童盼盼，張亞若 ，梁豐志 ，吳翠云 ，2，王江波 ，2

（1.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院/南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

棗（Ziziphus jujubaMill）是鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Ziziphus）植物，是中國重要的干果樹種，因其抗旱耐脊且棗果速豐、營養(yǎng)豐富尤其是維生素含量高、入藥還可潤心肺、益氣養(yǎng)容等優(yōu)點(diǎn)，在促進(jìn)農(nóng)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和改善生態(tài)環(huán)境方面居于十分重要的地位［1］。據(jù)近幾年的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，全國棗果年產(chǎn)量占世界99%以上，干果產(chǎn)量排名第一［2］。棗作為南疆重要的經(jīng)濟(jì)作物，是農(nóng)民脫貧致富的途徑之一，但隨著近年來新疆棗產(chǎn)業(yè)過剩，提質(zhì)增效迫在眉睫。棗品質(zhì)的好壞與棗的糖酸比息息相關(guān)，糖酸比是果實(shí)中總糖與總酸的比值，可以影響果實(shí)的口味、品質(zhì)以及保質(zhì)期，同時(shí)也是決定棗果實(shí)商品價(jià)值優(yōu)劣的重要指標(biāo)［3］。因此，棗糖酸代謝機(jī)制始終是研究者們關(guān)注的熱點(diǎn)。

有機(jī)酸是果實(shí)品質(zhì)的重要組成部分，果實(shí)類型不同有機(jī)酸組成及其變化也不同，通常以蘋果酸［4］、檸檬酸［5］為主，趙愛玲等［6］研究發(fā)現(xiàn)棗果實(shí)中有機(jī)酸主要是蘋果酸、奎寧酸和琥珀酸，其中蘋果酸含量最高，屬蘋果酸優(yōu)勢型，而總酸及各組分酸的含量在不同品種間存在極顯著差異。張春梅［7］基于全基因組重測序，找到了4 個(gè)酸代謝關(guān)鍵基因并發(fā)現(xiàn)棗果實(shí)有機(jī)酸主要為蘋果酸，而酸棗果實(shí)主要為蘋果酸和檸檬酸。陳昕［8］通過研究蛋白質(zhì)表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)ZjATP-CS1、ZjACO1 和 ZjACO2 是造成酸棗中檸檬酸積累的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，ZjMDH3、ZjMS 和ZjNADPME3 是造成酸棗中蘋果酸積累的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。馬倩倩［9］研究發(fā)現(xiàn)在棗果實(shí)發(fā)育過程中，ZjCS 相對表達(dá)量的變化趨勢與檸檬酸含量的變化趨勢基本一致，檸檬酸的積累主要受ZjCS 的正調(diào)控作用，在酸棗果實(shí)中，蘋果酸的積累主要受NAD-MDH 酶催化，又受到ZjMdh 的正調(diào)控作用。前人已經(jīng)初步闡明了棗和酸棗果實(shí)糖酸風(fēng)味差異的分子機(jī)制。但目前對影響棗主栽品種果實(shí)發(fā)育時(shí)期酸組分含量變化及相關(guān)基因差異研究尚無報(bào)道，還需深入系統(tǒng)研究。

為了填補(bǔ)這方面的空缺，明確棗主栽品種果實(shí)發(fā)育時(shí)期主要酸組分含量變化與相關(guān)基因差異，本試驗(yàn)以冬棗、灰棗和駿棗3 個(gè)棗主栽品種為試材，通過液相色譜儀分析各個(gè)品種不同時(shí)期主要酸含量組分變化，明確棗主栽品種果實(shí)在不同發(fā)育時(shí)期主要酸組分含量的積累模式，并對棗果實(shí)進(jìn)行RNA 提取、cDNA 反轉(zhuǎn)錄、qPCR 基因表達(dá)模式分析，進(jìn)而作出棗主栽品種主要酸含量動(dòng)態(tài)變化與相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)分析，旨在為今后棗樹的分子育種和遺傳改良奠定基礎(chǔ)，并加快棗分子育種進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料

