張 奇 孫 琳 劉美娜

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，150081 黑龍江 哈爾濱

過(guò)敏性紫癜(Henoch-Sch?nlein purpura, HSP)是一種以小血管炎和IgA免疫復(fù)合物沉積為主要病理特征的全身性疾病，表現(xiàn)為皮膚紫癜、關(guān)節(jié)炎、腹痛和腎受累等[1]。紫癜性腎炎(Henoch-Sch?nlein purpura nephritis, HSPN)是HSP最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的并發(fā)癥，高達(dá)50%的HSP患兒可在最初發(fā)病的4～6周內(nèi)發(fā)展為HSPN[2]。多數(shù)HSPN患者病情輕微，僅表現(xiàn)為血尿和/或低度蛋白尿，但部分HSPN可導(dǎo)致慢性腎臟疾病和終末期腎功能衰竭，是HSP患者死亡的主要原因[3]。

腎臟損傷的嚴(yán)重程度是決定HSPN遠(yuǎn)期預(yù)后的關(guān)鍵因素，因此，正確評(píng)估HSPN患兒的腎臟受損程度尤為重要。腎活檢是檢測(cè)腎臟損傷程度的金標(biāo)準(zhǔn)，但因有創(chuàng)性和潛在的風(fēng)險(xiǎn)而在實(shí)際應(yīng)用中受限，故探尋安全、無(wú)創(chuàng)的腎臟損傷生物標(biāo)志物對(duì)HSPN的診斷、治療和預(yù)后具有重要意義。本文收集HSP和HSPN患兒的血樣及臨床信息，檢測(cè)RNA-seq數(shù)據(jù)，利用權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 (weighted gene co-expression network analysis, WGCNA) 篩選HSPN進(jìn)展有關(guān)的功能模塊和關(guān)鍵基因，為深入研究HSPN的進(jìn)展機(jī)制和發(fā)掘潛在的生物標(biāo)志物提供線索。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

收集某醫(yī)院兒科住院確診的9例HSPN患者和與之年齡、性別相匹配的9例HSP患者為研究對(duì)象。HSP的診斷符合歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟和歐洲兒科風(fēng)濕病學(xué)會(huì)關(guān)于HSP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。在HSP病程的前6個(gè)月出現(xiàn)腎病理?yè)p害，并伴有血尿和/或蛋白尿者被診斷為HSPN：血尿定義為肉眼血尿，或在高倍鏡視野下血紅細(xì)胞超過(guò)5個(gè)；蛋白尿定義為1周內(nèi)連續(xù)3次尿蛋白呈陽(yáng)性，或尿蛋白呈陰性但尿微量白蛋白排泄過(guò)多[5-6]；腎活檢確定HSPN患者的病理分型，標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)腎臟學(xué)組指南[7]。排除接受慢性疾病常規(guī)治療的兒童和尿道感染的兒童。所有患者在接受治療前采集血液樣本，患者禁食12 h后用EDTA管收集全血樣本5 mL，4 000×g離心10 min后，取上清液置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

數(shù)據(jù)包括：研究對(duì)象的一般資料和臨床癥狀數(shù)據(jù)，如性別、年齡、胃腸道癥狀、關(guān)節(jié)癥狀和腎受累情況；患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，如血清IgA, CRP, C3和C4水平；RNA-seq數(shù)據(jù)。

1.2 RNA-seq分析

RNA-seq分析的主要步驟包括：①在250 μL血樣中加入750 μL TRIzol LS Reagent，提取totalRNA；②利用NanoDrop ND 1 000 (Thermo Fisher Scientific, USA)檢測(cè)totalRNA的純度；③以1～2 μg totalRNA為起始樣本，利用KAPA Stranded RNA-Seq Library Prep Kit (Illumina, San Diego, USA)制備測(cè)序文庫(kù)，經(jīng)Agilent 2 100 Bioanalyzer檢測(cè)合格后，利用qPCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量；④在IlluminaHiSeq 4 000平臺(tái)上進(jìn)行文庫(kù)測(cè)序，獲得RNA-seq數(shù)據(jù)。使用FPKM (fragments per kilobase per million)，即每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的片段數(shù)來(lái)表示RNA的表達(dá)水平。

