王 青，李 耘，鄭 波

(北京大學(xué)第一醫(yī)院臨床藥理研究所，北京 100034 )

肺炎克雷伯菌是常見的機會致病菌之一，主要感染免疫力低下且患有嚴重基礎(chǔ)疾病的患者，導(dǎo)致肺炎、敗血癥、化膿性肝膿腫等嚴重感染[1]。長期以來碳青霉烯類藥物是治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases ,ESBLs)肺炎克雷伯菌相關(guān)感染的有效抗生素。然而，碳青霉烯類藥物的頻繁使用，導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對此類藥物的耐藥率升高[2]。在我國，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)檢出率從2005年的3.00%增加到2017年的20.90%[3]，給臨床治療帶來挑戰(zhàn)。本研究挑選出我國2017—2018年細菌耐藥監(jiān)測研究(CARST)中CRKP菌株，并對其進行藥物敏感性分析和耐藥基因檢測，旨在為針對CRKP感染的抗菌藥物選擇提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 北京大學(xué)臨床藥理研究所2017—2018年CARST中收集的CRKP，篩選條件：亞胺培南、美羅培南、厄他培南任一不敏感的非重復(fù)性臨床分離株。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 除多粘菌素E外，其他藥物采用標準瓊脂二倍稀釋法。瓊脂二倍稀釋法試驗細菌懸液采用多點接種儀接種，每一點接種量為1×104CFU；多粘菌素E采用微量肉湯二倍稀釋法，細菌最終濃度為5×105CFU/mL。多黏菌素 E、磷霉素氨丁三醇使用歐盟藥敏試驗標準委員會(EUCAST) 推薦折點，替加環(huán)素使用美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)推薦折點，其他藥敏結(jié)果根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI，2019)標準，判定敏感性和耐藥性，其中頭孢哌酮/舒巴坦參照頭孢哌酮的標準判讀。大腸埃希菌ATCC 25922和大腸埃希菌ATCC 35218被用作藥敏試驗的質(zhì)量控制標準菌株。

1.2.2 耐藥基因檢測 將細菌接種于中國蘭瓊脂平板上，37℃溫箱孵育16～20 h。次日挑取單個菌落三區(qū)劃線于中國蘭平板分純，37℃溫箱孵育16～20 h，分離得到單個純種菌落。第三日采用煮沸法提取DNA模板。使用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)檢測編碼碳青霉烯酶(blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM、blaOXA)和其他廣譜、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(blaTEM、blaSHV、blaCTX-M)基因，引物序列設(shè)計以及擴增條件參照文獻[4-8]，具體見表1，每批PCR試驗均帶有陰性和陽性對照。反應(yīng)停止后，取3 μL于1%瓊脂糖凝膠電泳(含1/10 000 GelRed染料)。陽性產(chǎn)物送北京諾賽基因公司測序，將測序結(jié)果提交到BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進行比對序列以確定耐藥基因亞型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行分析，藥敏結(jié)果采用χ2檢驗進行比較，P<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1 CRKP耐藥基因引物序列及退火溫度

表2 CRKP在臨床標本及科室中分布構(gòu)成比

表3 CRKP對抗菌藥物的耐藥率和敏感率(%)

2.2 基因檢測結(jié)果 129株CRKP，共112株檢測出碳青霉烯酶基因，涉及5種基因型，blaKPC-2、blaNDM-1、blaNDM-5、blaOXA51、blaIMP-4基因檢出率分別為77.52%、6.20%、2.33%、2.33%、0.78%，其中3株同時含blaKPC-2和blaNDM基因。blaTEM檢出率為51.94%，均為blaTEM-1；blaSHV檢出率為64.34%，主要為blaSHV-11(18.60%)和blaSHV-12(27.91%)，此外還有7株(5.43%)含blaSHV-1，3株(2.33%)含blaSHV-28；blaCTX-M檢出率為53.49%，分別為blaCTX-M-9(43.41%)和blaCTX-M-15(10.08%)，其中4株(3.10%)同時含blaCTX-M-9和blaCTX-M-15基因。80.36%的菌株攜帶ESBLs基因，32.14%的菌株同時攜帶2種或以上ESBLs基因。見表4。

2.3blaKPC-2、blaNDM基因陽性菌株與不產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的藥物敏感性 不產(chǎn)碳青霉烯酶菌株對β-內(nèi)酰胺類藥物中碳青霉烯類、β-內(nèi)酰胺類復(fù)合劑及部分第三代頭孢菌素敏感率高于產(chǎn)酶菌(P<0.01)。在產(chǎn)碳青霉烯酶的CRKP中，相對blaKPC-2基因陽性菌，亞胺培南、美羅培南和氨曲南對blaNDM基因陽性菌株具有更好抗菌作用，MIC50和/或MIC90值低于blaKPC-2基因陽性菌。對于非β-內(nèi)酰胺類藥物，blaKPC-2基因陽性菌對磷霉素氨丁三醇均表現(xiàn)出較低敏感率(P<0.01)；不產(chǎn)碳青霉烯酶菌株對多粘菌素E敏感率低于產(chǎn)酶菌(P<0.01)。見表5。

表4 129株CRKP耐藥基因檢出情況

表5 blaKPC-2和blaNDM基因陽性菌株與不產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的藥敏結(jié)果

續(xù)表5 (Table 5， Continued)

3 討論

ESBLs是由質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，能夠使細菌對青霉素類、第一至第四代頭孢菌素類和氨曲南耐藥；ESBLs最流行的是SHV和CTX-M兩種類型[16]。本研究碳青霉烯酶基因陽性菌株中，80.36%(90/112)同時攜帶ESBLs基因，主要是blaSHV-12和blaCTX-M-9基因，32.14%(36/112)同時攜帶2種或以上ESBLs基因，與CRKP耐藥基因以KPC-2型為主，同時攜帶ESBLs基因的報道[17-18]相似。

綜上論述，我國臨床CRKP分離株耐藥問題嚴重且攜帶多種耐藥基因，CRKP攜帶的主要碳青霉烯酶基因是blaKPC-2，最常見的ESBLs基因是blaSHV-12和blaCTX-M-9基因，需要加強CRKP中碳青霉烯酶的監(jiān)測。本文特色是試驗菌株來自全國不同地區(qū)，并且同時檢測了碳青霉烯酶基因與ESBLs基因，藥敏試驗涵蓋較全的臨床治療藥物，但不足之處是耐藥菌株未進行同源性檢測，可在后續(xù)CRKP遺傳背景中深入地研究。