郝 敏，夏 強(qiáng)，何 俊，孫楊贏，黨亞麗，曹錦軒，潘道東

（寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211）

烤鴨是我國(guó)傳統(tǒng)的燒烤類肉制品，以其獨(dú)特的風(fēng)味和品質(zhì)，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。烤鴨的加工工藝主要包括原料的處理、燙皮、上糖色、晾坯及烤制等，這種特殊的制作方法賦予了烤鴨皮脆、味美、肉質(zhì)鮮嫩、色澤鮮紅、油光閃閃的特點(diǎn)。對(duì)消費(fèi)者來(lái)說(shuō)，許多適口性特征，如顏色、外觀、質(zhì)地和風(fēng)味，都是影響肉制品選擇和接受的重要因素。因此，烤鴨工業(yè)的持續(xù)目標(biāo)之一就是改進(jìn)加工，提高烤鴨品質(zhì)?？绝喥ど珴墒菦Q定烤鴨品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。鴨皮顏色會(huì)直接影響消費(fèi)者對(duì)烤鴨的接受程度，對(duì)消費(fèi)者而言，適度的焦黃色可以增加食欲，過(guò)度的焦黃則會(huì)減少食欲?？绝喩珴蓙?lái)自于烤制過(guò)程中的美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)[1]?？绝喸诳局七^(guò)程中滿足美拉德反應(yīng)的一切條件，高溫下羰基化合物和氨基化合物反應(yīng)生成褐色物質(zhì)。焦糖化反應(yīng)在沒(méi)有氨基化合物存在，加熱到熔點(diǎn)以上糖脫水和降解的褐變反應(yīng)。

色素的提取在植物和微生物方面研究較多，有關(guān)烤鴨顏色的相關(guān)研究鮮有報(bào)道[2-3]。為探究熏雞糖熏上色機(jī)理，陸逢貴等[4]采用超聲輔助提取糖熏雞皮色素，為糖熏雞皮色素的高效提取以及糖熏雞顏色的研究提供相關(guān)理論依據(jù)。然而，關(guān)于色素組成及結(jié)構(gòu)分析的報(bào)道較少，并且目前使用的分析方法主要是氣相色譜法、分光光度法、核磁共振法、薄層層析法及毛細(xì)管電泳法[5]，這些傳統(tǒng)的分析技術(shù)在色素的定性及結(jié)構(gòu)分析上過(guò)程繁瑣，誤差大。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法是一種新的技術(shù)分析手段，用于復(fù)雜混合物的分析。高效液相色譜能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)復(fù)雜混合物的高分離，而質(zhì)譜法的選擇能力強(qiáng)、靈敏度高，能夠提供物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，兩者相串聯(lián)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定量和定性分析，還簡(jiǎn)化了樣品的前處理過(guò)程，使分析更簡(jiǎn)便[6]。目前，以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行的研究主要集中于醫(yī)學(xué)的藥物分析[7-8]、食品安全中有害成分的鑒別[9-10]等方面，對(duì)色素中復(fù)雜混合物的研究不多。孫嫵娟等[11]采用高效液相色譜法對(duì)黑米色素進(jìn)行分離，并對(duì)分離的組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果顯示黑米色素中主要含有矢車菊素-3-葡萄糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷[12]。這一研究結(jié)果為黑米色素的開發(fā)和利用做出了重要貢獻(xiàn)。

因此，研究烤鴨色素的組成和結(jié)構(gòu)，對(duì)于改善烤鴨皮的色澤品質(zhì)具有重要意義。本研究從烤鴨皮中提取色素，使用紫外-可見(jiàn)光譜、傅里葉變換紅外光譜（Fouriertransform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)其性質(zhì)、組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。以期為烤鴨顏色探究提供相關(guān)理論依據(jù)，為烤鴨工藝研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍充氣鴨坯（質(zhì)量約2.0 kg） 寧波王紹菲食品有限公司；飴糖 浙江省寧波市鑫創(chuàng)糖業(yè)；乙醇、甲醇（均為色譜純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；溴化鉀（分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KN-24電熱旋轉(zhuǎn)式烤鴨爐 嘉興艾博實(shí)業(yè)有限公司；CR-440色差儀 柯尼卡美能達(dá)辦公系統(tǒng)（中國(guó)）有限公司；FRQ小型超聲波清洗機(jī) 杭州法蘭特超聲波科技有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 西安禾普生物科技有限公司；Allgra 64R冷凍離心機(jī) 上海普迪生物技術(shù)有限公司；UV-1601PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)日本島津公司；FI-IR5700型FT-IR儀 美國(guó)Nicolet公司；UPLC-Synapt G2液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 烤鴨的制作[13]

