程薇，陳學(xué)書，謝淵，周建獎，袁航，賈岑岑，王琴容，趙艷**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族性疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；2.貴州省腫瘤醫(yī)院 檢驗(yàn)科，貴州 貴陽 550001；3.襄陽市第一人民醫(yī)院 病理科，湖北 襄陽 441000)

胃癌(gastric cancer,GC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，其胃癌的發(fā)病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第5位和第2位[1]。近年來提出的“腫瘤干細(xì)胞學(xué)說”為胃癌的發(fā)病機(jī)制研究及治療開辟了新的途徑[2]。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)是具有不受限制的自我更新和分化能力的腫瘤細(xì)胞，與腫瘤的耐藥、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有關(guān)[3]。利用CSCs與正常干細(xì)胞具有相似的表面標(biāo)志，通過流式細(xì)胞和磁珠分選技術(shù)能從胃癌組織中分離CSCs[4]。目前在人類白血病、乳腺癌、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、結(jié)腸癌和肝癌等腫瘤中成功分離出CSCs[5-8]。分離胃癌中CSCs最常用的標(biāo)志物有分化抗原簇蛋白24(cluster of differentiation protein 24，CD24)、分化抗原簇蛋白44(cluster of differentiation protein 44，CD44)和分化抗原簇蛋白133(cluster of differentiation protein 33，CD133)[9]，但CD133的研究相對較少。CD133是一個由5個跨膜結(jié)構(gòu)域和2個胞外區(qū)組成的120 kDa單鏈糖蛋白，是許多實(shí)體癌如腦腫瘤、結(jié)腸癌、肺癌及肝癌等最重要的CSCs標(biāo)記之一[10-13]。有研究表明胃癌干細(xì)胞高表達(dá)CD133，且與胃癌組織浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[14]。近期研究也發(fā)現(xiàn)CD133參與了多種癌細(xì)胞中信號傳導(dǎo)途徑的激活，如轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)介導(dǎo)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信號通路的激活[15]。本研究從臨床胃癌組織中分離純化原代胃癌細(xì)胞，利用磁珠分選技術(shù)分選人CD133+胃癌細(xì)胞，探討其生長、遷移、侵襲及體內(nèi)成瘤能力，為進(jìn)一步探討胃癌干細(xì)胞在胃癌中的作用及分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞和動物來源 人原代胃癌細(xì)胞由課題組前期分離鑒定，保存于液氮罐中；4只雄性無胸腺裸鼠(nude mice，BALB/C)裸鼠購自貴州醫(yī)科大學(xué)動物中心[SYXK(黔)2018-001]，體質(zhì)量14～15 g，4～6周，飼養(yǎng)于學(xué)校動物房無特定病原體(specefic pathogen free，SPF)級無菌室。實(shí)驗(yàn)獲學(xué)校實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)(No2000784)。

1.1.2主要試劑及儀器 胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、雙抗、胰蛋白酶和磷酸鹽緩沖液購自美國Gibco公司，CD133免疫磁珠分選試劑盒購自德國Miltenyi公司，小鼠單克隆CD133抗體和羊抗鼠熒光二抗購自美國Proteintech公司，Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠購自美國Corning公司，多聚甲醛購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，結(jié)晶紫購自上海生工生物工程有限公司。倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，正置熒光顯微鏡購自日本Nikon。

1.2 方法

1.2.1免疫磁珠分選人CD133+原代胃癌細(xì)胞 復(fù)蘇細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部后消化細(xì)胞，用緩沖液將細(xì)胞制備成1×107個/mL的單細(xì)胞懸液，加鼠抗人CD133單克隆抗體10 μL，4 ℃孵育15 min；加緩沖液2 mL洗滌細(xì)胞，1 000 r/min離心8 min，棄上清；加緩沖液400 μL重懸細(xì)胞，加Anti-Biotin MicroBeads 25 μL充分混合，4 ℃孵育20 min；加緩沖液10 mL洗滌細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，吸上清液于緩沖液1 000 μL中重懸細(xì)胞；將細(xì)胞懸液移入分離柱中并使分離柱置于磁力架上，室溫孵育10 min；緩慢流出分離柱的細(xì)胞懸液為CD133-組；從磁力架上取下分離柱，將緩沖液加入分離柱中，將柱塞推入柱中，沖洗下的磁性標(biāo)記的細(xì)胞為CD133+組。為了增加CD133+胃癌細(xì)胞的純度，再次使用新分離柱重復(fù)磁選步驟。

1.2.2免疫熒光檢測CD133的表達(dá) 將分選后的CD133-和CD133+原代胃癌細(xì)胞分別接種于有細(xì)胞爬片的12孔板中，常規(guī)培養(yǎng)后取出爬片并用PBS洗滌，4 %多聚甲醛固定30 min后PBS洗3次、用0.3%Triton X-100通透30 min，PBS洗滌；BSA室溫封閉30 min，鼠抗CD133單克隆抗體4 ℃孵育過夜，次日PBS洗3次，滴加羊抗鼠熒光二抗，避光孵育2 h，PBS洗3次，DAPI染核15 min，PBS洗3次，滴加抗熒光衰弱封片劑10 μL，熒光顯微鏡下觀察CD133的表達(dá)情況。

