袁 帥，魯丁強，龐廣昌

（天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

現(xiàn)如今低溫貯藏和化學保藏是我國水果保鮮的兩個主要技術手段[1]，它們作為傳統(tǒng)的保鮮方法技術成熟，并且隨著不斷研究，優(yōu)點更加明顯的生物保鮮技術逐漸成為新興的現(xiàn)代保鮮方法[2-3]。但無論利用哪種技術手段，保鮮的目的都是為了延長水果壽命、延緩腐敗，從本質上來講就是保持水果生命活動的情況下，最大限度地減少其分解代謝[4-6]。代謝是生物體不斷進行物質、能量和信息交流過程所形成的網絡，生物體內各種酶則控制著代謝網絡有序進行[7]。溫度是影響酶活性及代謝作用最重要的因素之一[8]，低溫保鮮技術成為水果保鮮中應用最廣泛研究最成熟的一種方法，但是在貯藏過程中溫度對代謝影響的研究則比較少[9]。

保證生物體的一切生命活動的是能量，這種能量主要以三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的形式存在。在分解代謝過程中一方面經過糖酵解產生的丙酮酸在有氧條件下通過三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)產生ATP；另一方面中間代謝物脫氫產生NADH和H+，通過遞氫體將其中的氫質子和電子傳遞給氧生成水，并通過氧化磷酸化提供能量。TCA循環(huán)與氧化磷酸化都在線粒體中進行，兩種產能方式都需要充足的氧氣，但當機體內供氧不足時，代謝中產生的丙酮酸與NADH、H+只能在乳酸脫氫酶催化下生成乳酸。研究表明，乳酸鹽不僅與中心代謝途徑相偶聯(lián)，還可以通過乳酸穿梭作用，作為一種信號分子影響細胞甚至機體全身的代謝，并對諸多合成與分解代謝過程（如細胞呼吸作用、氧化磷酸化、糖異生等）起到關鍵的調節(jié)作用[10-12]。水果貯藏過程中沒有營養(yǎng)供給，延長貯藏期就需要盡量減少能量消耗即減少分解代謝。呼吸作用本質上就是氧化磷酸化，因此抑制呼吸作用即可以減少分解代謝，從而達到水果保鮮的目的。乳酸鹽作為調節(jié)呼吸作用中的一種關鍵物質，在貯藏保鮮中也發(fā)揮重要作用[13]。

水果保鮮在延長貯藏時間的同時也需要保證果實品質，糖分構成是影響果實品質的重要因素[14-15]，直接影響著果實口感、風味等特征，多種糖分中蔗糖尤其重要[16-18]。只有既延長水果的貯存時間又不影響其口感品質的貯藏溫度才是最適貯藏溫度。因此，減少糖類的分解代謝損耗，增加蔗糖的合成代謝，在水果貯藏中尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘印度青’蘋果（Malus pumilaMill.）于天津果園采摘，選取外觀完整無損傷、無病蟲害、大小質量相似、成熟度一致的蘋果作為實驗材料。

4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES）、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、1,3-二磷酸甘油酸（1,3-diphosphoglycerate，1,3-BPG）、二羥基苯乙酮（dihydroxyacetophenone，DHAP） 美國Sigma公司；蔗糖比色法檢測試劑盒武漢伊萊瑞特生物科技公司。