解凍：室溫條件下解凍18 只新鮮凍鴨坯，隨機(jī)分為3 組，每組6 只。燙皮：沸水淋澆鴨皮。澆飴糖：將配制好的飴糖溶液（水和飴糖的比例為7∶1）均勻澆淋在鴨坯全身。晾坯：在一定的溫度和濕度下，風(fēng)干澆過(guò)飴糖的鴨坯表皮。烤制：設(shè)定相應(yīng)的溫度（200 ℃）和時(shí)間（40、60、80 min）將風(fēng)干的鴨坯掛入電熱旋轉(zhuǎn)式烤鴨爐烤制。

1.3.2 樣品的制備

隨機(jī)選取烤制40、60 min和80 min的烤鴨，用手術(shù)刀將鴨胸處的膨化鴨皮取下，將烤鴨皮切成約2 cm×2 cm的小塊，用錫箔紙包裝，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。真空包裝剩余烤鴨在-40 ℃下貯藏，并在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中取樣。

1.3.3 烤鴨皮的感官評(píng)價(jià)

從農(nóng)畜產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室選擇20 位從事肉制品研究的研究生組成感官評(píng)價(jià)小組，按照Kerth等[14]的要求對(duì)感官評(píng)價(jià)小組成員進(jìn)行培訓(xùn)，采用10 分制對(duì)烤鴨皮的顏色、外觀、質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、總體可接受性給出評(píng)分，具體評(píng)分參考劉歡等[15]的方法稍作修改。樣品切成2 cm的薄片放入盤中，隨機(jī)編號(hào)。評(píng)價(jià)員品嘗一個(gè)樣品之后用清水漱口，再進(jìn)行另一個(gè)樣品的評(píng)價(jià)，整個(gè)評(píng)價(jià)過(guò)程要求感官評(píng)價(jià)小組成員獨(dú)立完成。

1.3.4 鴨皮色澤測(cè)定

烤制過(guò)程中鴨皮的色澤測(cè)定采用CIE的L*、a*、b*法。室溫條件下使用D65光源，用色差儀對(duì)不同烤制時(shí)間鴨胸處鴨皮的L*（亮度）、a*（紅度值）、b*（黃度值）進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)10 次，取平均值作為鴨皮的色度值。

1.3.5 烤鴨皮色素提取工藝

烤鴨皮（烤制60 min烤鴨的鴨皮）→預(yù)處理（去除多余的皮下脂肪）→剪碎→取樣（2 g）→加乙醇→超聲處理（20 ℃、400 W）→離心→過(guò)濾→色素提取液→測(cè)定吸光度（210 nm）。

1.3.6 色素的紫外-可見(jiàn)光譜分析

使用分光光度計(jì)在200～800 nm波長(zhǎng)處對(duì)色素提取液進(jìn)行光譜掃描，得到烤鴨皮色素的紫外-可見(jiàn)光光譜圖。

1.3.7 FT-IR分析

色素經(jīng)過(guò)超濾、冷凍干燥后與光譜級(jí)溴化鉀粉末混合，然后研磨并壓制成小球在5700型FT-IR儀上進(jìn)行測(cè)定，波數(shù)范圍4 000～400 cm-1。

1.3.8 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

液相色譜條件：C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；乙腈-0.1%甲酸梯度洗脫，見(jiàn)表1。樣品質(zhì)量濃度0.5 mg/mL；進(jìn)樣量10 μL；流速1.0 mL/min。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of liquid chromatography

