張彬彬 郁皓 曹斐 吳曉霞 單永鋒 王昊楠 劉慧

常用的篩查肝細(xì)胞癌(HCC)的手段是AFP檢測聯(lián)合超聲多普勒檢查，然而，AFP檢測早期HCC的敏感度只有39%～65%[1]。目前眾多的lncRNA在腫瘤患者血清中被發(fā)現(xiàn)高表達(dá)，預(yù)測其可能作為腫瘤的診斷標(biāo)志物[2-7]。結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(colon cancer associated transcript 1，CCAT1)被發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、膽囊癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，并具有促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲和遷移的作用，并與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，可作為潛在的預(yù)后標(biāo)志物[4，8-11]。本研究首次檢測CCAT1在HCC患者血液中的表達(dá)水平，探索其作為診斷HCC的血液標(biāo)志物的可能性，并研究其在HCC介入或射頻前后的表達(dá)水平。

材料與方法

一、研究對象

收集江蘇省無錫市第五人民醫(yī)院2017年到2019年期間66例肝癌患者血液標(biāo)本，并收集50例年齡、性別相匹配的健康成人對照。其中肝癌組的37例患者經(jīng)介入或射頻治療，并留取治療后1個月左右的血液標(biāo)本。靜脈采血后2 h內(nèi)3 000 r/min 4 ℃低溫離心15 min，收集血漿，分裝到離心管中，每管500 μL凍存在-80 ℃。所有樣本采集均得到患者知情同意。所有樣本使用取得無錫市第五人民醫(yī)院倫理委員會同意及支持。

二、RNA提取及實時定量PCR

TRIzol LS Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 被用來提取血漿總RNA，具體步驟根據(jù)產(chǎn)品說明書。RNA被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA應(yīng)用HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme，南京，中國)。使用Fast Probe Mixture(CWBIO，北京，中國)進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，2 μL cDNA被用來作為反應(yīng)模板。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min預(yù)變性，隨后95 ℃ 15 s變性，65 ℃ 1 min擴(kuò)增，共40個循環(huán)。β-actin被作為內(nèi)源性標(biāo)志物。引物序列如下: CCAT1, 5′-CATTGGGA-AAGGTGCCGAGA-3′ (sense) and 5′-ACGCTTAGCC-ATACAGAGCC-3′ (anti-sense)；β-actin, 5′-TCCTCTC-CCAAGTCCACACA-3′ (sense) and 5′-GCACGAAG-GCTCATCATTCA-3′ (anti-sense)。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS18.0軟件用來分析數(shù)據(jù)，采用U檢驗比較各組血漿CCAT1水平。分組資料分析采用卡方檢驗。應(yīng)用ROC曲線評價血漿CCAT1對HCC的診斷價值。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)價值。

結(jié) 果

一、HCC患者血漿CCAT1表達(dá)水平增加及其診斷價值

采用逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測各組血漿CCAT1的相對表達(dá)情況并進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，66例HCC患者血漿CCAT1表達(dá)水平明顯高于50例健康志愿者(P=0.016)。

通過ROC曲線分析來評估血清CCAT1是否可以作為HCC的潛在生物標(biāo)志物。結(jié)果表明，血漿CCAT1可區(qū)分HCC患者與正常對照組，其ROC曲線下面積為0.782(95%CI：0.692～0.873，P<0.001)。在截斷值為0.010 3時，敏感度和特異度分別為68.6%和69.8%，對HCC的診斷有一定的價值。

二、HCC患者經(jīng)治療后血漿CCAT1表達(dá)水平較前下降

37例HCC患者經(jīng)射頻消融或肝動脈介入化療后檢測血漿中CCAT1表達(dá)水平，結(jié)果表明，CCAT1表達(dá)較治療前下降(P=0.003)，揭示了CCAT1的表達(dá)水平的變化可能作為判斷HCC治療效果的血液標(biāo)志物。

三、CCAT1的表達(dá)水平及其與HCC臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

研究表明，多種在HCC組織中異常表達(dá)的lncRNA呈現(xiàn)出與腫瘤患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，因此我們分析了血漿中CCAT1的表達(dá)水平與HCC患者臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系。根據(jù)CCAT1的中位表達(dá)水平將所有患者分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，如表1所示，血漿中CCAT1的表達(dá)水平與HCC患者的BCLC分期相關(guān)，BCLC分期越高，則CCAT1的表達(dá)水平越高。CCTA1的表達(dá)水平與HCC患者的性別、年齡、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小、Child分級、AFP水平未表現(xiàn)出明顯關(guān)系。

表1 66例肝癌患者血漿中CCAT1的表達(dá)水平

討 論

截至目前，HCC的發(fā)生機(jī)制仍未完全闡明。眾多研究報道，多種lncRNA均參與HCC的發(fā)生、發(fā)展，例如lncRNA TUG1、CASC9、HULC、PTTG3P等[12-14]。最新研究發(fā)現(xiàn)，CCAT1在HCC組織中高表達(dá)，其通過與miR-181a競爭性結(jié)合調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞的增殖及自噬[15]。另有研究發(fā)現(xiàn)，CCAT1在結(jié)直腸癌患者的血液中高表達(dá)，其與HOTAIR聯(lián)合檢測用于預(yù)測結(jié)直腸癌的患病率其敏感度及特異度均較高[4]，這表明CCAT1可在腫瘤患者血液中穩(wěn)定表達(dá)。本研究旨在探討CCAT1在HCC患者血漿中的表達(dá)水平，并分析其作為HCC血液標(biāo)志物及治療評估標(biāo)志物的可能性。

本研究檢測了66例HCC患者與50例健康成年人血漿中CCAT1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CCAT1在HCC患者血漿中的表達(dá)水平較高，且患者的BCLC分期越高，則CCAT1的表達(dá)水平越高，這表明檢測血漿CCAT1的表達(dá)水平可能可以區(qū)分HCC患者及健康成年人，其表達(dá)水平越高，則提示病情越晚，這對HCC的診斷及病情判斷有一定的價值。66例HCC患者中，有37例患者是行射頻或介入治療的，比較了治療前與治療后1個月左右CCAT1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，經(jīng)射頻或介入治療后CCAT1的表達(dá)水平明顯下降，提示CCAT1可能作為預(yù)測HCC治療效果的腫瘤標(biāo)志物。本研究亦存在許多需進(jìn)一步完善之處，后續(xù)應(yīng)擴(kuò)大樣本量，延長隨訪時間，盡量取得相同患者不同時間點(diǎn)的血液標(biāo)本，橫向比較CCAT1在整個病程中的變化，及其與生存時間的相關(guān)性。

綜上所述，本研究提示CCAT1可作為HCC的血液標(biāo)志物，并可預(yù)測其治療效果。