1.2 儀器與設備

3K15高速冷凍離心機 美國Sigma公司；J2-21高速冷凍離心機 美國Beckman公司；HVE-50高壓滅菌器日本Hirayama Manufacturing公司；SBA-40C生物傳感器分析儀 山東省科學院生物研究所；Fluoroskan Ascent FL熒光-化學發(fā)光檢測儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將采摘后的‘印度青’蘋果進行清洗擦干后放置于生化培養(yǎng)箱中，以本實驗室前期研究結果[19]作參照，設置0、2、5、10、15、20、40 ℃ 7 個溫度梯度，分別貯藏24 h（‘印度青’蘋果在貯藏24 h之后可以達到在該溫度下的一種穩(wěn)定的代謝狀態(tài)[9]）。實驗共需21 個蘋果，每個溫度設3 個平行，待貯藏24 h后取出，從中間部位橫截平面切開，從外向內進行取樣，將‘印度青’蘋果按圖1分為4 個部位，并分別標記為部位1、部位2、部位3、部位4[13]，其中部位1為果皮層，部位2、3為果肉層，部位4為果核層，除果皮層外，每層取2 cm厚度，果皮層只取外周果皮及相連少許果肉。將取的樣品立即用液氮冷凍防止氧化，并在液氮條件下研磨勻漿，最后將勻漿液全部轉移入離心管，以10 000×g、4 ℃離心10 min，收集上清液，并于-80 ℃條件貯藏。

圖1 ‘印度青’蘋果4 個部位分布圖Fig.1 Schematic diagram of four parts of ‘Indian Green’ apples sampled

1.3.2 ‘印度青’蘋果乳酸鹽和蔗糖代謝網絡圖的構建

根據代謝網絡的研究方法及代謝網絡的構建原則[20]，選擇糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）、TCA循環(huán)和蔗糖合成途徑為主要代謝途徑來構建代謝網絡，代謝過程中的多個中間代謝反應使得網絡圖過為復雜，因此將直線反應進行合并，將不在研究范圍內的代謝途徑忽略，減少構建的代謝網絡中代謝反應數(shù)目，從而得到簡化的蔗糖乳酸鹽代謝網絡圖（圖2）。

圖2 蔗糖、乳酸鹽代謝網絡圖Fig.2 Sucrose and lactate metabolic networks

表1 蔗糖、乳酸鹽代謝反應方程式[9]Table 1 Sucrose and lactate metabolic reaction equations[9]

表2 蔗糖、乳酸鹽代謝反應的質量平衡方程[9]Table 2 Metabolic flux model equations of sucrose and lactate metabolic reactions[9]

根據圖2將代謝網絡圖中的代謝反應方程式提取出來（表1），在整個蔗糖乳酸鹽代謝網絡中，有12 個需要測定的代謝速率（r1～r12），根據代謝網絡通量分析的原則[20]，由胞內中間代謝產物G6P、F6P、G3P、Pyr、Ac-CoA、G1P、UDPG、SUC-6-P可確定的質量平衡方程有8 個（表2）。假定胞內中間途徑的代謝物的量都處于擬穩(wěn)態(tài)，也就是這8 個途徑代謝物在機體內的穩(wěn)態(tài)環(huán)境狀態(tài)下沒有積累，它們的質量平衡方程都為0，就可以得到關于12 個代謝速率的8 個約束向量；此時該系統(tǒng)的自由度F＝4。而代謝產物系統(tǒng)中的NADH的代謝速率（P＝r9-r10+r11+r12）可通過實驗測得，乳酸鹽（Lac）代謝速率r10、蔗糖（Suc）代謝速率r7和葡萄糖（Glu）代謝速率r1也可以通過實驗測定的，因此可以得到唯一解，進而通過計算方程得到蔗糖和乳酸鹽的通量[21]，從而計算出所構建的代謝網絡圖中的每一條代謝途徑的通量。

為了提升企業(yè)人力資源管理水平，實現(xiàn)真正的“公平、公正、合理”，管理人員需要保證員工基本的福利待遇，堅持公平的分配原則；健全綜合激勵機制，豐富激勵方式，保證人力配置與崗位標準相符合，實現(xiàn)企業(yè)的良性管理。