以新疆主栽的3 個(gè)棗品種為試驗(yàn)材料，分別為以鮮食為主的冬棗、鮮食制干兼用的灰棗和駿棗，材料采摘于塔里木大學(xué)園藝試驗(yàn)站棗種質(zhì)資源圃，該資源圃地處北緯40°32′，東經(jīng)81°17′，平均海拔1 100 m，晝夜溫差大，降水稀少，光照時(shí)間長，土壤為輕鹽化土［10］。其樹體生長結(jié)果良好，樹勢較為均一，無大小年現(xiàn)象，灌溉條件較好，管理水平較高。

于8 月初對栽培條件、管理水平及樹齡大小一致的3 個(gè)主栽品種每隔10 d 進(jìn)行1 次取樣，3 次重復(fù)。每份樣品從東南西北各個(gè)方向隨機(jī)采集30 個(gè)棗果，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，及時(shí)將棗果果肉分離，并將其隨機(jī)分成3 份用液氮速凍后放入超低溫冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 酸組分含量的測定（高效液相色譜法）

1）液相色譜條件。色譜柱為Inertsil AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；二極管陣列檢測器；波長210 nm；根據(jù)樣品量自行調(diào)控時(shí)長；流速0.8 mL/min；流動(dòng)相為0.04 mol/L KH2PO4緩沖液，用磷酸溶液將其 pH 調(diào)配至 2.6~2.8。

2）標(biāo)準(zhǔn)品制備。分別精密稱取蘋果酸、檸檬酸、奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水將其配制為10 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取適量上述對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，加去離子水制成蘋果酸、檸檬酸、奎寧酸均為1 mg/mL的混合對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，待測。

3）提取液制備。參照馬倩倩等［11］方法，精密稱取 1 g 果肉，加入 5 mL 0.04 mol/L KH2PO4（pH 2.6~2.8），研磨成勻漿，冰浴超聲提取 20 min 后，轉(zhuǎn)至4 ℃離心機(jī)4 000 r/min 離心10 min，取上清液，殘?jiān)貜?fù)加入磷酸緩沖液進(jìn)行提取，最后定容至10 mL 容量瓶，過 0.22 μm 微孔濾膜待測。

4）含量測定。通過美國Agilent 公司生產(chǎn)的高效液相色譜儀1260 進(jìn)行測定，根據(jù)酸組分回歸方程對棗果實(shí)中酸組分進(jìn)行定量。

1.2.2 棗果相關(guān)基因表達(dá)檢測

1）RNA 提取。用生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)的B518661 柱式植物總RNA 抽提純化試劑盒進(jìn)行提取，根據(jù)說明書上的方法進(jìn)行操作。

2）RNA檢測。①取2 μL RNA，用NanoDrop 2000檢測并記錄濃度和質(zhì)量，濃度最好>300 ng/μL，A260/A280值在1.8~2.1，說明RNA 質(zhì)量較好，大于2.1 或小于1.8 為純化不合格的樣品，需要重新純化。②1 倍TAE 中1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測，完整的未降解的RNA 電泳圖譜可清晰看到18S rRNA、28S rRNA、5S rRNA 的 3 條帶，且 28S rRNA 的亮度應(yīng)為 18S rRNA 的 2 倍。

3）cDNA 第一條鏈的合成。用南京諾唯贊生物科技有限公司生產(chǎn)的Z005163HiScriptⅢ1st Strandc DNASynthesisKit 試劑盒進(jìn)行合成，根據(jù)說明書上的方法進(jìn)行操作。

