駱 青 孔 剛

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬泰山醫(yī)院腎內(nèi)科，山東 泰安 271000

糖尿病腎病是糖尿病最為重要的合并癥之一，且臨床上對于其病因、發(fā)病機制尚不知曉，普遍認(rèn)為與遺傳因素、腎臟血流動力學(xué)遺傳、高血糖造成的代謝異常及高血壓等有關(guān)[1]。同時，糖尿病腎病患者常伴有代謝紊亂，一旦發(fā)展到終末期腎病，導(dǎo)致臨床治療難度更大[2]。足細(xì)胞在人體中比較常見，通常多附著在腎小球基底膜外側(cè)，能與腎小球基底膜、內(nèi)皮細(xì)胞等相互結(jié)合，形成一個過濾保護屏障。臨床研究表明[3]：足細(xì)胞在蛋白質(zhì)濾過中發(fā)揮了重要的作用，再加上該細(xì)胞自我增殖能力較低，當(dāng)細(xì)胞形態(tài)、功能或數(shù)量發(fā)生變化后，將會增加腎衰竭發(fā)生率[4]。因此，多數(shù)糖尿病患者由于機體內(nèi)持續(xù)的高血糖，導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)量降低，造成足細(xì)胞從GBM上脫落隨尿液排出從而形成局灶粘連和腎小球硬化[5]。IQ結(jié)構(gòu)域 GTP 酶活化蛋白 1(IQGAP1)屬于一種特殊的支架蛋白，含有多個蛋白域，能參與細(xì)胞的黏膜、細(xì)胞凋亡及增殖，但是在糖尿病腎病患者中的表達(dá)研究較少[6-7]。因此，本研究采用隨機對照方法進(jìn)行研究，探討IQGAP1在糖尿病腎病患者足細(xì)胞凋亡中的作用，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2015年1月—2019年12月就診的糖尿病腎病患者24例，設(shè)為實驗組，男15例，女9例，年齡31～80歲，平均(52.69±5.77)歲；病程1～7年，平均(3.47±0.56)年；體重44～78 kg，平均(67.89±4.61)kg。選擇同期治療的單純原發(fā)性腎炎或腎病綜合征患者12例，設(shè)為對照組，男7例，女5例，年齡30～81歲，平均(53.41±5.79)歲；體重45～75 kg，平均(66.71±4.58)kg。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合糖尿病腎病診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，且患者均具有糖尿病史；②伴有不同程度腎功能不全或視網(wǎng)膜病變，且經(jīng)糖尿病腎病檢查確診；③均在醫(yī)囑下完成檢查、診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：①活動性蛋白尿患者，乙肝相關(guān)性腎炎患者、過敏性紫癜腎炎患者、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者、淀粉樣變性、多發(fā)性骨髓瘤腎病等其他繼發(fā)性腎臟病患者；②近期使用其他方法治療或影響預(yù)后評估者；③合并惡性腫瘤、精神系統(tǒng)疾病后伴有自身免疫系統(tǒng)疾病者。

1.2 儀器與設(shè)備

表1 儀器與設(shè)備

1.3 方法

(1)IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2表達(dá)。①檢測方法。采用免疫組織化學(xué)法完成兩組腎臟組織中IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2表達(dá)水平檢測。兩組均經(jīng)穿刺取腎臟組織，向組織中加入蒸餾水與濃度為30.0%H2O2，常溫下加入內(nèi)源性酶并進(jìn)行10 min滅活，PBS連續(xù)進(jìn)行3次洗滌。將最終獲得的切片放置在0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液中，加入生理鹽水控制溶液PH最終為6。電爐加熱直到煮沸，5 min間隔后再次煮沸，常溫下冷卻。采用PBS 2次洗滌，每次5 min，最后加入5%BSA封閉液并加入兔抗人IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2蛋白(1∶100)一抗，一滴。滴加完畢后進(jìn)行3次PBS洗滌；在1 ml底物中加入兔抗人IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2蛋白二抗一滴，混合后常溫下顯色，蘇木素復(fù)染后封片，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量，每份標(biāo)本測定三次，取平均值；②判斷方法。參考奧爾雷德評分標(biāo)準(zhǔn)分別從細(xì)胞的陽性數(shù)量(陽性細(xì)胞數(shù)≤25.0%0分，26%～50.0%1分，51%～75%2分，>75%3分)、染色強度(不著色0分，黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分)完成免疫組化染色評分，總分16分，陽性率越高[9-10]。(2)相關(guān)性分析。采用SPSSPearson相關(guān)性分析軟件分析IQGAP1與p-ERK1/2、ERK1/2表達(dá)及分布關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 兩組IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2陽性率比較

實驗組糖尿病腎病組織中IQGAP1陽性率低于對照組(P<0.05)；實驗組糖尿病腎病組織中p-ERK1/2、ERK1/2陽性率均高于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2陽性率比較[n(%)]

