程薇，陳學書，謝淵，周建獎，袁航，賈岑岑，王琴容，趙艷**

(1.貴州醫(yī)科大學 地方病與少數(shù)民族性疾病教育部重點實驗室 & 貴州省醫(yī)學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州省腫瘤醫(yī)院 檢驗科，貴州 貴陽 550001；3.襄陽市第一人民醫(yī)院 病理科，湖北 襄陽 441000)

胃癌(gastric cancer,GC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，其胃癌的發(fā)病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第5位和第2位[1]。近年來提出的“腫瘤干細胞學說”為胃癌的發(fā)病機制研究及治療開辟了新的途徑[2]。腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)是具有不受限制的自我更新和分化能力的腫瘤細胞，與腫瘤的耐藥、侵襲、轉移和復發(fā)有關[3]。利用CSCs與正常干細胞具有相似的表面標志，通過流式細胞和磁珠分選技術能從胃癌組織中分離CSCs[4]。目前在人類白血病、乳腺癌、神經系統(tǒng)腫瘤、結腸癌和肝癌等腫瘤中成功分離出CSCs[5-8]。分離胃癌中CSCs最常用的標志物有分化抗原簇蛋白24(cluster of differentiation protein 24，CD24)、分化抗原簇蛋白44(cluster of differentiation protein 44，CD44)和分化抗原簇蛋白133(cluster of differentiation protein 33，CD133)[9]，但CD133的研究相對較少。CD133是一個由5個跨膜結構域和2個胞外區(qū)組成的120 kDa單鏈糖蛋白，是許多實體癌如腦腫瘤、結腸癌、肺癌及肝癌等最重要的CSCs標記之一[10-13]。有研究表明胃癌干細胞高表達CD133，且與胃癌組織浸潤深度及淋巴結轉移相關[14]。近期研究也發(fā)現(xiàn)CD133參與了多種癌細胞中信號傳導途徑的激活，如轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)介導細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信號通路的激活[15]。本研究從臨床胃癌組織中分離純化原代胃癌細胞，利用磁珠分選技術分選人CD133+胃癌細胞，探討其生長、遷移、侵襲及體內成瘤能力，為進一步探討胃癌干細胞在胃癌中的作用及分子機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞和動物來源 人原代胃癌細胞由課題組前期分離鑒定，保存于液氮罐中；4只雄性無胸腺裸鼠(nude mice，BALB/C)裸鼠購自貴州醫(yī)科大學動物中心[SYXK(黔)2018-001]，體質量14～15 g，4～6周，飼養(yǎng)于學校動物房無特定病原體(specefic pathogen free，SPF)級無菌室。實驗獲學校實驗動物倫理委員會批準(No2000784)。

1.1.2主要試劑及儀器 胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、雙抗、胰蛋白酶和磷酸鹽緩沖液購自美國Gibco公司，CD133免疫磁珠分選試劑盒購自德國Miltenyi公司，小鼠單克隆CD133抗體和羊抗鼠熒光二抗購自美國Proteintech公司，Transwell小室和Matrigel基質膠購自美國Corning公司，多聚甲醛購自國藥集團化學試劑有限公司，結晶紫購自上海生工生物工程有限公司。倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，正置熒光顯微鏡購自日本Nikon。

1.2 方法

1.2.1免疫磁珠分選人CD133+原代胃癌細胞 復蘇細胞，常規(guī)培養(yǎng)。細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部后消化細胞，用緩沖液將細胞制備成1×107個/mL的單細胞懸液，加鼠抗人CD133單克隆抗體10 μL，4 ℃孵育15 min；加緩沖液2 mL洗滌細胞，1 000 r/min離心8 min，棄上清；加緩沖液400 μL重懸細胞，加Anti-Biotin MicroBeads 25 μL充分混合，4 ℃孵育20 min；加緩沖液10 mL洗滌細胞，1 000 r/min離心5 min，吸上清液于緩沖液1 000 μL中重懸細胞；將細胞懸液移入分離柱中并使分離柱置于磁力架上，室溫孵育10 min；緩慢流出分離柱的細胞懸液為CD133-組；從磁力架上取下分離柱，將緩沖液加入分離柱中，將柱塞推入柱中，沖洗下的磁性標記的細胞為CD133+組。為了增加CD133+胃癌細胞的純度，再次使用新分離柱重復磁選步驟。