1.3 WGCNA方法

WGCNA方法根據(jù)基因表達(dá)模式的不同，將表達(dá)模式相似的基因聚類(lèi)并定義為模塊。該方法首先利用Pearson相關(guān)系數(shù)構(gòu)建鄰接矩陣；再基于無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)準(zhǔn)則確定軟閾值β，進(jìn)行鄰接矩陣的加權(quán)和拓?fù)渚仃嚨霓D(zhuǎn)換；利用拓?fù)渲丿B性指標(biāo)(topological overlap measure , TOM)衡量基因間的相異度并構(gòu)建分層聚類(lèi)樹(shù)；最后通過(guò)動(dòng)態(tài)切割算法識(shí)別基因模塊，構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

利用WGCNA方法獲得網(wǎng)絡(luò)模塊的第一主成分，即模塊特征基因(module eigengene,ME)，代表該模塊的基因表達(dá)譜；模塊內(nèi)基因與ME的相關(guān)性大小反映的是基因與模塊的關(guān)聯(lián)程度，即模塊隸屬度(module membership, MM)。通過(guò)計(jì)算ME與表型或性狀的相關(guān)系數(shù)，可以衡量模塊與相應(yīng)表型或性狀之間的關(guān)聯(lián)；基因顯著性(gene significance, GS)是度量模塊內(nèi)基因與表型或性狀關(guān)聯(lián)程度的指標(biāo)，GS的絕對(duì)值越大，基因的生物學(xué)意義越顯著[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SAS 9.4軟件和R 4.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；定量資料若服從正態(tài)分布，采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析；若不服從正態(tài)分布，則采用中位數(shù)(四分位數(shù))表示，組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)；兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；定性資料和等級(jí)資料采用頻數(shù)(百分?jǐn)?shù))表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)；利用Spearman秩相關(guān)分析HSPN進(jìn)展與臨床資料的相關(guān)性；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 利用R包“l(fā)imma”進(jìn)行差異表達(dá)分析，差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|>1和P<0.05；R包“WGCNA”構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，參數(shù)設(shè)置為：軟閾值β=30，每個(gè)模塊的最少基因數(shù)=20，模塊合并閾值=0.2；R包“clusterProfiler”進(jìn)行GO富集分析，顯著性閾值設(shè)置為FDR<0.05。

2 結(jié)果

2.1 患者的臨床資料

本文納入18例研究對(duì)象，9例HSP患者和9例HSPN患者(type I，type II和type III各3例)，年齡范圍5～16歲，男女比例11∶7。HSP、HSPN typeI、HSPN type II和HSPN type III各組一般資料、臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較結(jié)果見(jiàn)表1。各組之間年齡、性別、關(guān)節(jié)癥狀和胃腸道癥狀之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；腎受累情況和血清IgA、CRP和C3的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表現(xiàn)為HSPN type II和HSPN type III患者的血尿/蛋白尿水平和血清CRP水平高于HSP和HSPN type I患者、血清IgA水平高于HSPN type I患者，HSPN type III患者的血清C3水平高于HSP患者。

表1 HSP患者和不同病理分級(jí)的HSPN患者臨床資料比較

利用Spearman秩相關(guān)分析HSPN進(jìn)展與臨床資料的相關(guān)性，血尿/蛋白尿水平、血清IgA、CRP和C3水平與HSPN進(jìn)展呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 差異基因的篩選

根據(jù)界值|log2FC|>1和P<0.05篩選HSP和HSPN組的差異基因，獲得2 399個(gè)差異表達(dá)mRNA(differentially expressed genes, DEGs)，其中115個(gè)上調(diào)，2 284個(gè)下調(diào)。利用火山圖和熱圖對(duì)DEGs的分布和表達(dá)模式進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖1。