1.3.3 葡萄糖、乳酸鹽、NADH和蔗糖含量的測定

不同貯藏溫度的‘印度青’蘋果不同部位中葡萄糖和乳酸鹽的含量通過生物傳感器分析儀測定，蔗糖含量的測定通過蔗糖比色法檢測試劑盒測定。NADH含量的采用熒光-化學發(fā)光檢測儀通過酶法進行測定，具體參考文獻[22-24]的方法，其反應體系為0.25 mmol/L HEPES/EDTA緩沖液、100 mmol/L KCl、10 mmol/L MgSO4、3 mmol/L 1,3-二磷酸甘油酸、0.5 mmol/L DHAP、0.4 U/mL GAPDH。再按照文獻[20]的方法，得到代謝網絡圖中葡萄糖、蔗糖、乳酸鹽、NADH的通量，由于通量為單位時間與速率的乘積，而實驗中貯藏時間是一致的，因此速率結果可近似看作通量結果，由此得到了r1、r7、r10、P。

1.4 通量系數(shù)矩陣的計算

使用Matlab軟件以及SPSS軟件進行數(shù)據處理，通過表2質量平衡方程將各個中間代謝物所對應方程的系數(shù)提取出來（例如G6P系數(shù)為1，-1，-1，-1，0，0，0，0，0，0，0，0），建立一個系數(shù)矩陣G[20]（式（1）），該矩陣行表示可以用于擬穩(wěn)態(tài)假設的8 個中間代謝物以及可測定的NADH，即9 個約束向量；列表示代謝模型中包括的12 個生化反應，矩陣中的數(shù)值則表示相應的化學計量系數(shù)。V表示r1～r12速率向量的方向矩陣。

整個體系處于擬穩(wěn)態(tài)下，通過矩陣G和矩陣V可以將總體化學計量方程表示出來，具體見式（3）。

對公式（3）進行求解時，首先將G拆解成兩個子矩陣，第一個是已知終產物通量（r1、r7、r10、P）的系數(shù)矩陣，第二個是剩余未知中間代謝物通量的系數(shù)矩陣；然后將第二個矩陣進行負逆矩陣處理后與第一個矩陣相乘得到一個新矩陣G’。再用G’代替G，將G’、V代入公式（3）并進行變形可得到公式（4）。將r1、r7、r10、P的數(shù)值代入公式（4），可求得其他反應速率，即各個反應的通量，從而得到‘印度青’蘋果蔗糖乳酸鹽代謝通量網絡圖。

2 結果與分析

2.1 ‘印度青’蘋果不同部位蔗糖、乳酸鹽代謝網絡通量圖的分析結果

圖3 ‘印度青’蘋果不同部位蔗糖、乳酸鹽通量圖Fig.3 Sucrose and lactate flux in different parts of ‘Indian Green’ apples

由實驗測得7 個不同溫度（0、2、5、15、20、40 ℃）下貯藏的‘印度青’蘋果蔗糖、葡萄糖以及乳酸鹽的代謝速率，將其帶入平衡方程，即可得到‘印度青’蘋果蔗糖和乳酸鹽代謝網絡通量圖（圖3）。從代謝通量網絡圖中可以看出，在整體趨勢下，不同貯藏溫度下的‘印度青’蘋果蔗糖和乳酸鹽代謝通量有明顯不同，并且在同一溫度下不同部分的蔗糖和乳酸鹽代謝通量也有較大區(qū)別。由圖3A可知，在部位1中，在2 ℃的條件下進入PPP的通量比其他6 個溫度均少，在該溫度下更多地流向糖酵解和蔗糖合成途徑；由丙酮酸分支來看，中間溫度（5、10 ℃和15 ℃）進入TCA循環(huán)途徑的通量較多，有氧呼吸較強。蘋果作為呼吸躍變型果實，在果實成熟后存在著一個呼吸高峰，當溫度適宜，即溫度在5、10 ℃和15 ℃時，蘋果呼吸作用會增強，而當溫度降低時，呼吸作用明顯降低。

由圖3B可知，在部位2中，2 ℃和5 ℃對比其他溫度進入PPP途徑的通量較少，其他溫度都有較高PPP途徑通量，0 ℃下進入PPP的通量甚至超過總通量的一半。再觀察丙酮酸分支，0 ℃時進入TCA循環(huán)途徑通量較少，而在5、10 ℃和15 ℃溫度下進入TCA循環(huán)通量大，說明這3 個溫度下有氧呼吸較強。

