余家莉，張帥，周石,2**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 介入科，貴州 貴陽(yáng) 550004)

在所有類(lèi)型的癌癥中，肝癌的發(fā)病率和死亡率均位居全球前五位，已成為全球第五大最常見(jiàn)的惡性腫瘤[1-2]。肝癌發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，早期缺乏典型的臨床癥狀，往往在確診時(shí)已進(jìn)入中晚期，治療難度大，預(yù)后差[3]，可見(jiàn)早期診斷和治療對(duì)提高肝癌患者的預(yù)后和生存率至關(guān)重要。肝纖維化是指不同病因引起的肝組織重復(fù)損傷導(dǎo)致肝臟再生能力受損的過(guò)程[4-5]，持續(xù)肝纖維化將可肝癌，有效的控制和逆轉(zhuǎn)肝纖維化可降低肝癌發(fā)病率和致死率[6]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smad信號(hào)通路對(duì)纖維化的形成及進(jìn)展具有重要作用[7-9]。LY2109761是一種新型的TGF-β選擇性抑制劑，可以抑制TGF-β受體Ⅰ(TGF-β receptor type Ⅰ，TβR Ⅰ)和TGF-β受體Ⅱ(TGF-β receptor type Ⅱ，TβR Ⅱ)的結(jié)合[10]。有研究報(bào)道，LY2109761對(duì)放射性肺纖維化具有治療作用[11]，但未見(jiàn)其對(duì)肝纖維化防治作用的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究利用大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6細(xì)胞，觀察LY2109761對(duì)HSC-T6細(xì)胞生存和凋亡的影響，探究其抗肝纖維化作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6(吉尼歐，中國(guó))。

1.1.2藥品與試劑 LY2109761(美國(guó)MedChemExpress公司)，秋水仙堿(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，0.25%胰蛋白酶、胎牛血清及DMEM高糖培養(yǎng)基為美國(guó)gibco公司產(chǎn)品，Cell Counting Kit-8(CCK-8)、ECL plus超敏發(fā)光液、高效RIPA組織細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、一抗稀釋液及Western快速封閉液由中國(guó)上海碧云天生物科技有限公司提供，α-SMA抗體及Collagen Ⅰ抗體為中國(guó)上海愛(ài)必信生物科技有限公司產(chǎn)品，TGF-β1抗體、Smad2抗體及p-Smad2抗體為美國(guó)Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品，β-actin抗體(美國(guó)abcam公司)，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Sigma公司)。

1.1.3儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo scientific公司)，Thermo fresco 17低溫高速離心機(jī)及arioskan LUX多功能酶標(biāo)儀為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品，高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療儀器廠)，HDL雙人超凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，液氮生物容器(成都金鳳液氮容器有限公司)，超純水機(jī)(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)，TS-100F熒光倒置顯微鏡及CCD照相系統(tǒng)(日本Nikon公司)，電泳儀(美國(guó)BIO-Rad公司)、FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 方法

1.2.1HSC-T6細(xì)胞的培養(yǎng) HSC-T6細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待貼壁生長(zhǎng)達(dá)80%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化并傳代。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6細(xì)胞，以3×104個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后設(shè)立空白組、LY2109761給藥組和陽(yáng)性組，空白組始終在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，陽(yáng)性組加入含25 μmol/L秋水仙堿的完全培養(yǎng)基，LY2109761給藥組加入含10、20、30、40、50、60、70 μmol/L LY2109761的完全培養(yǎng)基；分別在給藥12、24、36 h加入10 μL CCK-8，避光孵育3 h后、在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值。根據(jù)吸光度計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=(A給藥組/A空白組)×100%。

1.2.3細(xì)胞劃痕法檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞遷移能力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6細(xì)胞以3×104個(gè)/mL接種于6孔板，每孔2 mL，用標(biāo)記筆在6孔板外間隔0.5 cm畫(huà)多條橫行直線，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)密度達(dá)80%時(shí)，在板內(nèi)劃多條垂直于標(biāo)記筆橫線的豎行劃痕甬道，棄去上清，用PBS潤(rùn)洗1次。細(xì)胞分為空白組、LY2109761給藥組和陽(yáng)性組，空白組始終在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，LY2109761給藥組加入含LY2109761濃度為53 μmol/L完全培養(yǎng)基，陽(yáng)性組加入含秋水仙堿25 μmol/L的完全培養(yǎng)基。拍照觀察0 h及24 h時(shí)多個(gè)標(biāo)記點(diǎn)處的劃痕甬道變化情況。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞凋亡率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6細(xì)胞以3×104個(gè)/mL接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，10 mL/皿。設(shè)立空白組、LY2109761給藥組和陽(yáng)性組，空白組始終在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，LY2109761給藥組加入濃度為53 μmol/L LY2109761的完全培養(yǎng)基，陽(yáng)性組加入含25 μmol/L秋水仙堿的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后吸棄上清液，用5 mL預(yù)冷的PBS緩沖液洗2次，加入不含EDTA的胰酶1 mL消化120 s，再加入5 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)記細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5蛋白提取 按1.2.3項(xiàng)下方法鋪板給藥處理細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗3次，在冰上使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，待細(xì)胞為黏稠狀時(shí)將其轉(zhuǎn)移至離心管中，冰上裂解30 min，每10 min渦混1次，使細(xì)胞與裂解液充分接觸，在4 ℃情況下12 000 r/min離心10 min，取上清液即為總蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入蛋白將5 × 上樣緩沖液稀釋為1 ×，沸水浴變性10 min，冷卻至室溫備用。