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子靈敏度模式檢測(cè)；毛細(xì)管電壓3.0 kV；錐孔電壓30 V；萃取電壓5.0 V；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣體溫度350 ℃。噴霧氣為高純氮?dú)猓慌鲎矚怏w為高純氬氣；反吹氣體流速80 L/h；脫溶劑氣體流速800 L/h。質(zhì)譜掃描范圍100～1 200 Da，掃描次數(shù)為0.3 s。校正曲線標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為甲酸鈉。實(shí)時(shí)校正標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)亮氨酸腦啡肽的m/z為556.277 1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 8.0中One-way ANOVA的Duncan’s Multiple Range Test模型序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05，差異顯著。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為。采用Origin 9.1進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評(píng)價(jià)結(jié)果

如圖1所示，烤鴨皮的顏色感官評(píng)價(jià)值在4.90～9.00內(nèi)變化，外觀感官評(píng)價(jià)值為5.00～8.50，風(fēng)味感官評(píng)價(jià)值在8附近上下波動(dòng)，質(zhì)構(gòu)感官評(píng)價(jià)值為4.41～8.90，整體接受性在5.10～8.23內(nèi)變化?？绝喸诟邷乜局七^(guò)程中發(fā)生褐變反應(yīng)生成棕褐色物質(zhì)，影響鴨皮色澤。不同烤制時(shí)間的烤鴨皮顏色差異顯著（P＜0.05）。相比40 min和80 min的烤鴨皮，烤制60 min的烤鴨皮顏色評(píng)分最高。綜合考慮外觀、質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味和整體可接受性指標(biāo)，選擇烤制60 min的烤鴨皮作為色素提取樣品。

圖1 不同烤制時(shí)間烤鴨皮的感官特性Fig. 1 Sensory properties of roast duck skin with different roasting times

2.2 烤制時(shí)間對(duì)烤鴨皮色澤的影響

表2 不同烤制時(shí)間的鴨皮顏色參數(shù)Table 2 Color parameters of roast duck skin with different roasting times

由表2可知，烤鴨皮的L*值、a*值和b*值差異顯著。在烤制過(guò)程中，隨著烤制時(shí)間的延長(zhǎng)，烤鴨皮亮度和黃度逐漸下降，紅度逐漸上升?？局?0 min時(shí)，鴨皮亮度最高，a*值最低，產(chǎn)品呈現(xiàn)金黃色：烤制60 min時(shí)，鴨皮亮度較高，呈暗紅色；烤制80 min時(shí)，鴨皮L*值最小，a*值較60 min的鴨皮小，呈現(xiàn)紅棕色。隨著烤制時(shí)間的延長(zhǎng)，鴨皮上的還原糖與氨基化合物不斷反應(yīng)或單糖本身在高溫下脫水和降解，鴨皮表面色澤從烤前的白色到金黃色，再到紅色（包括亮紅色和暗紅色），隨著反應(yīng)的加劇，深褐色物質(zhì)不斷生成，鴨皮由暗紅色變成棕色。所以要控制烤鴨的烤制時(shí)間，防止烤鴨皮變暗變黑。因此，結(jié)合感官評(píng)價(jià)的結(jié)果，選擇烤制60 min的烤鴨皮作為色素提取的樣品。

2.3 烤鴨皮色素的提取

色素的提取方法主要有浸提法和超聲輔助提取法[16]。浸提法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，提取率還低，相比之下，超聲輔助提取具備提取周期短、工序少、產(chǎn)率高的優(yōu)點(diǎn)。因此采用超聲輔助法對(duì)烤鴨皮色素進(jìn)行提取。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到烤鴨皮色素提取的最佳工藝參數(shù)[4]：最適宜提取液為乙醇，體積分?jǐn)?shù)為60%，超聲輔助提取時(shí)間30 min，液料比為10∶1（mL/g）。

2.4 烤鴨皮色素的紫外-可見(jiàn)光譜分析

圖2 烤鴨皮色素的紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig. 2 UV-VIS spectrum of pigment from roast duck skin