由圖3C可知，在部位3中，2 ℃條件下進入PPP途徑的通量甚至變?yōu)樨撝?，在網絡圖中可認為該處反應反向進行，并且該溫度下進入蔗糖途徑的通量明顯高于其他溫度；20 ℃和40 ℃下進入PPP的通量遠多于其他溫度。對于丙酮酸分支，依然遵循著中間溫度（5、10 ℃和15 ℃）進入TCA循環(huán)途徑的通量高于其他4 個溫度。

由圖3D可知，在部位4中，2 ℃和15 ℃兩個溫度下進入PPP途徑的通量較少，這說明這兩個溫度下合成其他物質如核酸、蛋白質等的能力降低，反而進行蔗糖合成反應增加。再觀察丙酮酸分支，0 ℃下進入TCA循環(huán)途徑的通量略高于2 ℃，但總體依舊呈中間溫度（5、10 ℃和15 ℃）有氧呼吸強度高，低溫（0 ℃和2 ℃）與高溫（20 ℃和40 ℃）有氧呼吸強度低的特征。

總體來說，蘋果作為呼吸躍變型果實，在適宜溫度下（5、10 ℃和15 ℃）會出現(xiàn)明顯的呼吸高峰，有氧呼吸增強，從而使得其分解代謝增強不利于貯存。隨著溫度的降低，有氧呼吸也會逐漸減弱，但并不是溫度越低呼吸越弱，在0 ℃時，由于溫度過低而導致機體內酶活力降低，從而引起冷應激[25]，增加分解代謝提供能量，加大酶表達量來維持生命活動，使得有氧呼吸增強，不利于貯藏。在不同溫度下，‘印度青’蘋果進入TCA循環(huán)途徑的通量都大于乳酸鹽通量，即有氧呼吸在不同溫度、不同層區(qū)中都是主要的呼吸方式。

2.2 ‘印度青’蘋果不同部位蔗糖代謝通量的分析結果

糖分構成是影響果實品質的一個重要的因素[26]，現(xiàn)有研究表明，蘋果果實中糖分的積累受韌皮部卸載、跨膜運輸、碳水化合物代謝及相關酶活性等方面的調控[27]，其中蔗糖是參與蘋果果實中糖卸載的一種重要物質，并且還是細胞代謝的調節(jié)因子[28]，可能通過影響基因表達發(fā)揮作用；因此蔗糖在與蘋果品質形成有關的代謝中起著重要作用[29]。

圖4 不同溫度下‘印度青’蘋果4 個部位的蔗糖通量Fig.4 Sucrose flux in four parts of ‘Indian Green’ apples at different storage temperatures

從圖4可以看出，2 ℃時蔗糖通量明顯高過其他溫度，且此溫度下果肉部分（部位3與部位2）的蔗糖通量高于其他部位。按照溫度變化來看，部位1～4蔗糖通量的方差分別為：4.257、7.376、8.626和2.250，可以看出部位4即靠近果核部位蔗糖通量變化最小，最穩(wěn)定，對溫度變化不敏感。部位2、3即果肉部位蔗糖通量受溫度影響大，并且在2 ℃時出現(xiàn)最大值，顯然該溫度下利于葡萄糖流向蔗糖這一代謝途徑。蔗糖作為蘋果中一種重要的糖分構成，對蘋果貯藏期各種代謝物的協(xié)調交流起著重要作用[16]，同時也影響著果實的品質。因此降低葡萄糖的分解代謝，增加蔗糖的合成代謝就意味著可以延長蘋果的貯藏時間。綜上，2 ℃時蔗糖合成的通量更多，是‘印度青’蘋果更合適的貯藏溫度。