表2 HSPN進(jìn)展與臨床資料的相關(guān)性分析

A:火山圖；B：熱圖

2.3 網(wǎng)絡(luò)模塊的構(gòu)建

WGCNA的參數(shù)設(shè)置β=30，每個(gè)模塊的最少基因數(shù)為20，模塊合并閾值為0.2。通過(guò)對(duì)分層聚類(lèi)樹(shù)的動(dòng)態(tài)剪接，獲得10個(gè)模塊，如圖2所示。模塊ME與臨床資料的相關(guān)性熱圖顯示：與血尿/蛋白尿最相關(guān)的模塊為藍(lán)綠色模塊(r=-0.61,P=0.007)；與IgA和CRP最相關(guān)的模塊為紫色模塊(IgA:r=0.79,P<0.001;CRP:r=0.79,P<0.001)；與C3最相關(guān)的模塊為黃色模塊(r=-0.64,P=0.004)。這3個(gè)模塊也同時(shí)與HSPN進(jìn)展相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.53(P=0.02),0.58(P=0.01)和0.47(P=0.05)。見(jiàn)圖3。

圖2 WGCNA模塊聚類(lèi)圖

圖3 模塊MEs與臨床資料的相關(guān)性熱圖

分別對(duì)這幾個(gè)模塊中的基因進(jìn)行GO富集分析，在FDR<0.05的界值下，藍(lán)綠色模塊、紫色模塊和黃色模塊的基因分別富集在91條、113條和48條通路中。其中藍(lán)綠色模塊前5條顯著富集的通路主要與中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有關(guān)；紫色模塊前5條顯著富集的通路主要與細(xì)胞因子活性和白細(xì)胞遷移有關(guān)；黃色模塊前5條顯著富集的通路主要與血小板α顆粒和細(xì)胞粘附有關(guān)。見(jiàn)表3。

表3 模塊基因前5條顯著富集的通路

分別提取這幾個(gè)模塊中MM>0.85且|GS|>0.65的基因作為模塊的關(guān)鍵基因，共篩選出45個(gè)基因，其中紫色模塊22個(gè)，藍(lán)綠色模塊13個(gè)，黃色模塊10個(gè)。見(jiàn)表4。

表4 模塊中的關(guān)鍵基因

2.4 HSPN進(jìn)展的關(guān)鍵基因

利用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)比較上述3個(gè)模塊中的關(guān)鍵基因在HSP、HSPN type I、HSPN type II和HSPN type III這4個(gè)進(jìn)展組中的表達(dá)情況，基因的表達(dá)量用中位數(shù)和四分位數(shù)[M(P25～P75)]表示，其中18個(gè)基因的表達(dá)在不同組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CALM2-201和MAP1LC3B-201在HSPN type II和type III中低表達(dá)；CDKN2D-202在HSPN type I、type II和type III中均低表達(dá)，且在type II中的表達(dá)低于type I；LDLRAP1-201在HSPN type II中低表達(dá)；GPX1-201在HSPN type III中高表達(dá)；INHBA-201在HSPN type II和type III中相較于HSP和HSPN type I均呈高表達(dá)狀態(tài)；PHLDA1-201和VEGFA-205在HSPN type I、type II和type III中均高表達(dá)。見(jiàn)表5。因此，可將4個(gè)下調(diào)基因(CALM2-201, CDKN2D-202, LDLRAP1-201和MAP1LC3B-201)和4個(gè)上調(diào)基因(GPX1-201,INHBA-201, PHLDA1-201和VEGFA-205)，共8個(gè)基因作為HSPN進(jìn)展的關(guān)鍵基因。其中，INHBA和VEGFA參與細(xì)胞因子活性(GO:0005125～cytokine activity)和細(xì)胞因子受體結(jié)合通路(GO:0005126～cytokine receptor binding)；除此之外，VEGFA還參與白細(xì)胞遷移通路(GO:0050900～leukocyte migration)；CDKN2D參與細(xì)胞周期停滯(GO:0007050～cell cycle arrest)和凋亡信號(hào)通路的調(diào)控(GO:2001233～regulation of apoptotic signaling pathway)；MAP1LC3B參與自噬(GO:0006914～autophagy)和利用自噬機(jī)制的過(guò)程(GO:0061919～process utilizing autophagic mechanism)。

表5 關(guān)鍵基因在HSP和不同病理分級(jí)的HSPN患者中表達(dá)情況(FPKM)的比較[M(P25～P75)]

