鄧秘 龍霖梓 譚令 黃明艷 曲華 付長庚
活血解毒中藥配伍由赤芍、川芎、黃連三味中藥組成,該配伍在臨床上廣泛用于改善冠心病的臨床癥狀及預后[1]。課題組前期通過實驗證明活血解毒中藥配伍可通過抑制炎癥反應、增強超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性等途徑改善大鼠心功能[2-4],但對急性心肌梗死后冠脈無復流的研究尚未涉足。故本研究采用缺血再灌注方法制備大鼠冠脈無復流模型,觀察活血解毒中藥配伍通過調控心肌細胞過度自噬,減輕無復流心肌損傷的作用機制,以期為其臨床應用提供實驗依據(jù)。
健康Wistar大鼠,雄性,SPF級,體質量200~220 g(購自常州卡文斯,動物許可證號碼:SCXK(蘇)2016-0010),共96只,飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院SPF級動物房,白夜交替時間為12小時,標準飼料喂養(yǎng),自由取食及飲水。
活血解毒中藥組成為川芎10 g、赤芍10 g、黃連10 g,由江陰天江藥業(yè)有限公司制備成顆粒,然后以生理鹽水配制,高壓滅菌后于-20 ℃條件下貯存;阿司匹林腸溶片(沈陽奧吉娜藥業(yè)有限公司提供,批號:151001,規(guī)格:100 mg/片)。
氯化硝基四氮唑藍(國藥集團,298-83-9)、硫黃素S(源葉生物,1326-12-1)、透射電子顯微鏡(JEOL,JEM1230)、激光共聚焦顯微鏡(Nikon,C2)、全自動生化分析儀(OL YMPUS,AU-400)、PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司,EDC-810)、水平電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司,JY300)、抗自噬效應蛋白Beclin-1抗體(abcam,ab62557)、抗B淋巴細胞瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl 2)抗體(abcam,ab196495)、抗微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)抗體(CST,12741)。
將96只大鼠隨機分為6組,包括假手術組(Sham組)、冠脈無復流模型組(I/R組)、活血解毒中藥低劑量組、活血解毒中藥中劑量組、活血解毒中藥高劑量組和陽性藥物對照組,每組16只。假手術組及冠脈無復流模型組給予等體積生理鹽水灌胃;活血解毒中藥低劑量組[270 mg/(kg·d)]、中劑量組[540 mg/(kg·d)]、高劑量組[1080 mg/(kg·d)]給予等體積活血解毒中藥灌胃;陽性藥物對照組給予阿司匹林30 mg/(kg·d)等體積灌胃,連續(xù)灌胃14天。
采用缺血再灌注方法制備冠脈無復流模型[5]。經(jīng)藥物灌胃干預14天后,按10 mL/kg的劑量腹腔注射3.5%水合氯醛進行大鼠麻醉,從左側第4、5肋間打開胸腔,快速取出心臟并于左心耳下2 mm將冠狀動脈左前降支鈍性分離,用0號手術線結扎,然后將心臟放回胸腔,以動脈夾夾閉切口,假手術動物只穿線不結扎。結扎4小時后剪斷硅膠管,實施再灌注8小時,建立大鼠冠脈無復流模型。
每組大鼠進行腹主動脈取血并分離血清,采用7020型全自動生化儀測定血清肌酸激酶同工酶-MB(creatine kinase-MB,CK-MB)和肌鈣蛋白 T(cardiac troponin T,cTnT)的含量。