1.2.3細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 制備細(xì)胞懸液，在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中以1 000個/孔的密度接種細(xì)胞，蓋上蓋子，輕輕混勻后放入37 ℃的5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d觀察1次，待細(xì)胞形成肉眼可見的克隆時，取出6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，PBS緩沖液沖洗，多聚甲醛固定后用結(jié)晶紫染色。隨機(jī)選3個視野，用IMAGE J計數(shù)每個視野的細(xì)胞克隆數(shù)。

1.2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 制備細(xì)胞懸液，在6孔板中以1×105/mL密度接種細(xì)胞后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，待細(xì)胞長滿后用移液器槍頭緊貼直尺，垂直于6孔板水平線劃痕，PBS清洗未貼壁的細(xì)胞后加入無血清培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；分別在0、24、48及72 h用倒置顯微鏡觀察、并拍照，計算傷口愈合百分比[傷口愈合百分比(%)=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度]。

1.2.5Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將50 mg/L的基質(zhì)膠(Matrigel)與RPMI 1640培養(yǎng)基以1 ∶8稀釋，取稀釋液100 μL滴加于Transwell小室底部膜的上室，細(xì)胞培養(yǎng)箱中凝固1 h，制備細(xì)胞懸液；以5×104/mL細(xì)胞密度接種于Transwell小室的上室，Transwell小室的下室加完全培養(yǎng)基100 μL，放細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，固定，結(jié)晶紫染色后拍照。隨機(jī)選3個視野，用IMAGE J計數(shù)每個視野的穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.6裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)、瘤組織學(xué)觀察及CD133、Ki67表達(dá) 取4只裸鼠均分為 CD133+組和CD133-組，分別接種相應(yīng)的原代胃癌細(xì)胞，接種細(xì)胞量均為1×106個/只、接種于裸鼠腋窩中后部；觀察裸鼠移植后的反應(yīng)、成瘤時間，并用卡尺測量瘤體的長度(L)和寬度(W)，計算瘤體體積[瘤體體積(V)=(L×W)2×0.5]、并繪制瘤體生長曲線；接種第32天麻醉處死裸鼠，取瘤組織塊多聚甲醛固定、切片、HE染色觀察兩組瘤體組織切片，采用免疫組織化學(xué)檢測CD133、Ki67的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 原代胃癌細(xì)胞中CD133表達(dá)

磁珠分選后，用免疫熒光檢測CD133+組和CD133-組的CD133表達(dá)，結(jié)果顯示，CD133主要在CD133+原代胃癌細(xì)胞的細(xì)胞膜及胞質(zhì)中表達(dá)，提示成功分選到了CD133+原代胃癌細(xì)胞。CD133-組原代胃癌細(xì)胞平均光密度低于CD133+組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

2.2 原代胃癌細(xì)胞的體外增殖能力

成功獲得CD133+原代胃癌細(xì)胞后，用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的體外增殖能力。結(jié)果如圖2所示，CD133+原代胃癌細(xì)胞形成的克隆數(shù)高于CD133-原代胃癌細(xì)胞形成克隆數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

注：A為克隆形成后的結(jié)晶紫染色結(jié)果，B為細(xì)胞克隆數(shù)量的定量結(jié)果；(1)與CD133-組比較，P<0.001。

2.3 原代胃癌細(xì)胞的體外遷移能力

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，CD133+原代胃癌細(xì)胞傷口愈合率(76.5±1.4)%，顯著高于CD133-原代胃癌細(xì)胞(39.8±2.0)%，P<0.001，提示CD133+原代胃癌細(xì)胞有更強(qiáng)的遷移能力。

注：A、B分別為CD133-組和CD133+組0 h時細(xì)胞劃痕結(jié)果(劃痕實(shí)驗(yàn)，×100)，C、D分別為CD133-組和CD133+組48 h時細(xì)胞劃痕結(jié)果(劃痕實(shí)驗(yàn)，×100)，E為細(xì)胞遷移寬度的定量表達(dá)；(1)與CD133-組比較，P<0.001。

2.4 原代胃癌細(xì)胞的體外侵襲能力

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4顯示，CD133+組侵入Transwell下室面的細(xì)胞數(shù)(624±37)/視野顯著高于CD133-組(281±31)/視野，(P<0.001)。

