

1.3 生物信息學(xué)分析

測(cè)序片段測(cè)得的圖像數(shù)據(jù)經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)reads，隨后經(jīng)過過濾得到的數(shù)據(jù)為Clean Data，并將此數(shù)據(jù)與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)。根據(jù)基因在不同樣品或不同樣品組中的表達(dá)量進(jìn)行差異表達(dá)分析，以及DEGs功能注釋、功能富集表達(dá)水平分析等，其中DEGs的篩選條件如下：P-value<0.01& |log2(FC)|>1,P-value為差異顯著性P值，F(xiàn)C(Fold Change)為差異倍數(shù)。將3對(duì)OKC囊壁組織以及正?？谇火つそM織的DEGs根據(jù)樣本的FPKM值進(jìn)行分層聚類分析，得到聚類熱圖。采用火山圖表示基因整體分布情況，包括上調(diào)和下調(diào)2.0倍的DEGs及非DEGs。

2 結(jié) 果

2.1 基因轉(zhuǎn)錄本的差異分析

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，在3對(duì)OKC囊壁與正常口腔黏膜組織中總共檢測(cè)到23 609個(gè)基因，其中DEGs 359個(gè)，上調(diào)者169個(gè)，下調(diào)者190個(gè)。

2.2 基因聚類分析

將3對(duì)樣本的OKC囊壁和正?？谇火つそM織的DEGs進(jìn)行分層聚類分析，得到的聚類圖中可見OKC和正?？谇火つそM織能夠完整分開(圖1)，表明組內(nèi)樣本具有較好的重復(fù)性，組間對(duì)應(yīng)基因表達(dá)的差異性較大。圖中橫坐標(biāo)為樣品名稱以及樣品的聚類結(jié)果，縱坐標(biāo)為DEGs及基因的聚類結(jié)果。顏色表示基因在樣品中的表達(dá)量水平log10(gene+0.000 001)，紅色表示對(duì)應(yīng)基因在對(duì)應(yīng)組織中較高表達(dá)，綠色表示對(duì)應(yīng)基因在對(duì)應(yīng)組織中較低表達(dá)。

①～③：正?？谇火つそM織，④～⑥：OKC囊壁組織圖1 DEGs聚類熱圖

2.3 差異表達(dá)火山圖分析

火山圖展示了基因整體分布情況，OKC囊壁與正?？谇火つそM織的測(cè)序結(jié)果包括上調(diào)和下調(diào)2.0倍的DEGs(P<0.01)以及非DEGs。橫坐標(biāo)絕對(duì)值越大，說明OKC囊壁與正?？谇火つそM織間的表達(dá)量倍數(shù)差異越大；隨著縱坐標(biāo)值增大，差異表達(dá)顯著性增加，篩選結(jié)果可信度也越高。見圖2。

圖2 DEGs火山圖

2.4 DEGs功能富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)KEGG通路進(jìn)行富集分析，結(jié)果顯示OKC囊壁和正常口腔黏膜組織相比，注釋在磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號(hào)通路中的DEGs數(shù)目最多并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。圖中展示了20個(gè)KEGG條目，橫坐標(biāo)表示DEGs中注釋到該通路的基因比例與所有基因中注釋到該通路的基因比例的比值。即富集因子越大，說明DEGs在該通路中的富集水平越顯著。點(diǎn)的大小、形狀、顏色分別代表注釋在該通路中DEGs的數(shù)目、類型和q-value。

圖3 DEGs的KEGG通路富集分析圖

在DEGs的KEGG通路富集點(diǎn)圖(圖4)當(dāng)中，GeneRatio表示注釋在PI3K-Akt信號(hào)通路中的感興趣基因占所有DEGs數(shù)的比例最大，在展示前10位中排位第1，15個(gè)DEGs?？v坐標(biāo)為10個(gè)KEGG條目，橫坐標(biāo)表示注釋在該條目中的感興趣基因數(shù)與所有DEGs數(shù)的比值。點(diǎn)的大小表示DEGs數(shù)在該通路中的注釋，點(diǎn)的顏色代表校正后的P值。

圖4 DEGs的KEGG通路富集點(diǎn)圖

3對(duì)樣本測(cè)序結(jié)果富集到PI3K-Akt信號(hào)通路中的DEGs為15個(gè)，上調(diào)者8個(gè)，差異倍數(shù)由高至低分別為FGF5、IBSP、FGF9、SPP1、IL6、FN1、NR4A1、TNC。下調(diào)者7個(gè)，差異倍數(shù)由高至低分別為GYS2、PRLR、VEGFD、DDIT4L、FGFR3、LAMA3、YWHAB。

3 討 論

基于深度測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組分析提高了對(duì)DEGs、序列變異和新型融合轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)，是繼基因芯片技術(shù)后在基因檢測(cè)技術(shù)方面的重大突破，因此在癌癥研究中具有廣闊的前景[8]。OKC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)調(diào)控過程，可能存在多基因的突變及異常表達(dá)，本研究通過分析OKC囊壁與正常口腔黏膜組織間的基于RNA-seq獲得的數(shù)據(jù)，以期篩選與OKC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因及可能參與的信號(hào)通路。