如圖2所示，色素的吸收范圍約為200～400 nm，最大吸收波長(zhǎng)為210 nm，270～280 nm處觀察到典型的小吸收峰，吸收值向可見(jiàn)區(qū)（380～780 nm）減小。這一吸收特性與Kimura等[17]研究的黑色素的紫外-可見(jiàn)吸收光譜相似。此外，270～280 nm這一區(qū)域的小峰通常出現(xiàn)在天然黑色素的光譜中，這歸因于與天然黑色素結(jié)合的蛋白質(zhì)[18]。

2.5 烤鴨皮色素的FT-IR分析

圖3 烤鴨皮色素的FT-IR圖Fig. 3 FT-IR spectrum of pigment from roast duck skin

如圖3所示，烤鴨皮色素的FT-IR在3 400 cm-1左右顯示出一個(gè)寬而強(qiáng)烈的峰，用于羥基（—OH）或氨基（—NH2）的特征吸收。氫鍵的形成[19]或N—H的拉伸振動(dòng)[20]使吸收峰波數(shù)下降且峰形變寬。2 925 cm-1和2 854 cm-1處的吸收峰是由C—H的拉伸振動(dòng)形成的—CH和—CH2的共振吸收峰。1627 cm-1處的強(qiáng)吸收峰表明色素分子中存在C＝O[21]。1 454 cm-1處的吸收峰由—CH2CH3的彎曲振動(dòng)引起。1 409 cm-1處的吸收峰是典型的甲基峰，也可能是C—N拉伸形成的[22]。C—O的拉伸振動(dòng)在1 200～1 045 cm-1處形成峰值，而925 cm-1處出現(xiàn)峰值是COC對(duì)稱拉伸的結(jié)果。在600～700 cm-1范圍內(nèi)的弱吸收峰表明，苯基上的氫原子被取代或者存在含有4 個(gè)以上的CH2基團(tuán)的長(zhǎng)鏈分子。此外，由C＝O和C＝C組成的共軛體系可以導(dǎo)致吸收峰向低頻移動(dòng)。C＝O、高共軛C＝C和長(zhǎng)鏈化合物的存在表明，脂質(zhì)氧化可能是烤鴨在烤制過(guò)程中鴨皮色素的形成原因之一。1 409 cm-1處的峰表明存在吡咯或吲哚NH基團(tuán)[23-24]。1 380 cm-1處的吸收峰為特征甲基峰。C—CH3的彎曲振動(dòng)在1 078 cm-1處形成峰值。色素的FT-IR光譜顯示，其主要吸收帶與先前研究的黑色素相似[25-26]。FT-IR光譜結(jié)果證明了CH3、CH2、C—O—H和C—O—C部分的存在。Yaylayan等[27]的研究表明，以葡萄糖醛酮或3-脫氧葡萄糖醛酮形式生成的呋喃糖，氧化后可形成羧酸衍生物，此外，1-脫氧葡萄糖也可以存在于呋喃糖中。羧酸衍生物和呋喃糖的聚合可以產(chǎn)生與FT-IR實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似的結(jié)構(gòu)。因此，可以推斷烤鴨在烤制過(guò)程中鴨皮主要產(chǎn)生類似于蔗糖的呋喃類物質(zhì)，表明存在糖苷連接的糖衍生物。以上結(jié)果表明，從烤鴨皮中分離出的色素是一種類似黑色素的色素。

2.6 烤鴨皮色素的鑒別

表3 烤鴨皮色素樣品鑒別結(jié)果Table 3 Mass spectrometric parameters of pigments from roast duck skin

圖4 烤鴨皮色素的高效液相色譜（A）和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜（MS1）（B、C）Fig. 4 HPLC profile (A) and typical mass spectra (B, C) of pigment compounds from roast duck skin

圖5 烤鴨皮色素中化合物的二次質(zhì)譜Fig. 5 Tandem mass spectra of pigment compounds from roast duck skin