2.5 原代胃癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力

將CD133+和CD133-的原代胃癌細(xì)胞種植到裸鼠皮下，結(jié)果顯示CD133+接種組2只裸鼠分別于第12天和第20天開始成瘤，CD133-接種組1只裸鼠于第26天開始成瘤、1只不成瘤(圖5)；HE染色結(jié)果觀察到2組裸鼠腫瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)(圖6)；免疫組織化學(xué)染色顯示，CD133+接種組裸鼠原代胃癌細(xì)胞中CD133+和Ki67的表達(dá)明顯高于CD133-接種組，提示裸鼠體內(nèi)CD133+胃癌細(xì)胞成瘤能力高于CD133-胃癌細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖7)。

注：A為處死的裸鼠和取出瘤體，B為腫瘤體積生長曲線。

CD133+接種組 CD133-接種組

注：A、B分別為CD133+和CD133-接種組裸鼠CD133的表達(dá)，C、D分別為CD133+和CD133-接種組裸鼠Ki67的表達(dá)，E、F分別為CD133、Ki67表達(dá)的定量結(jié)果；(1)與CD133-接種組比較，P<0.01。

3 討論

腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是各種實(shí)體瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的重要原因[3]。細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)已被用于從不同腫瘤中分離腫瘤干細(xì)胞，例如CD44、CD24、CD29及CD133等[16]。發(fā)現(xiàn)CD133+/CD166+人類胃癌細(xì)胞系BGC-823和SGC-7901具有癌癥干細(xì)胞特性[17]；也有研究表明，胃癌中CD133的過表達(dá)與其臨床病理特征密切相關(guān)，且CD133陽性患者比CD133陰性患者耐藥性和復(fù)發(fā)率更高，且5年生存率更低[18-19]。此外，研究表明,CD133 miRNA結(jié)合位點(diǎn)可能是胃癌遺傳易感性的潛在生物標(biāo)志物和胃癌患者生存的預(yù)測指標(biāo)[20]；朱優(yōu)龍等[21]研究顯示CD133可能通過調(diào)節(jié)強(qiáng)效P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gP)和B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的表達(dá)促進(jìn)胃癌的化療耐藥；在胃癌化療耐藥產(chǎn)生中，CD133+細(xì)胞可通過磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，Akt)通路起作用[22]；但也有學(xué)者認(rèn)為CD133和CD44細(xì)胞表面標(biāo)記不能識別原發(fā)性人胃腫瘤中的腫瘤干細(xì)胞[23]。盡管關(guān)于CD133與胃癌的基礎(chǔ)和臨床研究多種多樣，但有關(guān)CD133的現(xiàn)有文獻(xiàn)尚未闡明其在腫瘤干細(xì)胞中的生物學(xué)功能。

本研究通過免疫磁珠成功從手術(shù)切除的胃癌組織中分離到人CD133+胃癌細(xì)胞，并在體外傳代培養(yǎng)，經(jīng)免疫熒光證實(shí)人CD133+胃癌細(xì)胞中高表達(dá)CD133，且主要在細(xì)胞膜及胞質(zhì)中表達(dá)；隨后用克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)CD133+胃癌細(xì)胞比CD133-細(xì)胞具有更強(qiáng)的體外增殖、遷移和侵襲能力，提示CD133+胃癌細(xì)胞可能具有干細(xì)胞的特性，這與其他研究者在其它腫瘤的研究結(jié)果一致[24-27]。為了探究CD133+胃癌細(xì)胞在體內(nèi)形成腫瘤的能力，繼續(xù)將CD133+和CD133-胃癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)CD133+胃癌細(xì)胞比CD133-胃癌細(xì)胞的成瘤時間早、增長速度快，且CD133-胃癌細(xì)胞有不成瘤的現(xiàn)象，然而目前無文獻(xiàn)報道CD133-胃癌細(xì)胞有不成瘤的現(xiàn)象，可能是與分離出的原代胃癌細(xì)胞與其他細(xì)胞株的差異導(dǎo)致；免疫組織化學(xué)進(jìn)一步證實(shí)CD133+的移植瘤組織中CD133和Ki67高表達(dá)。因此，本研究證明了從人原代胃癌細(xì)胞中分離出來的CD133+胃癌細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特征，可能與胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。也有研究者用RNA干擾技術(shù)下調(diào)胃癌細(xì)胞株KATO Ⅲ中CD133的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)降低了胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、克隆球形成、耐藥以及裸鼠體內(nèi)成瘤的能力[28]。由于腫瘤干細(xì)胞的定義仍有爭議，其產(chǎn)生和發(fā)展的機(jī)制尚不清楚，因此進(jìn)一步研究腫瘤干細(xì)胞的微環(huán)境和信號通路以及與胃癌發(fā)生、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥性的關(guān)系極為重要。

綜上所述，本研究成功分離獲得人CD133+和CD133-原代胃癌細(xì)胞，與人CD133-原代細(xì)胞相比，CD133+人原代胃癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的體外增殖、遷移和侵襲能力及體內(nèi)成瘤能力，為進(jìn)一步研究奠定了良好的基礎(chǔ)。