1.2.6Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)α-SMA、Collagen Ⅰ、TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá) 取等量總蛋白上樣，使用SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5% BSA溶液4 ℃封閉3 h，加入相應(yīng)一抗，4 ℃過(guò)夜；TBST洗滌5次、5 min/次，加入二抗，室溫孵育2 h。TBST洗滌5次、5 min/次，取適量ECL plus發(fā)光液，均勻滴加在PVDF膜上，避光靜止孵育1 min，放入凝膠成像儀顯影曝光，拍照保存。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Quantity one凝膠圖像分析系統(tǒng)分析，測(cè)定目的蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值，β-actin為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LY2109761對(duì)HSC-T6細(xì)胞存活率的影響

與空白組比較，不同濃度的LY2109761作用HSC-T6細(xì)胞12、24和36 h后，細(xì)胞存活率均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1。根據(jù)各組平均A值計(jì)算出給藥24 h時(shí)的半抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)為53.72 μmol/L，故后續(xù)選擇53 μmol/L LY2109761為給藥濃度。

表1 不同濃度LY2109761及不同作用時(shí)間對(duì)HSC-T6細(xì)胞存活率的影響

2.2 LY2109761對(duì)HSC-T6細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞劃痕檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，與空白組比較，LY2109761和秋水仙堿作用24 h后，HSC-T6細(xì)胞的遷移均被明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

注：A為細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果，B為細(xì)胞劃痕寬度數(shù)值結(jié)果；(1)與空白組24 h時(shí)比較，P<0.01。

2.3 LY2109761對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染技術(shù)常用于細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，結(jié)果分為Q1-Q4共4個(gè)區(qū)域，其中Q1區(qū)代表機(jī)械損傷細(xì)胞和少量晚凋細(xì)胞，Q2區(qū)代表晚凋細(xì)胞，Q3區(qū)代表活細(xì)胞，Q4區(qū)代表早凋細(xì)胞。結(jié)果如圖2所示，空白組有少量損傷和凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率為(3.0±0.1)%。與空白組比較，LY2109761給藥組和陽(yáng)性組的凋亡細(xì)胞明顯增加，細(xì)胞凋亡率分別為(41.4±3.1)%和(37.1±2.8)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

注：A為流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)結(jié)果，B為細(xì)胞凋亡率數(shù)值結(jié)果；(1)與空白組比較，P <0.001。

2.4 LY2109761對(duì)HSC-T6細(xì)胞α-SMA、Collagen Ⅰ、TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，與空白組比較，LY2109761給藥組和陽(yáng)性組細(xì)胞的α-SMA、Collagen Ⅰ、TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示LY2109761抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖活化作用與TGF-β1/Smad通路有關(guān)。

注：A為蛋白印跡試驗(yàn)結(jié)果，B為蛋白相對(duì)表達(dá)的定量結(jié)果；(1)與空白組同指標(biāo)比較，P<0.01。

3 討論

肝纖維化是多種慢性肝病早期可逆的動(dòng)態(tài)病理過(guò)程，若不及時(shí)治療，將會(huì)演變?yōu)楦斡不?，進(jìn)而導(dǎo)致肝癌[12]。在我國(guó)，約有4/5的原發(fā)性肝癌由肝硬化發(fā)展而來(lái)，如何阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)展已成為近幾年肝病的研究熱點(diǎn)[13-14]。細(xì)胞外基質(zhì)增多是導(dǎo)致肝纖維化的主要原因[15]，而肝星狀細(xì)胞(hepatic stellated cell，HSC)是合成細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵細(xì)胞，干擾HSC的活化可阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)程[16-18]。本研究利用LY2109761作用HSC-T6細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LY2109761能明顯抑制HSC-T6細(xì)胞的存活和遷移能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用程度與秋水仙堿相當(dāng)。TGF-β/Smad通路與肝纖維化的調(diào)控緊密相關(guān)，TGF-β1是目前認(rèn)為最重要的致肝纖維化因子[19-20]，Samd信號(hào)蛋白是TGF-β的下游轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，能將TGF-β家族信號(hào)從相關(guān)細(xì)胞膜受體傳遞到相應(yīng)細(xì)胞核[21]。在正常肝組織中TGF-β1含量較低，但當(dāng)肝損傷時(shí)，HSC中的TGF-β1表達(dá)升高，激活下游蛋白Smad2，使HSC活化標(biāo)志蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)增加，并分泌出Collagen Ⅰ，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化[22-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，LY2109761和秋水仙堿均能降低α-SMA、Collagen Ⅰ、TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)水平，且作用程度相當(dāng)。

綜上所述，LY2109761可能是通過(guò)降低TGF-β1和p-Smad2的蛋白表達(dá)水平，抑制TGF-β1/Smad通路的激活，從而抑制α-SMA和Collagen Ⅰ的蛋白表達(dá)，并抑制HSC-T6細(xì)胞的生存、遷移、凋亡和活化，進(jìn)而產(chǎn)生抗肝纖維化作用，且作用程度與秋水仙堿相當(dāng)。