2.2 IQGAP1在兩組腎臟組織中的分布

免疫組化結(jié)果表明：實驗組糖尿病腎病組織中足細(xì)胞裂隙變窄，足突縮小及伴有節(jié)段性融合，可見足細(xì)胞凋亡小體形成，IQGAP1分布在腎小球足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中；對照組腎臟組織中未見腎臟病變改變，IQGAP1表達(dá)水平較高，見圖1。

圖1 IQGAP1在腎臟組織中的分布(×200)

2.3 實驗組中IQGAP1與p-ERK1/2、ERK1/2相關(guān)性分析

SPSSPearson相關(guān)性分析結(jié)果表明：實驗組腎臟組織中IQGAP1與p-ERK1/2、ERK1/2蛋白陽性率呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，見表3。

表3 實驗組中IQGAP1與p-ERK1/2、ERK1/2相關(guān)性分析(r，P)

3 討 論

數(shù)據(jù)報道顯示[11]，糖尿病患者10年以上并發(fā)腎病率為30.0%，糖尿病腎病患者平均生存年限僅為10年，且多數(shù)患者由終末期腎衰竭引起。細(xì)胞凋亡又稱為細(xì)胞程序性死亡，與糖尿病腎病發(fā)病關(guān)系密切。對于糖尿病腎病患者細(xì)胞的異常凋亡與氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷及糖基化終末產(chǎn)物有關(guān)，多有腎小管上皮細(xì)胞、足細(xì)胞等多種細(xì)胞因子參與[12]。而高糖環(huán)境下腎臟足細(xì)胞凋亡是引起糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的重要機制，但是臨床上對于其具體機制尚未知曉。

IQGAP1屬于一種細(xì)胞內(nèi)支架蛋白，含有多個特殊蛋白結(jié)合域，上述特殊的結(jié)構(gòu)域能與靶分子相互作用，在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞形態(tài)及炎癥介導(dǎo)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。國內(nèi)學(xué)者研究表明[13]，IQGAP1在腎臟、胎盤及肺臟組織中表達(dá)。本研究中，實驗組糖尿病腎病組織中IQGAP1陽性率低于對照組(P<0.05)；實驗組糖尿病腎病組織中p-ERK1/2、ERK1/2陽性率均高于對照組(P<0.05)，說明IQGAP1在腎臟組織中呈低表達(dá)，能直接參與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。最新研究表明：多種細(xì)胞通路能參與細(xì)胞凋亡的發(fā)展，MAPK信號通路是其中的一種。從大的角度來說，MAPK信號通路中含有MAPK激酶的激酶、MAPK激酶和MAPK。在正常人體中含有JNK/SAPK、P38MAPK家族及ERK1/2 MAPK家族。而在上述家族中ERK1/2 MAPK家族與細(xì)胞的增殖最為密切[14]。本研究中，免疫組化結(jié)果表明：實驗組糖尿病腎病組織中足細(xì)胞裂隙變窄，足突縮小及伴有節(jié)段性融合，可見足細(xì)胞凋亡小體形成，IQGAP1分布在腎小球足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中；對照組腎臟組織中未見腎臟病變改變，IQGAP1表達(dá)水平較高，說明IQGAP1在糖尿病腎病組織中呈低表達(dá)，能直接參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。

糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素過程，常伴有微量白蛋白尿水平異常，而蛋白尿與足細(xì)胞損傷存在緊密的聯(lián)系[15]。人腎臟足細(xì)胞屬于一種終末分化的上皮細(xì)胞，具有相對復(fù)雜的細(xì)胞骨架系統(tǒng)，細(xì)胞之間通過足突嵌合在一起，形成相對完整的裂孔膜，這些裂孔膜的蛋白質(zhì)分子之間能決定腎小球濾過的蛋白質(zhì)分子量的大小，從而參與蛋白尿的調(diào)控作用[16]。但是，當(dāng)足突間裂孔膜發(fā)生損傷后則會引起蛋白尿的發(fā)生，從而參與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展[17]。為了進(jìn)一步研究IQGAP1在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展中的作用，對IQGAP1與p-ERK1/2、ERK1/2蛋白水平進(jìn)行SPSSPearson相關(guān)性分析，實驗組腎臟組織中IQGAP1與p-ERK1/2、ERK1/2蛋白陽性率呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，說明IQGAP1能直接參與糖尿病腎病的發(fā)展，且與p-ERK1/2、ERK1/2蛋白呈正相關(guān)性。因此，臨床上糖尿病診療時可加強患者IQGAP1水平測定，根據(jù)測定結(jié)果幫助患者診斷；對于確診的糖尿病腎病患者應(yīng)加強血糖控制，采取有效的方法改善患者腎臟功能。

綜上所述，IQGAP1在糖尿病腎病患者中呈低表達(dá)，且表達(dá)水平與p-ERK1/2、ERK1/2存在負(fù)相關(guān)性，可能由于p-ERK1/2、ERK1/2能引起足細(xì)胞凋亡，從而引起大量蛋白尿，導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生，但是其具體機制需要進(jìn)一步研究與探討。