4）熒光定量PCR 檢測。參考張春梅［7］研究結(jié)果以UBQ基因作為qPCR 內(nèi)參基因，用北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的AQ141-02 Trana Start Tip Greenq PCRSuperMix 試劑盒對棗酸代謝相關(guān)基因的相對表達(dá)量進(jìn)行比較（引物序列見表1）。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的樣本數(shù)和重復(fù)點(diǎn)樣次數(shù)將藥劑加入酶標(biāo)板中，用封膜密封后放入美國生產(chǎn)的ABIQ5 熒光定量qPCR 儀中，按以下條件進(jìn)行。HoldStage：1.6 ℃/s 升溫至 94 ℃保 持 30 s；PCRStage：94 ℃保持 5 s，以1.6 ℃/s 速度降至 60 ℃并保持 30 s，循環(huán) 42 次；Melt CurveStage：以 1.6 ℃/s 速度升至 95 ℃保持 15 s，以1.6 ℃/s 速度降至 60 ℃保持 1 min，以 0.075 ℃/s 上升至95 ℃保持15 s。默認(rèn)條件下讀取CT值，試驗(yàn)結(jié)果依據(jù)Livak 等［12］的方法，每個(gè)基因均以第一發(fā)育階段的表達(dá)量為參比，計(jì)算2-ΔΔCT值進(jìn)行相對表達(dá)量分析，每個(gè)發(fā)育期樣品基因表達(dá)量為3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值。

表1 qPCR 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel 2010 軟件對調(diào)查數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，DPS方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將有機(jī)酸混合對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 等不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.22 μm水系微濾膜過濾，依次進(jìn)樣10 μL，上機(jī)測定峰面積，以有機(jī)酸濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程（表2），相關(guān)系數(shù)為0.996 95~0.999 69。

表2 酸組分測定的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.2 棗主栽品種不同時(shí)期酸組分含量變化與相關(guān)基因表達(dá)分析

2.2.1 冬棗不同時(shí)期酸組分含量變化與相關(guān)基因表達(dá)分析 由圖1 可知，在冬棗果實(shí)發(fā)育過程中，3 種酸組分含量變化呈先增加后降低的趨勢，其中檸檬酸在8 月13 日至9 月2 日一直占主導(dǎo)地位，與蘋果酸、奎寧酸變化趨勢一致，緩慢積累。當(dāng)果實(shí)進(jìn)入脆熟期（9 月12 日），3 種酸組分含量積累速度迅速增加，基本達(dá)到發(fā)育最高值，此時(shí)蘋果酸積累超過檸檬酸，含量達(dá)到2.86 mg/g，之后隨著果實(shí)逐漸成熟蘋果酸含量迅速下降，而檸檬酸和奎寧酸含量下降幅度較小。

對冬棗果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的相關(guān)基因進(jìn)行qP?CR 分析發(fā)現(xiàn)，在從膨大期到白熟期（8 月13 日至9月 2 日）ZjACO2、ZjMDH1和ZjMDH12基因表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，而ZjACO1基因表達(dá)量呈逐漸下降趨勢，與3 種酸組分含量變化趨勢均相反。冬棗在脆熟期到完熟期（9 月12 日至10 月2 日）的發(fā)育過程中，ZjCS2、ZjMDH3和ZjMDH12基因表達(dá)量在 9月12 日達(dá)到最高，之后呈現(xiàn)下降趨勢，其變化趨勢與酸組分含量變化趨勢一致，而ZjACO1、ZjACO2和ZjCS3基因表達(dá)量呈先上升后下降趨勢且均在9 月22 日表達(dá)量達(dá)到最高。

2.2.2 灰棗果實(shí)不同時(shí)期酸組分含量變化與相關(guān)基因表達(dá)分析 由圖2 可知，在白熟期（9 月2—12 日）灰棗果實(shí)3 個(gè)酸組分含量逐漸積累，當(dāng)果實(shí)結(jié)束白熟期后，3 種酸組分含量迅速積累至脆熟期，并均在9 月12 日達(dá)到最高，其中蘋果酸含量最高，達(dá)到2.985 mg/g。伴隨著果實(shí)的進(jìn)一步成熟（9 月12 至9月22 日），3 種酸組分含量均逐漸下降，但在完熟期（9 月22 至 10 月 2 日）檸檬酸和奎寧酸含量又小幅回升。