再灌注結束后,每組隨機選擇8只大鼠并處死,取出心臟稱重后均勻地將心室部分切成等厚5片,置于0.2%硝基四氮唑藍(nitroblue tetrazolium, N-BT)染液中染色2~3分鐘;用掃描儀掃描心肌獲得掃描圖像,測量每片心肌雙側的梗死區(qū)(N-BT非染色區(qū),呈灰白色)和非梗死區(qū)(N-BT染色區(qū),呈藍黑色)面積,計算梗死區(qū)面積占全心面積的百分比。將剩下的8只大鼠,自股靜脈注射6% 硫磺素 S(1 mL/kg)后處死,迅速取出心臟,稱質量后均勻地將心室部分切成等厚5片,分別稱質量后將心臟切片置于薄層色譜儀的暗箱中,于 365 nm波長光源下,觀察熒光并用相機拍照,用多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)測量每片心肌雙側的無復流區(qū)(硫磺素不著色,呈暗黑色)和復流區(qū)(硫磺素著色,呈明亮的藍綠色),計算無復流區(qū)占全心面積的百分比。
取大鼠無復流心肌組織,用Trizol法提取細胞總RNA并定量。采用ABI7500 Fast PCR儀進行PCR擴增,具體反應體系:cDNA模板 1.0 μL、2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 μL、上游引物0.8 μL、下游引物 0.8 μL、50×Rox Dye Ⅱ 0.4 μL、DEPC水7.0 μL,混勻。擴增條件為 95℃預變性30秒,95℃變性3秒,60℃退火15秒,循環(huán)40次。β-actin作為內參對照,上機進行擴增,實驗結束后分析整理數(shù)據(jù)。引用序列具體見表1。
取出大鼠無復流心肌組織,加入PMSF單去污劑裂解液進行勻漿,4 ℃,12000 rpm離心5分鐘,取上清分裝。BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量后,加入上樣蛋白緩沖液100℃沸水浴10分鐘。蛋白變性后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜;用含5%脫脂奶粉的TBS-T(Tris-HCl 20 mM,NaCl 137 mM,0.1% Tween-20)封閉2小時;加入LC3、Beclin-1、Bcl 2一抗(稀釋倍數(shù)1∶1000),在 4℃震蕩過夜。用TBS-T洗滌后,加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(稀釋倍數(shù)1∶2500)孵育、洗滌后,加入ECL 發(fā)光液,用凝膠成像系統(tǒng)掃描并進行數(shù)據(jù)分析。
與假手術組比較,冠脈無復流模型組大鼠血清CK-MB及cTnT顯著升高(P<0.01),提示模型制備成功;相較于冠脈無復流模型組,活血解毒中藥低、中、高劑量組大鼠經(jīng)過缺血再灌注后血清CK-MB和cTnT均降低(P<0.01),且以中劑量組效果最佳,表明活血解毒中藥能減輕無復流導致的心肌損傷。見表2。
相較于假手術組,冠脈無復流模型組及藥物處理組大鼠心肌梗死面積及無復流區(qū)域面積均顯著增加(P<0.01);與冠脈無復流模型組大鼠相比較,活血解毒中藥不同劑量組大鼠心肌梗死面積和無復流區(qū)域面積均顯著減少(P<0.01),且中藥中高劑量組較低劑量組更為顯著(P<0.01),表明活血解毒中藥能有效減少大鼠缺血再灌注損傷所導致的心肌梗死面積和冠脈無復流區(qū)域面積。見表3。
表1 引物序列如下表所示
表2 各組大鼠血清CK-MB、cTnT水平比較
表3 各組大鼠心肌梗死面積及心肌 無復流區(qū)面積比較
與冠脈無復流模型組大鼠相比較,活血解毒中藥不同劑量組大鼠經(jīng)過缺血再灌注后心肌自噬相關基因Beclin-1、LC3II/I表達降低,Bcl 2表達增加(P<0.01),并且以中高劑量組抑制心肌細胞自噬效果最佳,表明活血解毒中藥能夠調控心肌細胞自噬相關基因的表達,對無復流區(qū)域心肌細胞的過度自噬起抑制作用。見表4。
表4 各組大鼠心肌無復流區(qū)域Beclin-1、 LC3II/I及Bcl 2基因表達的比較
與冠脈無復流模型組大鼠相比較,活血解毒中藥低、中、高劑量組大鼠自噬正相關蛋白Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ表達降低(P<0.01),自噬負相關蛋白Bcl 2表達顯著升高(P<0.01),表明活血解毒中藥可抑制大鼠無復流區(qū)域心肌細胞的過度自噬。見圖1。