1.2.2免疫熒光檢測CD133的表達 將分選后的CD133-和CD133+原代胃癌細胞分別接種于有細胞爬片的12孔板中，常規(guī)培養(yǎng)后取出爬片并用PBS洗滌，4 %多聚甲醛固定30 min后PBS洗3次、用0.3%Triton X-100通透30 min，PBS洗滌；BSA室溫封閉30 min，鼠抗CD133單克隆抗體4 ℃孵育過夜，次日PBS洗3次，滴加羊抗鼠熒光二抗，避光孵育2 h，PBS洗3次，DAPI染核15 min，PBS洗3次，滴加抗熒光衰弱封片劑10 μL，熒光顯微鏡下觀察CD133的表達情況。

1.2.3細胞克隆形成實驗 制備細胞懸液，在6孔細胞培養(yǎng)板中以1 000個/孔的密度接種細胞，蓋上蓋子，輕輕混勻后放入37 ℃的5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d觀察1次，待細胞形成肉眼可見的克隆時，取出6孔細胞培養(yǎng)板，PBS緩沖液沖洗，多聚甲醛固定后用結晶紫染色。隨機選3個視野，用IMAGE J計數(shù)每個視野的細胞克隆數(shù)。

1.2.4細胞劃痕實驗 制備細胞懸液，在6孔板中以1×105/mL密度接種細胞后放入細胞培養(yǎng)箱，待細胞長滿后用移液器槍頭緊貼直尺，垂直于6孔板水平線劃痕，PBS清洗未貼壁的細胞后加入無血清培養(yǎng)基，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；分別在0、24、48及72 h用倒置顯微鏡觀察、并拍照，計算傷口愈合百分比[傷口愈合百分比(%)=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度]。

1.2.5Transwell侵襲實驗 將50 mg/L的基質膠(Matrigel)與RPMI 1640培養(yǎng)基以1 ∶8稀釋，取稀釋液100 μL滴加于Transwell小室底部膜的上室，細胞培養(yǎng)箱中凝固1 h，制備細胞懸液；以5×104/mL細胞密度接種于Transwell小室的上室，Transwell小室的下室加完全培養(yǎng)基100 μL，放細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，固定，結晶紫染色后拍照。隨機選3個視野，用IMAGE J計數(shù)每個視野的穿膜細胞數(shù)。

1.2.6裸鼠皮下成瘤實驗、瘤組織學觀察及CD133、Ki67表達 取4只裸鼠均分為 CD133+組和CD133-組，分別接種相應的原代胃癌細胞，接種細胞量均為1×106個/只、接種于裸鼠腋窩中后部；觀察裸鼠移植后的反應、成瘤時間，并用卡尺測量瘤體的長度(L)和寬度(W)，計算瘤體體積[瘤體體積(V)=(L×W)2×0.5]、并繪制瘤體生長曲線；接種第32天麻醉處死裸鼠，取瘤組織塊多聚甲醛固定、切片、HE染色觀察兩組瘤體組織切片，采用免疫組織化學檢測CD133、Ki67的表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 原代胃癌細胞中CD133表達

磁珠分選后，用免疫熒光檢測CD133+組和CD133-組的CD133表達，結果顯示，CD133主要在CD133+原代胃癌細胞的細胞膜及胞質中表達，提示成功分選到了CD133+原代胃癌細胞。CD133-組原代胃癌細胞平均光密度低于CD133+組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

2.2 原代胃癌細胞的體外增殖能力

成功獲得CD133+原代胃癌細胞后，用克隆形成實驗檢測細胞的體外增殖能力。結果如圖2所示，CD133+原代胃癌細胞形成的克隆數(shù)高于CD133-原代胃癌細胞形成克隆數(shù)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

注：A為克隆形成后的結晶紫染色結果，B為細胞克隆數(shù)量的定量結果；(1)與CD133-組比較，P<0.001。

2.3 原代胃癌細胞的體外遷移能力

細胞劃痕實驗結果如圖3所示，CD133+原代胃癌細胞傷口愈合率(76.5±1.4)%，顯著高于CD133-原代胃癌細胞(39.8±2.0)%，P<0.001，提示CD133+原代胃癌細胞有更強的遷移能力。

注：A、B分別為CD133-組和CD133+組0 h時細胞劃痕結果(劃痕實驗，×100)，C、D分別為CD133-組和CD133+組48 h時細胞劃痕結果(劃痕實驗，×100)，E為細胞遷移寬度的定量表達；(1)與CD133-組比較，P<0.001。

2.4 原代胃癌細胞的體外侵襲能力

Transwell侵襲實驗結果如圖4顯示，CD133+組侵入Transwell下室面的細胞數(shù)(624±37)/視野顯著高于CD133-組(281±31)/視野，(P<0.001)。