對灰棗果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的酸代謝相關(guān)基因進(jìn)行qPCR 分析，發(fā)現(xiàn)ZjACO1和ZjCS3基因在果實(shí)膨大期（8 月13 日）表達(dá)量最低，而在果實(shí)完熟期（10 月2 日）表達(dá)量最高，而ZjCS2基因在灰棗果實(shí)發(fā)育過程中表達(dá)量呈逐漸下降趨勢，與酸組分含量變化趨勢相反?；覘椩诖嗍炱诘陌l(fā)育過程中，所有基因表達(dá)量變化趨勢同3 個(gè)酸組分含量變化趨勢一致呈現(xiàn)迅速下降，當(dāng)果實(shí)達(dá)到完熟期，ZjMDH3和ZjMDH12基因表達(dá)量依舊保持下降，與蘋果酸含量變化趨勢一致，而其余基因表達(dá)量均處于上升趨勢，這與檸檬酸和奎寧酸含量變化趨勢完全一致。

2.2.3 駿棗果實(shí)不同時(shí)期酸組分含量變化與相關(guān)基因表達(dá)分析 由圖3 可知，駿棗果實(shí)在發(fā)育過程中，3 種酸組分含量均呈先上升后下降再上升的趨勢。駿棗果實(shí)發(fā)育前期均以積累檸檬酸為主，在進(jìn)入脆熟期前（9 月2—12 日），蘋果酸迅速積累，超過檸檬酸占據(jù)主導(dǎo)地位。當(dāng)果實(shí)進(jìn)入完熟期（10 月2 日），3種酸組分含量略有回升。

對駿棗果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的酸代謝相關(guān)基因進(jìn)行qPCR 分析，發(fā)現(xiàn)ZjMDH12基因在駿棗果實(shí)發(fā)育過程中呈現(xiàn)逐漸增加后迅速下降的表達(dá)趨勢，且所有基因均在果實(shí)處于脆熟期（9 月12—22 日）表達(dá)量迅速下降，與3 種酸組分變化趨勢相同。除ZjCS2基因外，其余所有基因表達(dá)量同3 種酸組分含量均在9月 12 日達(dá)到最高，且ZjACO1、ZjACO2和ZjCS3基因表達(dá)量與3 種酸組分含量變化趨勢保持一致。

2.3 棗主栽品種果實(shí)酸組分含量變化與相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

從表3 可知，冬棗、灰棗和駿棗果實(shí)內(nèi)3 種酸組分含量均與ZjACO1和ZjCS3基因表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)，與ZjMDH1和ZjMDH3基因表達(dá)量呈正相關(guān)，與ZjCS2和ZjMDH12基因表達(dá)量表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系；ZjACO2基因表達(dá)量與奎寧酸含量呈顯著正相關(guān)，與蘋果酸和檸檬酸含量表現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系。

表3 冬棗、灰棗和駿棗果實(shí)酸組分含量變化與相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

不同樹種果實(shí)的主要有機(jī)酸種類和含量存在較大差異，在果實(shí)發(fā)育過程中有機(jī)酸含量大多呈先升高后降低的趨勢［13］。試驗(yàn)結(jié)果表明，3 個(gè)棗主栽品種完熟期均以蘋果酸含量最高，根據(jù)鄭麗靜等［14］對不同水果有機(jī)酸的劃分，棗屬于蘋果酸優(yōu)勢型，是引起3 個(gè)棗主栽品種果實(shí)酸味的主要成分。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)主栽品種酸組分含量均在白熟期進(jìn)入脆熟期迅速增加 且達(dá)到最高值。這與張春梅［7］研究發(fā)現(xiàn)棗的酸含量在發(fā)育過程中呈積累趨勢，且在白熟期或半紅期達(dá)到最高的結(jié)果相一致。而Nergiz 等［15］研究發(fā)現(xiàn)橄欖有機(jī)酸含量隨果實(shí)的發(fā)育呈上升趨勢，在成熟期含量達(dá)到最高，與本研究結(jié)果有差異，這可能與品種不同等因素影響有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究認(rèn)證。本試驗(yàn)中，冬棗果實(shí)中酸組分含量均隨果實(shí)發(fā)育而增加隨果實(shí)成熟而減少，而灰棗和駿棗果實(shí)中檸檬酸和奎寧酸含量伴隨著果實(shí)的進(jìn)一步成熟呈現(xiàn)增長趨勢，這與馬倩倩等［13］測得駿棗蘋果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在發(fā)育過程中的變化趨勢呈現(xiàn)緩慢積累到迅速積累之后伴隨果實(shí)的進(jìn)一步成熟，蘋果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)略微下降的變化趨勢基本一致。也與李甲明等［16］測得梨果實(shí)中檸檬酸含量在整個(gè)發(fā)育過程中均呈先上升后下降的趨勢基本一致。