純化后的色素用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析，如表3、圖4所示，色素的保留時(shí)間約為1.2 min（圖4A）。色素在電噴霧離子源正負(fù)掃描模式下的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜（MS1）如圖4B、C所示，烤鴨皮色素是含有多種化合物的混合物。圖4、5顯示，在m/z365.11處獲得了分子離子峰的最高強(qiáng)度（圖5A），表明色素中存在相對(duì)分子質(zhì)量為365.11的化合物（化合物1）。類似地m/z301.14處的分子離子峰（圖5B），表明另一種化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為301.14（化合物2）。鴨皮色素中還含有相對(duì)分子質(zhì)量分別為277.22（化合物3）、303.23（化合物4）、353.27（化合物5）和279.23（化合物6）的化合物。在化合物1中發(fā)現(xiàn)74的中性丟失（圖5A），這表明它含有長(zhǎng)鏈脂肪酸甲酯。該化合物可能是葡萄糖和果糖的低聚物，這與Sainz-Polo等[28]報(bào)道的結(jié)果一致。m/z301.14 [M＋H-17]＋（圖5B）處的碎片離子峰表明化合物2中—OH的丟失。如圖5C所示，化合物3中44的中性丟失可能由—CONH2的丟失引起，這意味著化合物3中存在酰胺基，可歸因?yàn)槊览路磻?yīng)?；衔?中也有44（—CONH2）的中性丟失（圖5D）。m/z303.23 [M＋H-18]＋處的碎片離子峰表明，化合物4可能含有—OH或—CHO基團(tuán)，其中通過(guò)消除反應(yīng)很容易失去水分子。Kim等[29]研究蔗糖、葡萄糖和果糖的Van Krevelen圖發(fā)現(xiàn)，由于H/C值較高，O/C值較低，氧化還原反應(yīng)中形成的一系列小化合物處于脫水線以上，其生成過(guò)程除了涉及脫水反應(yīng)，可能還發(fā)生脫氫、脫甲基等反應(yīng)。Limacher等[30]研究美拉德反應(yīng)中呋喃的形成提出了類似的氧化還原產(chǎn)物。這些化合物可能來(lái)源于脂肪氧化和焦糖化反應(yīng)。如圖5E所示，化合物5中—OH的損失在m/z[M＋H-17]＋處產(chǎn)生碎片離子峰。如圖5F所示，化合物6顯示了—CHO基團(tuán)的損失，通過(guò)消除反應(yīng)很容易損失一個(gè)水分子。

總的來(lái)說(shuō)，質(zhì)譜結(jié)果表明鴨皮色素由多個(gè)化學(xué)成分組成，包括長(zhǎng)鏈脂肪酸酯、齊聚物、氧化還原反應(yīng)產(chǎn)物和脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的衍生物。棕色色素中酰胺和醛的存在可能是美拉德反應(yīng)的結(jié)果。然而，這些數(shù)據(jù)不足以確定這些化合物的分子結(jié)構(gòu)?？蛇M(jìn)一步對(duì)烤鴨皮色素組分作定性、定量分析，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，探究影響烤鴨皮顏色的主要物質(zhì)。

3 結(jié) 論

采用紫外-可見(jiàn)光譜、FT-IR和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)超聲提取的烤鴨皮色素的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明色素中含有長(zhǎng)鏈化合物和官能團(tuán)為—OH、C＝O、—NH2和高共軛C＝C的化合物?？绝喥ど赜砷L(zhǎng)鏈脂肪酸酯、齊聚物、氧化還原反應(yīng)產(chǎn)物、脂肪氧化產(chǎn)生的衍生物以及酰胺和醛類等多種化學(xué)成分組成。色素的主要來(lái)源是美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物、焦糖化的熱降解和反應(yīng)過(guò)程中化合物的聚合。隨著烤鴨烤制時(shí)間的延長(zhǎng)，烤鴨皮色澤L*值逐漸下降，a*值和b*值上升?？绝喥ゎ伾焚|(zhì)主要受美拉德反應(yīng)速率和焦糖化反應(yīng)速率的影響，因此，在烤鴨烤制過(guò)程中，通過(guò)控制烤制溫度和烤制時(shí)間可以優(yōu)化烤鴨皮的顏色，進(jìn)而提高烤鴨品質(zhì)。然而色素中化學(xué)成分的復(fù)雜性表明，烤鴨皮的褐變也可能是多種反應(yīng)相互作用的結(jié)果。因此，對(duì)烤鴨皮色素的實(shí)際形成機(jī)理還需進(jìn)一步研究。