2.3 ‘印度青’蘋果不同部位乳酸鹽代謝通量的分析結果

乳酸鹽可以通過單羧酸運載體在組織、細胞中穿梭運輸[30]，并調節(jié)機體合成與分解代謝以及呼吸作用。葡萄糖在細胞內經過糖酵解產生丙酮酸，而丙酮酸則會在線粒體中被徹底氧化產生能量以及水和二氧化碳，但當呼吸作用受到抑制時，丙酮酸會轉化為乳酸，并通過乳酸穿梭作用到達機體其他部位而被利用。因此，高的乳酸鹽通量可以作為氧化呼吸代謝受限制的標志，也可以說明部分合成代謝的增強。在‘印度青’蘋果的貯藏中，需要減少其呼吸作用，從而延長其保存期限。

圖5 不同溫度下‘印度青’蘋果4 個部位的乳酸鹽通量Fig.5 Lactate flux in four parts of ‘Indian Green’ apples at different storage temperatures

由圖5可以看出，2 ℃條件下乳酸鹽通量最高。在生物體內存在著持續(xù)的能量、物質交換，這些交換越少說明機體越穩(wěn)定，存活時間也就越長?！《惹唷O果在貯藏過程中，表皮接觸空氣而果核則不能接觸空氣，這就會使得各個部分之間呼吸作用具有差異，這種呼吸作用差異的出現(xiàn)就會使各個部分間乳酸鹽通量產生差異。0、2、5、10、15、20、40 ℃條件下4 個部位乳酸鹽通量的方差分別為0.345 1、0.005 2、0.224 9、0.033 4、0.212 6、0.021 8、0.01 31。方差越低說明各個部位間的乳酸鹽通量差異越小，呼吸交換越少，狀態(tài)越穩(wěn)定，可以看出在2 ℃下方差最小，10、20 ℃和40 ℃方差也都較小，但0、20 ℃和40 ℃下乳酸鹽通量低，說明在這3 個溫度下，雖然機體到達平衡但處于高呼吸作用下，不利于貯藏。通過乳酸鹽通量及其方差綜合來看，2 ℃時乳酸鹽通量高，且各部位之間差異小，機體處于穩(wěn)態(tài)，有利于限制呼吸作用，從而更好地減小蘋果的呼吸高峰值，使貯藏時間延長。

3 討 論

本研究進行了不同溫度下‘印度青’蘋果的蔗糖和乳酸鹽代謝網絡通量分析，結果表明：在2 ℃時‘印度青’蘋果的蔗糖合成通量較高，部位1～4分別為32、42、47和33，糖分解代謝水平較低，并且部位2、3蔗糖合成通量最高，使其口感品質在貯藏期間仍維持在較高水平。蘋果是典型的呼吸躍變型果實，而乳酸鹽在水果的貯藏保鮮中發(fā)揮重要作用[31]，它的通量反映了呼吸代謝的受限狀態(tài)和合成代謝的增強情況，在2 ℃條件下乳酸鹽通量在‘印度青’蘋果的各個部位都處于較高的水平，部位1～4分別為1.87、1.86、1.86和1.86，此溫度下貯藏更有利于降低呼吸代謝，延緩呼吸高峰出現(xiàn)的時間。植物在成長過程中CO2在葉綠體內經過卡爾文循環(huán)轉化為糖[32]，從而產生糖的累積。而在貯藏階段，果實中的糖分不能通過光合作用補給，為使‘印度青’蘋果長期貯藏依然保持良好口感就需要糖異生的過程，將蘋果酸、甘梨醇等轉化為糖[33]，通過實驗中乳酸鹽、蔗糖通量比較，乳酸鹽也可能通過糖異生過程轉化為蔗糖，降低呼吸作用，使果實產生的乳酸也可能會反饋為蔗糖，從而保持‘印度青’蘋果長時間貯藏及良好口感。綜合蔗糖代謝通量以及乳酸鹽代謝通量可以得出，2 ℃是‘印度青’蘋果的最適貯藏溫度。這一結論也與諸多品種蘋果貯藏溫度范圍的研究結果[34-36]相一致。實驗所得到的結果可為今后水果貯藏保鮮的條件優(yōu)化提供新的研究思路，并從代謝這一整體角度為水果貯藏保鮮提供新的參考。