OKC的發(fā)病機(jī)制尚未明確，一般認(rèn)為OKC的組織來源為Serres上皮剩余。在牙齒發(fā)育完成后這些本應(yīng)退化而殘留于頜骨內(nèi)的上皮剩余在不良刺激的誘導(dǎo)下可重獲增殖活性，發(fā)生囊性化繼而形成囊腫。還有學(xué)者認(rèn)為其來源于口腔黏膜上皮的基底細(xì)胞增殖[7]。目前對(duì)OKC的研究包括遺傳學(xué)因素、囊壁上皮細(xì)胞的增殖與凋亡、囊內(nèi)液體正壓力作用3個(gè)方面[9]。有研究證實(shí)PTCH1基因突變及其引起的Hh信號(hào)通路的異常激活可能是OKC發(fā)病的主要原因，高表達(dá)Shh、Smo以及Gli1的OKC可能與NBCCS相關(guān)[5]。經(jīng)典Hh通路(PTCH1-SMO-GLI1)和非經(jīng)典Hh通路(PTCH1細(xì)胞內(nèi)環(huán)通過與CyclinD1結(jié)合調(diào)控細(xì)胞周期)均可能參與OKC病變發(fā)生過程[10]。OKC中存在Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因的異常表達(dá)，Wnt5a、FZD3、MAPK10、PRKX、CAMK2A可能是通過調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化，在OKC的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[11]。表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯(EGCG)可能通過抑制WNT/JNK信號(hào)通路而抑制OKC角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。最近一些關(guān)于牙源性腫瘤的研究表明，OPG/RANK/RANKL信號(hào)通路參與了OKC引起的骨吸收過程，開窗減壓治療可促進(jìn)OKC附近骨的再生[13]。

本研究利用RNA-seq測(cè)序總共獲得了359個(gè)DEGs，其中169個(gè)上調(diào)，190個(gè)下調(diào)，表明樣本中基因組轉(zhuǎn)錄本具有顯著的差異。KEGG通路富集分析表明，PI3K-Akt信號(hào)通路中的DEGs數(shù)目最多且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢測(cè)到的15個(gè)DEGs可能為OKC潛在的生物標(biāo)志物。PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，參與腫瘤細(xì)胞的生存、增殖、周期進(jìn)展、生長(zhǎng)、遷移和血管生成等過程[14]。參與PI3K-Akt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)因子主要為負(fù)調(diào)節(jié)因子，包括PTEN、SHIP2等。MiR-21通過PTEN/PI3K/Akt通路調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡[15]。下調(diào)SHIP2基因，可通過PI3K-Akt通路增強(qiáng)喉鱗癌放射敏感性[16]。COX-2通過PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)骨肉瘤MG-63細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化以及遷移過程[17]。富集至PI3K-Akt信號(hào)通路中的DEGs中變化倍數(shù)最顯著的GYS2，其在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)亦顯著下調(diào)；敲低GYS2通過調(diào)節(jié)p53的表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)，證明了GYS2通過與p53的負(fù)反饋回路抑制乙肝病毒相關(guān)性肝癌的生長(zhǎng)[18]。在氧-葡萄糖剝奪/復(fù)氧模擬的腦缺血-再灌注損傷過程中，miR-145-5p可通過負(fù)調(diào)控FGF5促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和損傷[19]。

本研究中OKC囊壁組織中FGF9表達(dá)上調(diào)。研究顯示，相比于癌旁組織，胃癌組織中FGF9基因表達(dá)上調(diào)，且FGF9通過激活ERK和Akt信號(hào)通路增強(qiáng)胃癌細(xì)胞抗凋亡能力[20]。新型長(zhǎng)鏈非編碼RNA-FAF通過PI3K/Akt信號(hào)通路上調(diào)FGF9基因表達(dá)，進(jìn)而抑制缺血缺氧心肌細(xì)胞的凋亡[21]。沉默SPP1基因，可通過參與PI3K/Akt信號(hào)通路抑制舌癌的進(jìn)展[22]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6的異常和過度分泌可能導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),PI3K/Akt通路的激活對(duì)IL-6反式信號(hào)介導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞促炎癥反應(yīng)至關(guān)重要[23]。天然二苯乙烯類化合物在體內(nèi)具有抗炎作用，并且可能以PI3K/Akt依賴的方式下調(diào)IL-6的產(chǎn)生[24]。

Akt/mTOR通路在癌癥中的作用眾所周知，但很少有研究評(píng)估該信號(hào)通路在良性病變中的重要性。有研究發(fā)現(xiàn)Akt/mTOR通路在OKC組織中表達(dá)上調(diào)，該通路可能參與了病變的發(fā)生發(fā)展[25]?？紤]到該信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞增殖中的作用，可以解釋為什么OKC表現(xiàn)出高水平的細(xì)胞增殖活性、侵襲性以及復(fù)發(fā)傾向。全基因組芯片分析OKC轉(zhuǎn)錄組特征，聚類分析結(jié)果提示有兩個(gè)不同的分子亞型，Akt通路在一種亞型中被激活，MAP激酶通路在另一種亞型中被激活[26]。此外，PTCH1在兩個(gè)亞型中表達(dá)均下調(diào)，表明其可能參與了OKC病變的進(jìn)展。SHH/PTCH是一個(gè)已明確參與OKC發(fā)病機(jī)制的信號(hào)通路，在某些癌癥中，SHH/PTCH可以通過Akt/mTOR通路促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲以及轉(zhuǎn)移[27-28]。

總之，在本研究中篩選獲得的DEGs，其中一些已經(jīng)被認(rèn)為是腫瘤的潛在生物標(biāo)志物。研究OKC發(fā)病機(jī)制中所涉及的信號(hào)通路對(duì)于疾病的非手術(shù)治療很重要。OKC中存在PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)基因的差異表達(dá)，且注釋在該信號(hào)通路中的感興趣基因占所有DEGs數(shù)的比例最大，但目前的研究有一定的局限性，尚需要增加樣本量及進(jìn)一步的研究來闡明這些基因在OKC中的調(diào)控作用，并最終為OKC的靶向治療尋找潛在作用靶點(diǎn)。