王船英 邾枝花 季婷婷 許玉芳

安徽醫(yī)學高等?？茖W校，安徽 合肥 230601

茶葉，山茶科植物茶Camellia sinensis（Linn．）O．Katze的干燥嫩葉。嫩枝無毛。葉革質(zhì)，長圓形或橢圓形，先端鈍或尖銳，基部楔形，上面發(fā)亮，下面無毛或初時有柔毛，邊緣有鋸齒，葉柄無毛。茶葉是中國傳統(tǒng)飲品，入口澀，回味甘。茶葉中含有兒茶素、茶多酚、茶多糖、咖啡因等多種有益成分，各種成分均有不同的保健功效。［1?3］咖啡因（C8H10N4O2），弱堿性化合物，作為茶葉中的一種重要成分，咖啡因具有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)，促進新陳代謝、消除疲勞、增加心臟和胃腸道功能的作用。［4?6］近年來研究顯示，咖啡因可以預防阿爾茨海默病、早產(chǎn)兒支氣管肺炎，適當飲用還可以降低肥胖、糖尿病和腫瘤的發(fā)病風險。因此研究茶葉中咖啡因的含量，可以合理利用茶葉的保健功能［7］。?

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1儀器 高效液相色譜儀（Waters 1525?2489）；色譜柱（C18，5μm×4．6 mm×250 mm，大連依利特）；超聲清洗儀（UP?2200H型）；萬分之一電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；AT?330柱溫箱；電加熱套；索氏提取裝置；蒸餾裝置；蒸發(fā)皿；熔點測定儀（北京科儀電光儀器，XT4B型）等。

1.1.2材料與試劑 茶葉（5批安徽不同產(chǎn)地市售茶葉，產(chǎn)地分別為黃山、霍山、桐城、岳西、六安）；咖啡因?qū)φ掌罚▽嶒炇易灾疲?；氧化鈣（分析純）；氫氧化鈉（分析純）；95%乙醇（分析純）；甲醇（色譜純）；純化水；0．45μm有機濾膜。

1.2 溶液的配制

1.2.1 對照品儲備液的配制

1.2.1.1 對照品的提取精制 稱取適量茶葉末，置于濾紙?zhí)淄仓校?50 ml圓底燒瓶中加入90 ml 95%乙醇，沸石5～6粒，利用索氏提取器裝置連續(xù)回流1～2 h，回流液經(jīng)蒸餾裝置蒸餾濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，加入氧化鈣3～4 g，沸水浴濃縮至黏稠，隔石棉網(wǎng)酒精燈加熱，焙炒至干燥。用扎滿小孔的濾紙蓋在蒸發(fā)皿上，倒扣上普通玻璃漏斗，漏斗頸塞上脫脂棉，繼續(xù)小火加熱升華，至出現(xiàn)棕色煙霧，停止加熱。收集濾紙上和漏斗壁上的晶體，晶體呈白色針狀。［8-9］

1.2.1.2 咖啡因?qū)φ掌返蔫b別 取1.2.1.1項所得的晶體適量進行毛細管裝樣，將待測毛細管置于熔點測定儀中進行檢測，得到所裝樣品的熔點為236.7～237.4℃。［10］熔點與咖啡因藥典標準2010版一致。

1.2.1.3 對照品溶液的配制 精密稱取實驗室自制的咖啡因?qū)φ掌?.0050 g，用甲醇溶解定容至50m l容量瓶中，制得對照品溶液濃度為1 mg·ml-1，備用。

1.2.2 茶葉樣品溶液的制備 精密稱取茶葉末1g，置于濾紙?zhí)淄仓?，圓底燒瓶中加70 ml 95%乙醇，利用索氏提取裝置連續(xù)回流1.5 h后，將回流液用95%乙醇定容至100 m l容量瓶中。再從中吸取1 ml溶液用純化水定容至5 ml容量瓶中，即得。5批樣品溶液均用此方法制得。

1.3 色譜條件

色譜柱為C18(5μm×4.6 mm×250 mm);流動相為甲醇∶純化水=(40∶60);流速為1ml·min-1;檢測波長為271 nm［11-13］;柱溫為室溫;進樣體積為20μl，所有進樣溶液均經(jīng)過0.45μm的微孔濾膜濾過。

1.4 線性關(guān)系考察

精密吸取1.2.1項的對照品儲備液稀釋成0.1 mg·m l-1、0.25 mg·ml-1、0.5 mg·ml-1、0.75 mg·ml-1不同濃度的對照品溶液。分別吸取過濾后的該5種不同濃度的對照品溶液20μl，注入色譜儀。以峰面積Y為縱坐標，以進樣濃度X為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=3×107X+673529，R2=0.999。結(jié)果表明，咖啡因在2～20μg之間，其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，見圖1。咖啡因?qū)φ掌飞V圖見圖2所示。

圖1 咖啡因?qū)φ掌肪€性關(guān)系

圖2 咖啡因?qū)φ掌稨PLC圖譜

1.5 精密度實驗

精密吸取1.2.1項下已配制的1 mg.ml-1的咖啡因?qū)φ掌啡芤?0μl，連續(xù)6次進樣，得到咖啡因的峰面積。6次峰面積見表1所示。經(jīng)過計算，其RSD值為0.16%，說明儀器精密度良好。

表1 精密度實驗

1.6 重復性實驗

吸取1.2.2項已配制的霍山產(chǎn)茶葉溶液6次分別進樣，每次20μl，檢測后咖啡因的峰面積見表2所示。經(jīng)計算，其RSD值為1.9%，說明該方法重復性好。

表2 重復性實驗

1.7 穩(wěn)定性試驗

精密吸取1.2.2項下黃山產(chǎn)茶葉溶液20μl，在1.3項色譜條件下，在放置0、4、8、12、24 h測定咖啡因峰面積見表3所示，并計算出RSD值為1.3%。說明待測樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性實驗

2含量測定

精密稱取5個產(chǎn)地茶葉，每份1 g，按1.2.2項方法制取樣品溶液。過0.45μm微孔濾膜，待測。吸取每份溶液20μl進樣。每份溶液各進兩針。樣品溶液的液相色譜圖見圖3。5份溶液共10次所測咖啡因峰面積見表4所示。

圖3 茶葉樣品溶液HPLC圖譜

表4 5產(chǎn)地茶葉中咖啡因的含量

3結(jié)論

運用該實驗方法對各產(chǎn)地茶葉中提取的咖啡因進行檢查，結(jié)果表明:5批不同產(chǎn)地的茶葉中，咖啡因含量均不相同，但都不低于5%。其中六安產(chǎn)地茶葉含量最高為6.9%。整個實驗檢測結(jié)果準確性高，出峰快，操作過程靈活便捷，專屬性強。此方法適合用于測定茶葉中咖啡因的含量。