3 討論

HSPN是HSP出現(xiàn)腎臟損害時(shí)的表現(xiàn)，為HSP最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的并發(fā)癥，預(yù)后主要取決于腎受累的嚴(yán)重程度[9]。因此，探索HSPN進(jìn)展有關(guān)的功能模塊和關(guān)鍵基因?qū)SPN的診斷、治療和預(yù)后具有重要意義。本文分析了與HSPN進(jìn)展有關(guān)的臨床指標(biāo)，并構(gòu)建了HSPN的差異基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，獲得3個(gè)與HSPN進(jìn)展相關(guān)的功能模塊和8個(gè)HSPN進(jìn)展的關(guān)鍵基因。

通過(guò)對(duì)HSP和HSPN患者的臨床指標(biāo)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)患者血尿/蛋白尿的水平、血清IgA、CRP和C3水平與HSPN的進(jìn)展呈正相關(guān)關(guān)系。有研究表明，血清CRP和IgA1的水平高低可有效反映患兒腎臟損傷程度，在HSPN的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10-11]，與本文的結(jié)論一致。因此，臨床上評(píng)估HSPN的疾病進(jìn)展和腎臟損傷情況時(shí)，可將血清IgA、CRP和C3水平作為參考。

利用WGCNA獲得的3個(gè)與HSPN進(jìn)展有關(guān)的功能模塊主要與中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子活性、白細(xì)胞遷移、血小板α顆粒和細(xì)胞粘附等通路有關(guān)。有學(xué)者在關(guān)于HSPN發(fā)病機(jī)制的探討中提到：HSPN患兒的細(xì)胞免疫和體液免疫功能均異常，如B淋巴細(xì)胞多克隆活化和T淋巴細(xì)胞亞群功能紊亂等；免疫復(fù)合物的沉積和補(bǔ)體活化可激起腎小球和間質(zhì)的一系列炎癥反應(yīng)，包括單核-巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和釋放各種細(xì)胞因子等；此外，上述過(guò)程也可激活內(nèi)源性和外源性凝血系統(tǒng)，引發(fā)凝血反應(yīng)[12-13]。本文從分子通路的角度進(jìn)一步證實(shí)了這些結(jié)論。

通過(guò)比較模塊中的關(guān)鍵基因在HSP、HSPN type I、HSPN type II和HSPN type III 4個(gè)進(jìn)展組中的表達(dá)情況，獲得了8個(gè)HSPN進(jìn)展的關(guān)鍵基因。其中，GPX1基因多態(tài)性可增加終末期腎臟疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，且能預(yù)測(cè)其生存[14]；VEGFA在多種腎臟疾病中異常表達(dá)，其可變剪接的修飾可作為一種治療慢性腎病的新方法[15]；CDKN2D基因編碼的蛋白是細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑INK4家族成員，該蛋白與CDK4或CDK6形成穩(wěn)定的復(fù)合物，阻止CDK激酶的激活，作為控制細(xì)胞周期G1期進(jìn)展的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，參與細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控[16]。另外，根據(jù)差異表達(dá)分析、相關(guān)性分析和功能富集分析結(jié)果可以推斷：CDKN2D和MAP1LC3B基因的下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控功能紊亂，并抑制細(xì)胞凋亡和機(jī)體的自噬過(guò)程，從而引發(fā)一系列炎癥和免疫反應(yīng)，導(dǎo)致患者腎臟受損加重，血尿和/或蛋白尿水平升高；INHBA和VEGFA基因的上調(diào)可能通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞因子活性和促進(jìn)白細(xì)胞遷移等方式加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致血清IgA和CRP水平升高，促進(jìn)HSPN的腎臟損傷和疾病進(jìn)展。

綜上，本文利用WGCNA獲得3個(gè)與HSPN進(jìn)展相關(guān)的功能模塊和8個(gè)HSPN進(jìn)展的關(guān)鍵基因，主要通過(guò)調(diào)控炎癥、免疫反應(yīng)、凝血反應(yīng)和細(xì)胞周期等生物學(xué)過(guò)程影響疾病相關(guān)的臨床指標(biāo)，在HSPN進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果為HSPN進(jìn)展機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為HSPN潛在治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物的研究提供了方向。本文僅對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)行了初步探索，關(guān)鍵基因?qū)膊∠嚓P(guān)臨床指標(biāo)的影響，及其在HSPN進(jìn)展過(guò)程中的作用機(jī)制需要通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)明確。