2.5 原代胃癌細胞的體內成瘤能力

將CD133+和CD133-的原代胃癌細胞種植到裸鼠皮下，結果顯示CD133+接種組2只裸鼠分別于第12天和第20天開始成瘤，CD133-接種組1只裸鼠于第26天開始成瘤、1只不成瘤(圖5)；HE染色結果觀察到2組裸鼠腫瘤組織的形態(tài)結構(圖6)；免疫組織化學染色顯示，CD133+接種組裸鼠原代胃癌細胞中CD133+和Ki67的表達明顯高于CD133-接種組，提示裸鼠體內CD133+胃癌細胞成瘤能力高于CD133-胃癌細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖7)。

注：A為處死的裸鼠和取出瘤體，B為腫瘤體積生長曲線。

CD133+接種組 CD133-接種組

注：A、B分別為CD133+和CD133-接種組裸鼠CD133的表達，C、D分別為CD133+和CD133-接種組裸鼠Ki67的表達，E、F分別為CD133、Ki67表達的定量結果；(1)與CD133-接種組比較，P<0.01。

3 討論

腫瘤干細胞被認為是各種實體瘤的生長、侵襲、轉移及復發(fā)的重要原因[3]。細胞表面標志物的表達已被用于從不同腫瘤中分離腫瘤干細胞，例如CD44、CD24、CD29及CD133等[16]。發(fā)現(xiàn)CD133+/CD166+人類胃癌細胞系BGC-823和SGC-7901具有癌癥干細胞特性[17]；也有研究表明，胃癌中CD133的過表達與其臨床病理特征密切相關，且CD133陽性患者比CD133陰性患者耐藥性和復發(fā)率更高，且5年生存率更低[18-19]。此外，研究表明,CD133 miRNA結合位點可能是胃癌遺傳易感性的潛在生物標志物和胃癌患者生存的預測指標[20]；朱優(yōu)龍等[21]研究顯示CD133可能通過調節(jié)強效P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gP)和B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的表達促進胃癌的化療耐藥；在胃癌化療耐藥產生中，CD133+細胞可通過磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，Akt)通路起作用[22]；但也有學者認為CD133和CD44細胞表面標記不能識別原發(fā)性人胃腫瘤中的腫瘤干細胞[23]。盡管關于CD133與胃癌的基礎和臨床研究多種多樣，但有關CD133的現(xiàn)有文獻尚未闡明其在腫瘤干細胞中的生物學功能。

本研究通過免疫磁珠成功從手術切除的胃癌組織中分離到人CD133+胃癌細胞，并在體外傳代培養(yǎng)，經免疫熒光證實人CD133+胃癌細胞中高表達CD133，且主要在細胞膜及胞質中表達；隨后用克隆形成實驗、劃痕實驗及Transwell侵襲實驗檢測發(fā)現(xiàn)CD133+胃癌細胞比CD133-細胞具有更強的體外增殖、遷移和侵襲能力，提示CD133+胃癌細胞可能具有干細胞的特性，這與其他研究者在其它腫瘤的研究結果一致[24-27]。為了探究CD133+胃癌細胞在體內形成腫瘤的能力，繼續(xù)將CD133+和CD133-胃癌細胞種植于裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)CD133+胃癌細胞比CD133-胃癌細胞的成瘤時間早、增長速度快，且CD133-胃癌細胞有不成瘤的現(xiàn)象，然而目前無文獻報道CD133-胃癌細胞有不成瘤的現(xiàn)象，可能是與分離出的原代胃癌細胞與其他細胞株的差異導致；免疫組織化學進一步證實CD133+的移植瘤組織中CD133和Ki67高表達。因此，本研究證明了從人原代胃癌細胞中分離出來的CD133+胃癌細胞具有腫瘤干細胞的特征，可能與胃癌細胞的侵襲和轉移相關。也有研究者用RNA干擾技術下調胃癌細胞株KATO Ⅲ中CD133的表達，發(fā)現(xiàn)降低了胃癌細胞的增殖、侵襲、克隆球形成、耐藥以及裸鼠體內成瘤的能力[28]。由于腫瘤干細胞的定義仍有爭議，其產生和發(fā)展的機制尚不清楚，因此進一步研究腫瘤干細胞的微環(huán)境和信號通路以及與胃癌發(fā)生、復發(fā)、轉移和耐藥性的關系極為重要。

綜上所述，本研究成功分離獲得人CD133+和CD133-原代胃癌細胞，與人CD133-原代細胞相比，CD133+人原代胃癌細胞具有更強的體外增殖、遷移和侵襲能力及體內成瘤能力，為進一步研究奠定了良好的基礎。