注:①假手術組;②冠脈無復流模型組;③中藥低劑量組;④中藥中劑量組;⑤中藥高劑量組;⑥阿司匹林組。
冠狀動脈無復流(coronary artery no-reflow, CNR)是指經(jīng)皮冠狀動脈介入(percutaneous coronary intervention, PCI)治療后,相關罪犯血管實現(xiàn)再通,但心肌組織仍存在無灌注或灌注不良的現(xiàn)象[6]。無復流現(xiàn)象在擇期PCI術后的發(fā)生率約為 1%~5%,急診PCI中的發(fā)生率可高達25%~40%[7]。Nair等[8-9]研究發(fā)現(xiàn),相較于PCI術后血流正常組,無復流患者嚴重心律失常、心力衰竭和住院死亡率的發(fā)生率均顯著升高,嚴重降低了患者的臨床獲益。因此,如何有效預防冠脈無復流的發(fā)生是當前臨床面臨的難題。新近研究表明冠脈無復流現(xiàn)象與心肌細胞的自噬與凋亡、炎癥反應、氧化應激、心臟微循環(huán)障礙等因素相關[10-11]。Mehrdad等[12-13]發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死實現(xiàn)血管再通后會導致心肌細胞過度自噬,從而加重心肌損傷,而抑制心肌自噬活性則會減輕缺血再灌注損傷,達到保護心肌組織的目的[14-15]。因此,通過調控心肌細胞自噬防治冠脈無復流可能是減輕冠心病介入治療圍手術期心肌損傷的治療方法之一[16-17]。
自噬相關基因(Atg)調控自噬,其中Atg8(LC3)和Atg6(beclin-1)是調控自噬的重要基因。Beclin-1能與Vps34結合參與自噬體的形成和成熟,是正向調控自噬的重要因子。LC3有LC3Ⅰ和LC3Ⅱ兩個亞型,當自噬激活時,水溶性LC3Ⅰ轉化為自噬囊泡相關型LC3Ⅱ,參與后期自噬體的合成[18-19]。因此,測定LC3Ⅱ/Ⅰ的比值能代表自噬的變化,當LC3Ⅱ/Ⅰ升高時表示自噬活性增強,反之則表示自噬受到抑制。此外,由于自噬和凋亡之間存在相同的信號通路,凋亡相關蛋白Bcl 2通過負向調節(jié)Beclin-1,從而抑制自噬活性[20]。在本研究中,課題組發(fā)現(xiàn)相較于冠脈無復流模型組,經(jīng)活血解毒中藥預處理后自噬正相關基因Beclin-1、LC3Ⅱ表達降低,自噬負調節(jié)基因Bcl 2表達升高,與崔建坤等[21]通過制備大鼠心肌缺血再灌注模型,探討去甲氧姜黃素對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用結果一致。
冠狀動脈無復流導致的心肌損傷,根據(jù)其病機特點應歸屬于傳統(tǒng)醫(yī)學“胸痹”“心痛”的范疇。本研究中活血解毒中藥配伍源于國家中醫(yī)心血管病臨床醫(yī)學研究中心治療冠心病的經(jīng)驗效方——愈梗通瘀湯。赤芍、川芎、黃連三味中藥配伍高度契合冠心病“毒瘀搏結、痹阻心脈”的病機。黃連最早記錄于《神農本草經(jīng)》中,有清熱燥濕、瀉火解毒的作用。現(xiàn)代藥理學研究提示,黃連素能通過抑制血栓素、前列環(huán)素的合成等途徑抗血小板聚集[22]。川芎具有活血行氣、祛風止痛的功效?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪、藁本內酯等有效成分,具有抗血栓形成及抗血小板聚集的作用[23]。赤芍有清熱涼血、散瘀止痛的功效?,F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)赤芍總苷具有抗凝血及抗血栓作用[24]。因此,上述三味活血解毒中藥配伍可通過多途徑、多靶點改善缺血性心肌損傷,達到保護心功能的目的。
綜上,課題組認為活血解毒中藥配伍能降低冠脈無復流損傷大鼠血清 CK-MB、cTnT水平,減少心肌無復流面積,其機制與抑制大鼠心肌細胞過度自噬相關。