灰棗和駿棗果實(shí)中ZjACO1、ZjACO2和ZjCS3基因表達(dá)量均在膨大期最低，在進(jìn)入脆熟期表達(dá)量最高，之后迅速下降，在完熟期有所增加，整體呈現(xiàn)“S”曲線，其表達(dá)量趨勢與各個(gè)酸組分含量變化趨勢相一致，且3 個(gè)棗主栽品種果實(shí)的3 個(gè)酸組分含量與ZjACO1和ZjCS3基因表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。張上隆等［17］認(rèn)為早期Aco 的低活性對果實(shí)早期有機(jī)酸積累起作用。Shangguan 等［18］在對蘋果、葡萄及甜橙的Aco 研究認(rèn)為高的Aco 表達(dá)有助于檸檬酸和蘋果酸的合成。張春梅［7］研究發(fā)現(xiàn)ZjCS2在棗果實(shí)成熟過程中表達(dá)較低且穩(wěn)定，ZjCS3在棗果實(shí)成熟中一直呈增加趨勢。因此，ZjACO1、ZjACO2和ZjCS3基因?qū)? 個(gè)棗主栽品種的3 個(gè)酸組分含量的積累密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)冬棗、灰棗和駿棗果實(shí)中ZjCS2和ZjMDH12基因表達(dá)量與其3 個(gè)酸組分含量變化趨勢有較大差異，而ZjMDH1和ZjMDH3基因表達(dá)量在脆熟期后與其3 個(gè)酸組分含量變化有相同趨勢，且3個(gè)棗主栽品種果實(shí)中3 個(gè)酸組分含量與ZjCS2和ZjMDH12基因表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與ZjMDH1和ZjMDH3基因表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系，這與張春梅［7］研究判斷ZjMDH1和ZjMDH3可能是影響蘋果酸合成的關(guān)鍵基因相一致，而與其研究發(fā)現(xiàn)ZjMDH12促進(jìn)棗蘋果酸的代謝結(jié)果相反，這可能與研究材料的生長環(huán)境等因素有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。因此ZjCS2和ZjMDH12基因?qū)? 個(gè)棗主栽品種的3 個(gè)酸組分含量的降解起到一定的調(diào)控作用，而ZjMDH1和ZjM?DH3基因?qū)ζ渌峤M分含量的積累也發(fā)揮著一定的作用。

3.2 結(jié)論

3 個(gè)棗主栽品種果實(shí)發(fā)育前期均以檸檬酸積累為主，從白熟期結(jié)束進(jìn)入脆熟期蘋果酸開始迅速積累并占主導(dǎo)地位。其果實(shí)發(fā)育過程中蘋果酸、檸檬酸和奎寧酸含量變化趨勢基本一致，均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，但脆熟期之后冬棗的3 種酸組分含量持續(xù)下降，灰棗、駿棗酸含量在完熟期時(shí)均略有回升。3 個(gè)棗主栽品種果實(shí)成熟時(shí)蘋果酸含量最高，表明蘋果酸是引起其果實(shí)酸味的主要成分。棗果實(shí)發(fā)育過程中ZjACO1、ZjACO2和ZjCS3基因與蘋果酸、檸檬酸和奎寧酸的積累密切相關(guān)，而ZjCS2和ZjMDH12基因?qū)ζ渌峤M分的降解起到一定的調(diào)控作用。